分子 生物学技术表达或者多肽化学合成。本文件在其他地方还论述了用于重组表达的方法。
[0087] B.单链抗体
[0088] 单链可变片段（scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区通过短（通常为丝氨 酸、甘氨酸）接头连接在一起的融合。尽管移除了恒定区并引入了接头肽，但是该嵌合分子 保留了原始免疫球蛋白的特异性。右边的图像示出了该修饰通常如何保留特异性不改变。 历史上产生这些分子以有助于非常便于将抗原结合结构域表达为单一肽的噬菌体展示。或 者，可由来源于杂交瘤的亚克隆重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺少完整抗体分 子中存在的恒定Fc区，并因此缺少用于纯化抗体的常用结合位点（例如，蛋白A/G)。因为 蛋白L与k轻链可变区相互作用，所以这些片段常常可使用蛋白L进行纯化/固定化。 [0089]柔性接头一般由螺旋促进氨基酸残基和转角氨基酸残基（例如丙氨酸、丝氨酸和 甘氨酸）构成。然而，其他残基也可起作用。Tang等（1996)使用噬菌体展示作为用于从蛋 白质接头文库中快速选择用于单链抗体（scFv)的定制接头的手段。构建随机的接头文库， 其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组合物之18个氨基酸多肽的区段连接。 使scFv库（repertoire)(约5X106个不同成员）在丝状噬菌体上展示并经受半抗原的亲 和力筛选。所选变体的群表现出结合活性的显著增加但是保留了相当大的序列多样性。筛 选1054个个体变体随后产生了以可溶形式有效产生的催化活性scFv。序列分析揭示了接 头中的保守脯氨酸，VHC端后的两个残基以及其他位置处的精氨酸和脯氨酸的丰度，作为 所选范围的唯一共同特征。
[0090] 本发明的重组抗体还可包含允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列 包括来源于IgA的那些序列，其允许形成与J链结合的多聚体。另一种多聚化结构域是Gal4 二聚化结构域。在另一些实施方案中，链可用物质（例如生物素/抗生物素蛋白（avidin)) 进行修饰，这允许两种抗体组合。
[0091] 在一个不同的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链 来产生单链抗体。一般来说，在不同细胞中产生轻链和重链，纯化，随后以适当方式（即，重 链的N端与轻链的C端通过合适的化学桥连接）连接在一起。
[0092] 使用交联试剂以形成捆绑两种不同分子之官能团的分子桥，例如稳定剂和凝结 齐U。然而，预期可产生同一类似物或由不同类似物构成的杂聚复合体的二聚体或多聚体。为 了以逐步的方式连接两种不同化合物，可使用异双功能交联剂消除不需要的均聚物形成。 表3说明了几种交联剂。
[0093] 表3-异双功能交联剂
[0094]
【主权项】
1. 分离并纯化的抗体，其当被HLA-A2受体结合时与化犯LNVTV(SEQ ID N0;45)结合， 所述抗体具有包含SEQ ID NO ;3、4和5的重链CDR W及包含SEQ ID NO ;8、9和10的轻链 CDR。
2. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是小鼠抗体。
3. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体或双特异性抗体。
4. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与非抗体肤或多肤区段融合。
5. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与诊断试剂连接。
6. 根据权利要求5所述的抗体，其中所述诊断试剂是英光团、发色团、染料、放射性同 位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
7. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与治疗试剂连接。
8. 根据权利要求7所述的抗体，其中所述治疗试剂是细胞因子、化学治疗剂、放射治疗 齐U、激素、抗体化片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。
9. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
10. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述人源化抗体具有SEQ ID NO ;38和36或者 SEQ ID NO ;40和36 W及SEQ ID NO ;40和42的轻链/重链序列。
11. 核酸，其编码由SEQ ID NO ;8、9和10编码的轻链CDR。
12. 根据权利要求11所述的核酸，其中所述核酸编码SEQ ID NO ;7或SEQ ID NO ;12。
13. 根据权利要求11所述的核酸，其中所述核酸编码SEQ ID NO ;23或SEQ ID NO ;25。
14. 根据权利要求11所述的核酸，其还包含位于编码所述轻链CDR之所述核酸5'的启 动子序列。
15. 根据权利要求14所述的核酸，其中所述启动子在真核细胞中具有活性。
16. 根据权利要求14所述的核酸，其中所述启动子在原核细胞中具有活性。
17. 根据权利要求11所述的核酸，其中所述核酸位于可复制载体中。
18. 根据权利要求17所述的核酸，其中所述可复制载体是非病毒载体。
19. 根据权利要求17所述的核酸，其中所述可复制载体是病毒载体。
20. 根据权利要求11所述的核酸，其还包含接头编码区段，其中所述接头编码区段位 于所述CDR编码区段之间。
21. 根据权利要求20所述的核酸，其中所述接头编码区段中的一个或更多个编码螺 旋-转角-螺旋基序。
22. 人工抗体，其包含重链编码区段和轻链编码区段，所述重链编码区段包含含有SEQ ID N0;3、4和5序列的CDR;所述轻链编码区段包含含有SEQ ID N0;8、9和10序列的CDR。
23. 根据权利要求22所述的人工抗体，其中所述CDR通过合成接头连接。
24. 根据权利要求22所述的人工抗体，其中所述重链与非抗体肤或多肤区段融合。
25. 根据权利要求22所述的人工抗体，其中所述抗体与诊断试剂连接。
26. 根据权利要求25所述的人工抗体，其中所述诊断试剂是英光团、发色团、染料、放 射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
27. 根据权利要求22所述的人工抗体，其中所述抗体与治疗试剂连接。
28. 根据权利要求27所述的人工抗体，其中所述治疗试剂是细胞因子、毒素、化学治疗 齐U、放射治疗剂、激素、抗体化片段、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3、化R激动剂、含CpG 的分子或免疫共刺激分子。
29. 根据权利要求22所述的人工抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO ;7、SEQ ID NO: 12、SEQ ID N0;23 或 SEQ ID N0;25,和 / 或所述重链包含 SEQ ID N0;36 或 SEQ ID N0;42。
30. -种制备抗体的方法，其包括；（a)将（i)编码包含SEQ ID NO ;3、4和5所示CDR 之重链的核酸序列及（ii)编码包含SEQ ID NO ;8、9和10所示CDR之轻链的核酸序列引入 宿主细胞中；W及化）在支持所述轻链和所述重链表达的条件下培养所述宿主细胞。
31. 根据权利要求30所述的方法，其还包括分离所述抗体。
32. 根据权利要求31所述的方法，其还包括使所述抗体与诊断剂或治疗剂连接的步 骤。
33. -种在怀疑含有异常细胞的样品中检测异常细胞的方法，其包括使所述样品与权 利要求1所述的抗体或权利要求22所述的人工抗体相接触。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体或人工抗体与诊断剂缀合。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述诊断剂是英光团、发色团、染料、放射性同 位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
36. 根据权利要求33所述的方法，其中使用第二结合剂检测所述抗体或人工抗体。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述第二结合剂是抗化受体抗体。
38. 根据权利要求33所述的方法，其中所述样品是（a)来自头颈部、脑、食管、乳腺、 肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、直肠、卵巢、子宫、宫颈、前列腺、睾丸或皮肤组织的肿瘤组织，或 者化）流体例如血液、淋己、尿、骨髓抽吸液或乳头抽吸液。
39. 根据权利要求33所述的方法，其中所述样品来自于经切除的肿瘤床。
40. 根据权利要求33所述的方法，其还包括基于检测的存在、不存在或程度作出治疗 决定。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述治疗决定包括用基于PR-1的肤疫苗治疗所 述对象。
42. 根据权利要求33所述的方法，其中检测原发性癌细胞、转移癌细胞或骨髓发育异 常细胞。
43. -种治疗患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施用权利要求1所述的抗体 或权利要求22所述的人工抗体。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述抗体或人工抗体与治疗剂缀合。
45. 根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中所述实体瘤是头颈部肿瘤、脑肿瘤、食管肿瘤、 乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、脾肿瘤和胃肿瘤、小肠肿瘤、大肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子 宫肿瘤、宫颈肿瘤、前列腺肿瘤、睾丸肿瘤或皮肤肿瘤。
47. 根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是血癌。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述血液肿瘤是白血病或淋己瘤。
49. 根据权利要求44所述的方法，其中所述治疗剂是细胞因子、毒素、化学治疗剂、放 射治疗剂、激素、抗体化片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。
50. 根据权利要求43所述的方法，其还包括向所述对象提供第二抗癌治疗。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述第二抗癌治疗为基因治疗、化学治疗、放射 治疗、激素治疗、毒素治疗或手术。
52. 根据权利要求43所述的方法，其中将所述抗体或人工抗体向所述对象施用多于一 次。
53. 根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症为复发癌或转移癌。
54. -种治疗患有自身免疫病的对象的方法，其包括向所述对象施用权利要求1所述 的抗体或权利要求22所述的人工抗体。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述自身免疫病是韦格纳肉芽肿病、丘-斯综合 征或系统性小血管炎。
56. 根据权利要求54所述的方法，其中所述抗体或人工抗体与治疗剂缀合。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂是毒素或调亡诱导剂。
58. 根据权利要求54所述的方法，其还包括向所述对象提供第二抗自身免疫治疗。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述第二抗自身免疫治疗为抗炎剂。
60. 根据权利要求54所述的方法，其中将所述抗体向所述对象施用多于一次。
61. -种诱导HLA-A2癌细胞之补体介导的细胞毒性的方法，其包括使所述癌细胞与权 利要求1所述的抗体或权利要求22所述的人工抗体相接触。
【专利摘要】本说明书描述了在癌细胞表面上HLA呈递的情况下识别HLA-A2限制肽PR-1的抗体的序列。还提供了这些抗体在诊断和治疗癌症以及免疫相关疾病中的用途。
【IPC分类】A61K39-395, A61K39-00
【公开号】CN104540522
【申请号】CN201380042522
【发明人】杰弗里·莫德雷蒙, 安娜·谢尔盖耶娃
【申请人】得克萨斯州大学系统董事会
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年7月3日
【公告号】CA2883056A1, EP2872174A2, US20150191546, WO2014011489A2, WO2014011489A3, WO2014011489A8