使Piml靶物去抑制的有效剂量将寡核苷酸或包含该寡核苷酸的组合物对靶 细胞群体或哺乳动物受试者施用。受试者可具有与一个或多个miR-15家族成员的表达相 关，由一个或多个miR-15家族成员的表达介导或由一个或多个miR-15家族成员的表达引 起的状况。例如，这类病状包括心脏肥大、心肌梗塞、心力衰竭（例如，充血性心力衰竭）、 缺血、缺血再灌注损伤、血管损伤、再狭窄、病理性心脏纤维化或与心脏移植相关的状况。因 此，本发明提供一种经修饰寡核苷酸和组合物用于治疗这些状况及用于制备用于这些治疗 的药物的用途。
[0025] 本发明的其他方面和实施例将自本发明的以下详细描述而显而易见。
【附图说明】
[0026] 图1.心肌细胞中miR-15家族成员的丰度。每个细胞中微小RNA的拷贝数通过实 时PCR分析测量，并相对于市售标准品（Ambion)标准化。
[0027] 图2.心脏组织中miR-15靶物。实时PCR分析表明，皮下递送25mg/kg抗 1^尺1513(]\1-10134)诱导小鼠中此1212,811^5,6111，和0(^24表达的稳固（1'〇13118〇变化。
[0028] 图3.抗miR15b(M-10134)治疗以剂量依赖性方式影响靶基因表达。实时 PCR分析表明小鼠中miR-15靶物，尤其Birc5,Grn，和Cdc2A的剂量依赖性去抑制 (de-repreesion)。M-10591为非革巴向性对照寡核苷酸。
[0029] 图4.通过实时PCR分析测量的针对miR-15靶物的miR-15抑制剂的效力。抑制 剂M-10670,M-11211，M-11213,M-11214,M-11215,M-11220,M-11221，和M-11222 看起来对 小鼠中miR-15靶基因发挥最强的作用。误差棒描述SEM。P值〈0.001的组以星号表示。
[0030] 图5.在体外使用实时PCR分析来定量抑制剂活性的TaqMan??微小RNA分析 (AppliedBiosystems)〇
[0031]图 6.图 6A显示通过针对miR-15a，miR-15b，miR-16,和miR-195 的两步实时PCR 分析测量的miR-15抑制剂功效。图6B为概述每一种miR-15抑制剂的功效的图表。
[0032] 图7.体外使用双萤光素酶分析定量抑制剂活性的pSiCHECK?-2构建体 (Promega)〇
[0033] 图8.图8A显示通过针对miR-15a,miR-15b,miR-16,和miR-195的双萤光素酶分 析测量的miR-15抑制剂功效。图8B为概述每一种miR-15抑制剂的功效的图表。
[0034] 图9?一组miR-15抑制剂对靶基因去抑制的功效。图9A显示，3剂（每剂25mg/ kg)miR-15抑制剂的治疗方案诱导小鼠靶基因去抑制。具有指定p值的统计学显著组以星 号表示。图9B显示，3剂（每剂25mg/kg)的miR-15抑制剂的治疗方案比单剂方案（每剂 25mg/kg)更有效。
[0035] 图10.miR-15抑制剂使靶基因去抑制的动力学。图10显示递送单剂（25mg/kg) M-11215早在注射后24小时诱导小鼠miR-15靶物的有效沉默。
[0036] 图11.通过miR-15抑制剂的全局和特异性靶基因去抑制。图11显示，M-11214引 起靶基因去抑制，其对miR-15家族具有特异性（p-值：0. 01)。使用超几何分布函数来计算 富集的P值。
[0037] 图12. -组miR-15抑制剂对大鼠靶基因去抑制的功效。图12A显示，皮下注射单 剂miR-15抑制剂（25mg/kg)在治疗后四天诱导靶基因去抑制。在大鼠中，16聚体抑制剂 似乎比12聚体抑制剂更有效。图12B比较在治疗后第2天miR-15抑制剂对于大鼠中与对 于小鼠中靶基因的去抑制作用。左图的数据是产生于大鼠中，右图的数据是产生于小鼠中。 一般而言，miR-15抑制剂似乎在大鼠中比在小鼠中更具有有效的作用，但12聚体抑制剂除 夕卜，其在大鼠中似乎无效。
[0038] 图13.在大鼠应激模型中miR-15抑制剂对靶基因去抑制的功效。图13显示，单剂 miR-15抑制剂（25mg/kg)在大鼠缺血再灌注损伤模型中诱导祀基因去抑制（n= 4 ;相对于 基线P值< 〇. 05)。p值是使用AN0VA纽曼-柯伊尔事后检验（Newman-Keulsposttest) 计算。基线表示非梗塞对照组。IR/盐水表示盐水处理的对照组。M-10591为非靶向性对 照寡核苷酸。
[0039] 图14.大鼠应激模型中miR-15抑制剂对炎性标记物表达的功效。图14显示单剂 miR-15抑制剂（25mg/kg)在大鼠缺血再灌注损伤模型中对各种炎性标记物表达的影响（n =4)。基线表示非梗塞对照组。IR/盐水表示盐水处理的对照组。M-10591为非靶向性对 照寡核苷酸。
[0040] 图15.大鼠应激模型中miR-15抑制剂对心肌梗塞的功效。图15A和图15B显示 miR-15抑制剂在大鼠缺血再灌注损伤模型中对风险面积（areaofrisk)和心肌梗塞的尺 寸的影响（n= 10)。盐水表示盐水处理的对照组。M-10591为非靶向性对照寡核苷酸。
[0041] 图16.大鼠应激模型中miR-15抑制剂（M-11211和M-11214)对射血分数的功效。 图16显示miR-15抑制剂在大鼠缺血再灌注损伤模型中对射血分数的影响。AMC代表无损 伤的年龄匹配对照组。IR/盐水代表盐水处理的对照。
[0042] 发明详述
[0043]本发明提供能够抑制包含miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-195,miR-424,和 miR-497的miR-15家族miRNAs的表达（例如丰度）的化学修饰的寡核苷酸。本发明在一 些实施方案中提供了能以特异性方式抑制miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-195,miR-424, 和miR-497中每一者的表达或丰度的寡核苷酸。本发明进一步提供了包含寡核苷酸的药学 组合物，以及治疗患有相关或涉及miR-15家族miRNA的病状或病症诸如各种心血管状况的 患者的方法。在各个实施方案中，寡核苷酸在效力、递送效率、靶特异性、毒性和/或稳定性 中的一个或多个方面提供益处。
[0044] -方面，本发明提供能减少miR-15家族miRNAs的表达或丰度的寡核苷酸。寡核 苷酸的活性可以在体外和/或体内测定。例如，当在体外测定miR-15a,miR-15b,miR-16,mi R-195,miR-424,和miR-497活性的抑制时，活性可以使用本文中所描述的两步实时PCR分 析或双萤光素酶分析来测定。如在例如双萤光素酶分析中所测定，寡核苷酸在约75nM或更 低，或在其他实施方案中约50nM或更低，约40nM或更低，约20nM或更低，或约10nM或更低 的浓度下显著抑制该活性。例如，寡核苷酸可以具有约50nM或更低，约40nM或更低，约30nM 或更低，或约 20nM或更低的抑制miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-195,miR-424,和miR-497 活性的IC50值。
[0045]如市售的TaqMan?MicroRNA分析（Applied Biosystems)所不例，两步PCR分 析涉及定量PCR读出，其可通过寡核苷酸抑制剂以两个步骤来抑制：1)通过抑制逆转录酶 弓丨物在cDNA合成中延伸的能力；和2)通过抑制PCR引物扩增cDNA产物的能力。
[0046] 如市售的产品PsiCHECKTM(Promega)所示例，双萤光素酶分析涉及在可检测蛋白 (例如Renilla萤光素酶）基因的3'UTR中置放miR识别位点。构建体与靶miRNA共表达， 从而可通过信号的变化来测定抑制剂活性。编码可检测蛋白（例如萤火虫萤光素酶）的第 二基因可包括在同一质粒上并测定信号比作为抗miR活性的指示。
[0047] 或者，或此外，寡核苷酸的活性可以在如本文中所描述的适合的小鼠或大鼠模型 中测定，其中在约50mg/kg或更低，约25mg/kg或更低，诸如约10mg/kg或更低，或约5mg/kg 或更低的寡核苷酸剂量下观测对miR-15家族miRNA的抑制（例如，至少约50% )。在一些 实施方案中，在W02008/016924(以引用方式并入本文）所描述的动物模型中测定寡核苷酸 活性。例如，寡核苷酸可以在约50mg/kg或更低，约25mg/kg或更低，诸如约10mg/kg或更 低，或约5mg/kg或更低的剂量下展现至少约50 %的革EmiRNA抑制或祀去抑制。在这类实施 方案中，寡核苷酸可经静脉内或皮下向大鼠或小鼠给药，并且寡核苷酸在盐水中配制。
[0048] 在这些或其他实施方案中，本发明的寡核苷酸在给药之后是稳定的，在给药后至 少约三周、至少约四周、至少约五周或至少约六周或更长时间内在循环和/或靶器官中可 检测到。因此，本发明的寡核苷酸具有提供不太频繁的给药、较低剂量和/或较长治疗作用 持续时间的潜能。
[0049] 寡核苷酸包含核苷酸序列5' -GTGCTGCT-3'并且与人miR-15a、 miR-15b,miR-16,miR-195,miR-424,和miR-497的核苷酸序列实质上互补。寡核苷酸进 一步含有至少一个锁核苷酸。例如，寡核苷酸可含有至少8个或至少9个锁核苷酸。一般 而言，寡核苷酸的长度以及锁核苷酸的数目以及位置使得寡核苷酸在体外萤光素酶分析中 在约50nM或更低的寡核苷