一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的羧化石墨烯氧化物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于抗癌药物靶向传递技术领域，具体涉及一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的石墨烯氧化物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]目前癌症已成为威胁人类健康的头号杀手，其诊断与治疗方法引起了医学和生物界的广泛关注。治疗癌症的方法主要是采用化学药物治疗，但是化疗药物在遏制了肿瘤组织生长的同时，对周围正常组织会产生严重的毒副作用，给病患带来极大的痛苦。因此，医学界探索出一种定向给药的载体系统，克服了传统化学药物治疗对正常组织产生严重毒副作用，且对肿瘤靶向治疗效果不明显的缺点。其中，非共价药物载体具有良好的缓释效果、能够降低药物的毒副作用、不会破坏药物结构等优点，而成为靶向给药的优良载体。非共价药物载体包括脂质体、无机纳米粒子、囊泡以及碳纳米材料等。石墨稀氧化物一种碳纳米材料，由于其材料成本低、合成方便、与含共轭基团药物非共价作用力强、载药量大以及生物相容性好、低毒性等优点成为当前研宄的热门载体材料。
[0003]但是，石墨烯氧化物用于生物医药领域仍旧存在一定的细胞毒性，因此仍需对其进行生物相容性修饰以进一步降低潜在的细胞毒性。目前用于生物相容性修饰的材料有很多，无机化合物包括金、银、钯、铜、铂等金属纳米粒，氧化锌、四氧化三铁、二氧化锡、氧化钴、氧化锰、氧化铜等金属氧化物纳米粒，硅、介孔生物活性玻璃等非金属纳米粒子，有机化合物包括聚乳酸-羟基乙酸纳米微球、聚乳酸纳米微球、脂质体、明胶纳米球、微凝胶聚乙二醇胺、聚多巴胺、纤维素等有机高分子纳米粒。但是这些修饰手段存在以下问题:一是体内残留毒性太大，二是药物担载量低，三是载体本身具有一定的细胞毒性，四是载体药物对正常组织具有较大的毒副作用等。
【发明内容】
[0004]本发明需要解决的技术问题是，提供一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的石墨烯氧化物。
[0005]本发明还要解决的技术问题是，提供上述一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的石墨烯氧化物的制备方法。
[0006]本发明最后要解决的技术问题是，提供上述一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的石墨烯氧化物作为纳米药物载体的应用。
[0007]一种羟基磷灰石和叶酸共同修饰的羧化石墨烯氧化物的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0008](I)叶酸修饰羧化石墨烯氧化物的制备:
[0009](Ia)将羧化石墨烯氧化物溶解于水中，得到羧化石墨烯氧化物的水溶液；
[0010](Ib)向步骤(Ia)得到的羧化石墨烯氧化物水溶液中加入叶酸水溶液，其中，叶酸溶液与羧化石墨烯氧化物水溶液的比例为10?200:1，搅拌均匀，得到混合体系a ;
[0011](Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系a中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，得到混合体系b，再超声处理；
[0012](Id)向步骤(Ic)得到的混合体系b中加入N-羟基磺酰基琥珀酰亚胺钠盐，得到混合体系C，用浓盐酸调节混合体系c的pH为7.0?8.0，在室温下避光搅拌，得到叶酸修饰的羧化石墨烯氧化物粗品；
[0013](Ie)将步骤(Id)得到的叶酸修饰的羧化石墨烯氧化物粗品过滤，然后水洗，得到叶酸修饰的羧化石墨烯水溶液；
[0014](2)羟基磷灰石修饰叶酸修饰的羧化石墨烯氧化物的制备:
[0015](2a)将羟基磷灰石的纳米粒子溶解于磷酸缓冲液中，得到纳米羟基磷灰石的磷酸水溶液；
[0016](2b)将步骤(2a)得到的纳米羟基磷灰石的磷酸水溶液加入步骤(Ie)得到的叶酸修饰的石墨烯氧化物水溶液中，在30?37°C条件下保温，得到混合体系d ;
[0017](2c)将步骤(2b)中的混合体系d离心，收集沉淀，得到羟基磷灰石和叶酸共同修饰的羧化石墨烯氧化物。
[0018]其中，步骤(Ia)所述的羧化石墨烯氧化物的水溶液，其中羧化石墨烯氧化物的浓度为 0.1 ?1.0mg/ml。
[0019]其中，步骤(Ib)所述的叶酸水溶液为叶酸与钾离子的混合水溶液，其中其中叶酸终浓度为3?6mg/ml，优选为5.5?6.0mg/ml ;钾离子的终浓度为0.1?0.5mol/L，，优选为0.1-0.2mol/L ;钾离子来源于氢氧化钾、碳酸钾或者碳酸氢钾，优选为氢氧化钾。
[0020]其中，步骤(Ic)所述的混合体系b，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为2?5mg/ml ;步骤(Ic)所述超声，其超声条件为300?600W超声0.5?2小时。
[0021]其中，步骤(Id)所述的混合体系C，其N-羟基磺酰基琥珀酰亚胺钠盐的浓度为
0.5 ?1.5mg/ml，优选为 0.5 ?lmg/ml ο
[0022]其中，步骤(Ie)所述的叶酸修饰的羧化石墨烯氧化物水溶液，其中叶酸修饰的石墨稀氧化物的浓度为0.1?1.0mg/ml ；
[0023]其中，步骤(Ie)所述的过滤为用10?10KDa的滤膜过滤，优选为10_50KDa截留分子量滤膜。
[0024]其中，步骤(2a)所述的纳米轻基磷灰石的粒径为I?lOOnm，优选为30?80nm ；
[0025]其中，步骤(2a)所述的磷酸缓冲液离子浓度为0.01?0.2mol/l，，优选0.02mog/L，pH为5?8，优选7.2 ；
[0026]其中，步骤(2a)所述的纳米羟基磷灰石磷酸水溶液，其中纳米羟基磷灰石的浓度为 0.1 ?2mg/ml。
[0027]其中，步骤(2b)所述的保温，保温时间为I?3h。
[0028]其中，纳米羟基磷灰石的磷酸水溶液与叶酸修饰的羧化石墨烯氧化物水溶液的反应体积比为I?100:1。
[0029]上述方法制备得到的羟基磷灰石和叶酸共同修饰的羧化石墨烯氧化物也在本发明的保护范围之内。
[0030]上述轻基磷灰石和叶酸共同修饰的羧化石墨稀氧化物作为药物载体在制备抗癌纳米复合药物中的应用。
[0031]有益效果:
[0032]本发明与现有技术相比，具有以下优势:
[0033](I)利用叶酸和羟基磷灰石共同修饰石墨烯氧化物，不仅提高了石墨烯氧化物的生物相容性和水溶性，也提高了药物对肿瘤细胞的靶向性。
[0034](2)利用本发明提供的叶酸和羟基磷灰石共同修饰石墨烯氧化物作为药物载体，负载抗肿瘤药物紫杉醇，能明显降低毒副作用，增强药物水溶性，提高药物疗效。
[0035](3)本发明还具有制备过程简单、材料成本低等优点，在癌症定向治疗方法应用上有很大前景。
【附图说明】
[0036]图1石墨烯氧化物的原子力显微镜图。
[0037]图2石墨烯氧化物的透射电子显微镜图。
[0038]图3药物对卵巢癌细胞A2780的抑制效果图。
[0039]图4空白载体对正常细胞的抑制效果图。
[0040]图5叶酸和纳米羟基磷灰石共修饰载体药物对卵巢癌细胞A2780的抑制效果图。
【具体实施方式】
[0041]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0042]实施例1:石墨烯氧化物的制备。
[0043]石墨稀氧化物采用改善过的Hummer’s方法合成:首先称取1.0g石墨加250mL两颈圆底烧瓶中，再向其中加入23mL浓硫酸，以磁搅拌使二者充分混合；将此两颈圆底烧瓶移入冰水浴中继续搅拌，待混合液温度降到10°C以下后，采用少量多次的办法开始缓慢的向体系中加入固体高锰酸钾(3g)，通过控制加入速度使混合液的温度始终保持在20 °C以下，加入完毕后，继续于冰水浴中搅拌30min ;将反应体系升温到35°C再反应30min至2小时；向圆底烧瓶中加入46ml蒸馏水后反应体系温度迅速升高，将反应体系移入95°C油浴中反应温度恒温至95°C ;在加入蒸馏水并恒温30min后，再向体系中倾入140mL蒸馏水并加
2.5mL双氧水；将反应液过滤，收集固体物质，先以5%的盐酸溶液多次洗涤后，再以蒸馏水反复洗至溶液中性，最后以纯净水渗析一周，所得溶液自然干燥或冷冻干燥得到氧化石墨；将得到的石墨烯氧化物以磁搅拌分散于水中后，超声4小时或更长时间，得到石墨烯氧化物的水溶液。
[0044]实施例2:羧化石墨烯氧化物的制备。
[0045]将得到的石墨烯氧化物50mg置于50ml水中，在500?600W条件下超声2?3小时，得到纳米石墨烯氧化物的水悬浮液；向该纳米石墨烯氧化物的水悬浮液中加入氢氧化钾、碳酸钾或者碳酸氢钾1.2g、一氯乙酸钾浓度为1.0mg/ml的水溶液，在500W条件下超声3?4小时，得到羧化石墨烯氧化物粗产品；再将该粗产品反复漂洗过滤纯化得到纯净的羧化石墨烯氧化物。
[0046]实施例3:叶酸修饰羧化石墨稀氧化物。
[0047]取浓度为