磺酸盐的分子量=597. 5
[0258] P是根据参比标准品的A的C的宣称的含量
[0259] DF是稀释因子 [026…
[0261] 其中
[0262] Wtstdl是用于制备标准品1的CNS7056B参比物质的重量（mg)
[0263] MWtCNS7056 碱是 CNS7056 游离碱的分子量=439. 3
[0264] MWtCNS7056B 是 CNS7056 苯磺酸盐的分子量=597. 5
[0265] P是根据参比标准品的A的C的宣称的含量
[0266] DF是稀释因子
[0267] 为了测定相关物质，通过将保留时间与参比标准色谱图中CNS7056的保留时间进 行比较，鉴定CNS7056。根据下列公式将每种单个的所检测的相关物质的量计算为每次样品 注射的面积百分比：
[0268]
[0269] 其中，A =相关物质峰的屯^、
[0270] T =色谱图中所有峰的总面积
[0271] 2. 2. 3手性纯度
[0272] 通过HPLC，使用下列条件测定CNS 7056的手性纯度：
[0273]柱： Chiralpak 1C, 250x4. 6mm, 5 u m 粒径
[0274] 流动相： 磷酸盐缓冲液pH7. 0/水/乙腈10/40/50, v/v/v
[0275] 样品溶剂： 水/乙腈50/50, v/v
[0276]流速： 0? 7ml/min
[0277]柱温： 40 °C
[0278] 自动采样器：环境
[0279]检测： 250nm 的 UV
[0280] 注射体积： 10y1
[0281] 运行时间： 35分钟
[0282] CNS 7056S-对映体的保留时间约为21. 3min，且CNS 7056R-对映体的保留时间约 为17. 8min(RRT = 0. 84)。根据下列公式计算手性纯度：
[0283]
[0284]其中，A = R-CNS7056 峰凹 tK
[0285] T = CNS7056 和 R-CNS7056 峰的总面积
[0286] 2. 2. 4重构后小瓶中的溶液体积（Ph. Eur 2. 9. 17)
[0287]用5. 0ml注射用水（WFI)Ph. Eur.，使用配有适合的针头的5ml BD注射器重构单支 小瓶。当完全重构时，使用注射器和21号针头取出内容物并且将其转入标有刻度的10ml 量筒。
[0288] 2. 2. 5重构的外观
[0289] 记录重构后溶液的外观。
[0290] 2. 2. 6重构时间
[0291] 用5. 0ml注射用水（WFI)Ph. Eur.，使用5ml BD注射器和适合的针头重构2支小 瓶。当完全重构时，并且记录完全溶剂所需的时间。
[0292] 2. 2. 7pH 值
[0293] 在使用配有适合的针头的5ml BD注射器添加5. 0ml注射用水（WFI) Ph. Eur.后测 定2种重构溶液的pH。测定来自2支小瓶中每一支的1个等分试样的pH。
[0294] 2. 2. 8同渗质量摩尔浓度
[0295] 在使用配有适合的针头的5ml BD注射器添加5. 0ml注射用水（WFI) Ph. Eur.后测 定2种重构溶液的同渗质量摩尔浓度。根据涉及已知同渗质量摩尔浓度的溶液的冰点降 低，测定来自2支小瓶中每一支的1个等分试样的同渗质量摩尔浓度。为了这一目的，用冰 点降低渗透计测定100 U 1重构的CNS 7056溶液。
[0296] 2. 2. 9 含水量
[0297] 通过比色卡尔?费歇尔（Karl Fischer)滴定测定含水量。通过将CNS 7056冻干粉 末的小瓶的全部内容物溶于无水二甲基甲酰胺（DMF)中并且将已知体积的该溶液注入比 色卡尔?费歇尔仪器的阳极电解液中，测定小瓶CNS 7056药物产品的含水量。在卡尔?费 歇尔反应中，水与碘以1 :1之比反应。通过测定卡尔?费歇尔反应所需要的将碘离子氧化 成碘所需的电库仑数，确定水的量。库仑数用于计算以Ug滴定的水的量，其由仪器显示。
[0298] 使用下列设备和试剂：
[0299] 卡尔?费歇尔滴定仪：Mitsubishi CA-100
[0300]阳极电解液： Hydranal Coulomat AG
[0301]阴极电解液： Hydranal Coulomat CG
[0304]
[0302] 根据下列公式计算CNS7056冻干粉末的含水量：[0303]
[0305] ,、，.
[0306] Msample =添加到滴定容器中的样品溶液中水的量（yg)
[0307] Msolvent =添加到滴定容器中的溶剂空白中平的均水量（yg)
[0308] Wsolvent =添加到小瓶中的DMF的重量（g)
[0309] Dsolvent =溶剂的密度（g/ml)
[0310]对于 DMF d= 0? 944g/ml，来源 CRC 手册第 81 版
[0311] Vtitration =添加到滴定容器中的溶液的体积（ml)
[0312] Svial =计算的固体总量/小瓶，包括水（mg)
[0313] 2. 2. 10 通过 UV 进行 ID
[0314] 对单一小瓶一式两份进行分析。通过比较药物产品光谱与参比光谱确认通过UV 进行的鉴定。
[0315] 2. 2. 11 亚可见（Sub visible)颗粒物（EP 2. 9. 19)
[0316] 用适合的无菌注射器和针头，用5mL WFI重构10支小瓶。在无菌条件下将小瓶汇 集在一起并且根据欧洲药典2. 9. 19进行分析。
[0317] 2. 2. 12 亚可见颗粒物（EP 2. 9. 19)
[0318] 使用5mL WFI，用适合的无菌注射器和针头重构10支小瓶。在无菌条件下将小瓶 汇集在一起并且根据欧洲药典2. 9. 19进行分析。
[0319] 2. 2. 13细菌内毒素
[0320] 通过作为具有极限〈0. 5EU/mg的限度试验的鲎阿米巴样细胞溶解物（LAL)凝 胶-凝块法测定细菌内毒素。为了这一目的，使用具有宣称灵敏度等于0. 〇3EU/ml的LAL。 使用下列公式对内毒素定量：
[0321]
[0322]其中：
[0323] 溶解物灵敏度=0? 03EU/ml
[0324]样品浓度=5mg/ml
[0325] 2. 2. 14 无菌性
[0326] 通过各用5ml无菌胨（peptonate)水（0? 1 % )重构冻干的CNS 7056并且将样品 在30 - 35°C在100ml巯基乙酸培养基THG)中和在20 - 25°C在100ml胰酶大豆肉汤（TSB) 中温育，测定无菌性。将温育进行不少于14天。每2 - 3天目视检查培养基中微生物增殖 的存在。如果无微生物生长，则检查的样品满足试验要求（无菌）。
[0327] 2. 3 结果
[0328] 将在25°C /60%相对湿度（RH)或在40°C /75% RH(所谓的"加速稳定性"分析） 下贮存后上述批号的稳定性分析结果概述在图11 一 36中。
[0329] 2. 4 概述
[0330] 测试的CNS 7056的制剂显示极佳的长期稳定性，其已经支持了药物产品36个月 的贮存期限。
[0331] 3.贮存36个月后的稳定性数据
[0332] 将CNS 7056批号P02308进行稳定性研宄，其中将小瓶在25°C /60% RH下储存36 个月。
[0333] 对于批号组合物和冷冻干燥条件，参见2. 1章。对于分析方法描述，参见2. 2章。
[0334] 3. 1 结果
[0335] 将在25°C /60%相对湿度（RH)下贮存达到且包括36个月后的批号P02308的稳 定性分析结果概述在图27-30中。
[0336] 3. 2 概述
[0337] 在25°C /60% RH贮存后（T = 36个月）对批号P02308进行的所有测试均在规定 的接受标准内。在T = 36个月时所有样品的的冻干产品的外观、溶液的完整性、重构的时 间、pH和同渗质量摩尔浓度均完全在规格内。
[0338] 在25°C /60% RH时的CNS7056B小瓶含量为23. 4毫克/小瓶，其与所有前述结 果一致。这些结果完全在规格内。主要的CNS 7056水解产物CNS7054X(RRT 0.59)在 25°C /60 % RH下从最初数月时的0. 07 %增加至0. 29%。
[0339] 与初始时的0. 65%相比，在T = 36个月的时间点观察到总杂质结果为0. 80%。这 些结果与来自在40°C /75 % RH加速稳定性贮存条件下贮存12个月的支持性数据一起仅反 映出在这一有意义的时间期限内降解轻微增加，且表明CNS 7056与乳糖组合的稳定化效 果。
[0340] 在25°C /60 % RH下T = 36个月时的含水量为0. 68%，这表明从初始时的0. 27% 增加。认为这种增加归因于随时间推移发生的从塞子中水解吸。这些结果完全在规格内。
[0341] 3. 3 结论
[0342] 所有参数均在规格内且唯一值得注意的趋势在于水解产物CNS7054X和含水量的 预期增加。CNS 7054X的增加速率与此前生产/测试的注射用实验室非GMP开发批次的CNS 7056类似。
[0343] 4.通过拉曼作图评价CNS 7056的冻干乳糖制剂中的结晶物质
[0344] 4. 1 前言
[0345] XRH)研宄显示CNS 7056的冻干制剂是无定形的，但是，在极化光显微镜检查下检 查物质时，有在无定形基质中存在结晶物质的证据。为了揭示出该结晶物质是否归因于CNS 7056或一些其它成分，例如一水合乳糖，进行拉曼作图分析。该研宄利用共焦拉曼发散显 微镜使用拉曼作图研宄冻干乳糖制剂内CNS 7056的物理形式。在拉曼作图实验中，一旦从 焦点对准的样品表面完成第一个拉曼光谱采集，则按照预定步骤移动样品台（正常情况下 是几个到几十个微米）并且采集另一个光谱。持续该步骤值至覆盖了所选择的分析区域并 且构建了超光谱（hyperspectral)数据集。制备样品以确保其表面是平坦的，因为这避免 在从一个数据点到另一个数据点的数据采集过程中重调显微镜焦距的需求。然后处理超光 谱数据的三次幂以基于研宄中样品的每个成分的可区分的特定拉曼峰（指纹）生成化学图 像。由此生成的所述化学图像随后可以建立所选择的研宄样品区域内的每个成分的变化。 结晶（I型多晶型物）、无定形（冻干的）CNS 7056B和冻干的（无定形）乳糖以拉曼为特征， 且结晶CNS7056B的特征拉曼峰用于生成结晶CNS7056B的化学图像。乳糖的化学图像也基 于其自身的特征峰生成。对CNS 7056B的冻干制剂的一个区域作图以确定（如果存在）冻 干乳糖制剂的作图区域内结晶（I型）CNS 7056B的含量（基于未校准的面积比）和分布。 本研宄的目的在于建立乳糖制剂内的结晶物质是否归因于CNS 7056B或一些其它成分，例 如一水合乳糖。
[0346] 4. 2?材料和方法
[0347] 在拉曼作图研宄中测试了下列样品：
[0348] CNS7056B(I 塑）
[0349]项目 / 批号：S0L 12621/5
[0350] 外观：白色粉末
[0351] 药物的参考编号：PM0553/08
[0352]注射用 CNS 7056 (从 Paion 收到）
[0353]项目 / 批号：P02308
[0354] 外观：白色冻干粉末
[0355] 药物的参考编号：PM0554/08
[0356]冻干的CNS 7056 (无定形）
[0357]项目 / 批号：05/CNS/06
[0358] 外观：白色冻干粉末
[0359] 药物的参考编号：PM0555/08
[0360]冻干的乳糖（从Paion收到）
[0361]项目 / 批号：028/CNS/27
[0362] 外观：白色冻干粉末
[0363] 药物的参考编号：PM0548/08
[0364]所提供的材料的柃曼光谱
[0365] 使用共焦Nicolet Almega XR发散拉曼显微镜对所提供的结晶（I型）和无定形 (冻干的）CNS7056B和无定形乳糖（冻干的）进行拉曼光谱测定。相应地选择可区分的结 晶（I型）CNS7056B和无定形乳糖（冻干的）的拉曼峰用于生成化学图像并且建立在如下 所示的冻干制剂的检查区域内的每一变化形式。
[0366]伸用共隹发散柃曼显微镜的柃曼作图
[0367] 对冻干制剂的一个区域进行拉曼作图。对于每次测定，对一个区域（例如300x 300 ym2)进行拉曼作图。然后分别基于结晶CNS7056B和无定形乳糖（冻干的）的可区分 的拉曼峰产生化学图像。这些操作能够在所选择的样品区域内鉴定结晶CNS7056B (可能从 冻干的乳糖制剂中重结晶）和无定形乳糖（冻干的）。随后，由此产生的化学图像用于分别 表示结晶CNS7056B和乳糖（冻干的）在作图区域内的分布。
[0368] 拉曼技术
[0369] 柃曼光谱
[0370] 通过共焦Nicolet Almega XR发散拉曼显微镜，使用如下条件分析样品的拉曼光 谱：
[0371] 暴露时间：1.0s
[0372] 每一光谱的暴露时间：10
[0373] 针孔大小：100um
[0374] 光谱范围：完整（单一光栅）
[0375] 激光：在100%功率下的拖他63311111
[0376]目镜：50x/0. 75 (放大镜/数值孔径数）
[0377]此后，使用软件OMNICTM v7. 3,通过基线扣除（BS)，校正所测定的拉曼光谱。
[0378] 柃曼作图
[0379]用手轻轻地压每一样品，使得作图区域具有基本上平坦的表面。使用如下条件采 集用于作图的拉曼光谱数据：
[0380] 暴露时间：5. 0秒
[0381] 暴露时间：10
[0382] 针孔大小：100pm
[0383] 波长范围：1700~300cm-1 (多光栅）
[0384]激光：He Ne 633nm(100% 功率）
[0385]目镜：50x/0.75
[0386]面积：约 300x 300 ym
[0387] 扫描步长：10pm
[0388] 然后使用软件OMNICTM v7. 3,通过基线校正和归一化，修饰来自作图的所测定的 拉曼光谱数据。
[0389] 4. 3结果和讨论
[0390] 4. 3. 1冻干制剂中每种成分的拉曼光谱
[0391] 使用材料和方法中所述的方法采集结晶（I型多晶型物）和无定形（冻干的） CNS7056B和无定形乳糖（冻干的）的拉曼光谱。正如图39中所示，随后相应地选择拉曼 峰：结晶CNS7056B的约1620CHT 1和冻干的乳糖的约365CHT1。这些峰对于所述材料而言是 独特的，使得可以相应地生成结晶CNS7056B和乳糖（冻干的）的化学图像。冻干制剂中包 含的每种成分的拉曼光谱的完整范围如图40和41中所示。
[0392] 4. 4 概述
[0393] 所得到的数据显示在这种主要由无定形CNS7056B组成的冻干制剂中存在结晶 CNS7056B，此外，可以显示CNS7056B和赋形剂在这种冻干制剂中的均匀分布。
[0394] 在所测试的冻干产品中，约9%的数据点包含相当于结晶CNS7056B的信号。但是， 不能从这些结果中得出结论：在无定形乳糖基质中实际w/w(% )存在结晶CNS 7056B，因为 未进行校准。
[0395] II.冻干和喷雾干燥制剂的制备和稳定性评价分析
[0396] 制备具有相同配方的冻干和喷雾干燥的制剂并且测试稳定性。
[0397] 1?喷雾干燥的CNS7056B制剂（含有乳糖）的制备
[0398]将 CNS7056B(2 型，批号 10201126, 5. lg)和 Emprove -水合乳糖（139. 2g)溶于 750ml去离子（DI)水，同时加热至~50°C，然后过滤，冷却至室温。检查pH，不调整，因为其 为3. 1。使用如下参数喷雾干燥该溶液：入口温度150°C。泵速=10% (20ml，7mins)，风扇 设定=50%。收率59. 5g。通过卡尔?费歇尔测定含水量并且将其用于计算填充重量/小 瓶（997mg)。给58支小瓶填充997mg喷雾干燥的制剂。将30支小瓶放入带有轻微开放的 盖的真空烘箱。在50°C吹氮气下真空（~250psi)干燥这些小瓶24小时。然后用氮气冲 洗隔室，然后在氮气下快速封闭小瓶。这些样品称作12PM529-8-2。在未干燥的情况下封闭 28支小瓶。这些样品称作12PM529-8-1。用铝封闭物波状密封所有小瓶。
[0399] 2.喷雾干燥的API(CNS7056B)的按比例放大
[0400] 将CNS7056B(2型，批号10201126, 20g)溶于2900ml DI水。过滤该溶液，然后 使用如下参数将其喷雾干燥：入口温度130°C，出口温度82-79°C。泵速=10% (20ml， 7mins)，风扇设定=30%。收率未记录。使用溶于812ml DI水中的CNS7056B(2型，批号 10201126, 5. 6g)重复该过程，得到2. 2g总收率（来自两次试验）的白色粉末。样品称作 12PM529-9-1。
[0401] 3?冷冻干燥的（冻干的）API(CNS7056B)的制备
[0402]制备 CNS7056B 的水溶液（2. 2g 的批号 10201126,2 型，PM0232/12,230ml 水）。将 其放入圆底烧瓶（rbf)并在液氮中'壳体冷冻'，然后在5天内冻干。刮出得到的松散的白 色固体，打碎（~2g)。样品称作12PM529-10-1。
[0403] 4.对冻干和喷雾干燥的制剂和喷雾干燥的API的加速稳定性研宄
[0404] 将储存在螺纹状小瓶中的干燥（12PM529-8-2)和未干燥的（12PM529-8-1)喷雾干 燥的CNS7056B制剂与作为参比的冻干的CNS7056B制剂（CNS2501A)和喷雾干燥的无定形 API(12PM529-9-l) -起置于加速稳定性研宄中。将样品在40°C /75% RH下储存4和13周 以及在55°C下储存4周，并且分析外观、含量测定、相关物质、含水量、XRPD、重构时间和重 构后的外观。
[0405] 4. 1 ?结果
[0406] 将来自稳定性研宄的结果提供在图42 - 44中并且可以概述如下：
[0407] 喷雾干燥的制剂（在另外干燥前密封）在t = 0时具有稍高于冻干制剂CNS 2501A 即批号（~0. 73/0. 67%与0. 48% )的起始总杂质水平。这可能是由于涉及更高温度的制 备过程，且可以在按比例放大时优化。
[0408] 真空干燥的喷雾干燥制剂样品（12PM529-8-2)具有与所提供的冻干样品类似的 含水量（0. 24%与0. 34% )。未干燥的喷雾干燥的制剂样品（12PM529-8-1)具有显著更高 的含水量（2. 87% )，正如无定形喷雾干燥的API (CNS7056B，12PM529-9-1)那样。
[0409] '干的'喷雾干燥的制剂（12PM529-8-2)显示与冻干制剂类似的稳定性。在4周后 两种样品的总杂质都增加了~〇. 2%