然后单独用乙醇洗涤，并且最后高真空干燥。
[0028]衍生化程度通过改变所用试剂的量和变化反应时间来调节；衍生化程度可以通过现有技术已知的方法测量，例如HPLC。在本发明范围内，所用的酰胺化程度范围为0.1%至10%摩尔，优选1%至3%摩尔，在水解酰胺并且将释放的十六烷基胺与荧光物质连接后通过HPLC测量。
[0029]从由此获得的衍生物开始，水凝胶可以配制的浓度范围为0.1至30mg/mL，优选3至20mg/mL，并且甚至更优选5至15mg/mL。所用的载体优选是盐水溶液或磷酸盐缓冲液。
[0030]在优选的本发明的药物组合物中，透明质酸平均Mff范围为500，000至730，OOODa，摩尔酰胺化程度范围为1%至3%，并且透明质酸十六烷基酰胺浓度范围为5至15mg/mL。
[0031]获得的水凝胶在引入预填充一次性注射器后进行已知技术的灭菌处理，例如在高压灭菌器中。
[0032]不管浓度，获得的水凝胶易于挤出，具有确保它应用后留在原位的粘性，具有确保它吸收和再分散负荷的弹性，并且具有高度可水合性；它还保留起始聚合物透明质酸的生物学特性，因此是生物相容的、生物可吸收的，并且完全对机体无害，无论是它的未修饰状态还是酶降解后。
[0033]鉴于它的独特性质，水凝胶可以与认为能改善黑椎间盘的症状的生物学或药理学活性物质(例如留体或非留体抗炎药、细胞因子抑制剂和局部麻醉剂)组合。这些物质可以是在应用于患者前随即装入注射器中，从而水凝胶既用作治疗黑椎间盘又用作活性物质的载体。
[0034]下面列出了一些制备实施例，仅用于描述目的。
[0035]实施例1
[0036]重量平均分子量范围为500至730kDa并且摩尔酰胺化含量范围为I至3%的HA的十六烷基酰胺衍生物的制备
[0037]将2g预先衍生化成TBA盐的HA溶于200mL DMSO中，并且向产生的溶液中加入64 μ L甲磺酸；然后加入52mg 1，I’ -羰基二咪唑，并且在温和搅拌下室温反应I小时。然后加入544mg十六烷基胺，并且酰胺化反应是在42°C进行16-24小时。然后加入NaCl饱和溶液终止反应，并且15-30分钟后加入1.5倍体积的无水乙醇，通过沉淀分离衍生物。沉淀物用80:20乙醇/水洗涤数次，然后单独用乙醇洗涤数次，并且最后在高真空和40°C干燥。
[0038]获得1.2g十六烷基酰胺衍生物，HPLC测得的酰胺化程度为约2_3%摩尔。
[0039]实施例2
[0040]如实施例1中描述获得的浓度为8mg/mL的HA十六烷基酰胺衍生物的水凝胶的制备
[0041]将2g如实施例1中描述获得的HA十六烷基酰胺衍生物放入合适的容器中，并且加入250mL磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 6.9。缓冲液包含8.5mg/mL NaCl、0.45mg/mLNa2HPO4X 12H20 和 0.llmg/mL NaH2PO4X 2Η20。
[0042]将混合物在室温搅拌至少2小时，并且在60°C约I小时。之后，将T恢复至20-250C，并且将混合物搅拌2-4小时。将产生的包含8mg/mL透明质酸十六烷基酰胺的混合物分装到玻璃注射器中，然后在约121°C进行湿热灭菌循环(10分钟)。
[0043]实施例3
[0044]用HA十六烷基酰胺相对于臭氧治疗患有黑椎间盘疾病的患者:初步研究
[0045]NMR扫描用于其它诊断目的，确定11名在腰部(L3)患有黑椎间盘疾病的患者并且根据下列方案治疗。
[0046]材料和方法:
[0047].麻醉剂溶液(I %卡抱卡因)；
[0048].臭氧 27 γ ；
[0049].如实施例2描述制备的HA十六烷基酰胺水凝胶(8mg/mL)；
[0050].技术:在通过渗透皮肤麻醉后引导放射镜渗入；通过观察腰部区域两个垂直突出物确定穿刺部位；
[0051]患者分为两个组:
[0052]A) 6名患者用0.5cc水凝胶治疗；
[0053]B) 5名患者用3cc臭氧27 γ治疗(对照)。
[0054]治疗后患者休息数小时，并且如果需要除去基于对乙酰氨基酚的止痛治疗。所有患者进行残疾鉴定(RMDQ-Roland Morris Disability Quest1nnaire)和疼痛评估(VAS-Visual Analogue Scale)，并且6个月后，矢状面NMR扫描评价骨盆投射角的任何变化。
[0055]结果:
[0056]RMDQ:两组所有患者报告降低了运动性方面的残疾并且改善了生活质量，其具有可比较的程度。
[0057]VAS量表:所有患者再次报告疼痛显著减轻，并且对于臭氧治疗组，这结果是预期的，而对于用衍生的HA水凝胶治疗的A组，这结果当然是令人惊讶的；
[0058]X-射线评估:在A组的患者中，观察到椎间盘的正常化；在NMR扫描上其显示更白，因此发生了水合，并且与未治疗的健康椎间盘非常相似。A组的患者在骨盆投射角方面也出现显著的改善。
[0059]然而，在用臭氧治疗的B组的患者中没有观察到这些功能效果:不仅椎间盘的外观没有改善(正常化)，实际上在3个病例中还出现恶化，而且治疗对骨盆投射角没有效果。
[0060]结论:
[0061]尽管这仅是用少量患者进行的初步研究，但是显而易见的是用透明质酸十六烷基酰胺治疗不仅对患有黑椎间盘疾病的患者的症状而且对上述所有功能都具有令人惊讶的有利的效果。
[0062]本文给出的数据明确地证明用透明质酸十六烷基酰胺治疗不仅具有与臭氧治疗可比较的止痛效果，而且上述所有具有预料不到的疗效，其恢复了髓核的水合，并且矫正了所有患有黑椎间盘疾病的患者表现出的姿势缺陷。
【主权项】
1.药物组合物，其用于治疗“黑椎间盘疾病”，其包含透明质酸十六烷基酰胺水凝胶。2.权利要求1的药物组合物，其中透明质酸的平均分子量(Mff)范围为100，OOO至I,000，OOODa,优选 500，000 至 730，OOODa03.上述权利要求中一项或多项的药物组合物，其中透明质酸的摩尔酰胺化程度范围为0.1%至 10%，优选 1%至3%。4.上述权利要求中一项或多项的药物组合物，其中透明质酸十六烷基酰胺的浓度范围为0.1至30mg/mL，优选3至20mg/mL，并且甚至更优选5至15mg/mL。5.上述权利要求中一项或多项的药物组合物，其中透明质酸的平均分子量Mff范围为500，000至730，OOODa,并且摩尔酰胺化程度范围为I %至3%，并且透明质酸十六烷基酰胺的浓度范围为5至15mg/mL。6.上述权利要求中一项或多项的药物组合物，其包含药物或生物学活性物质。7.权利要求6的药物组合物，其中药物或生物学活性物质选自留体和非留体抗炎药、细胞因子抑制剂和局部麻醉剂。8.权利要求1至7中一项或多项的药物组合物，其用于治疗黑椎间盘疾病的疼痛。9.权利要求1至7中一项或多项的药物组合物，其用于矫正治疗与黑椎间盘疾病相关的骨盆投射角和姿势变化。
【专利摘要】本发明描述和要求了凝胶形式的药物组合物，其用于治疗椎间盘变性，特别是髓核的脱水和空洞化形式，称为“黑椎间盘疾病”。这些组合物包含透明质酸衍生物，其形成精确流变学特性的水凝胶，所述的特性使其成为填充髓核的理想物质。
【IPC分类】A61L27/52, A61L27/20
【公开号】CN105188785
【申请号】CN201480022838
【发明人】N·焦尔当, P·柏拉托
【申请人】菲迪亚制药股份公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年4月23日
【公告号】CA2910104A1, EP2988792A1, US20160067274, WO2014174450A1