来实现。
[0087]用于预防、抑制或治疗可通过细胞免疫反应、通过活性特异性细胞免疫疗法缓解 的疾病或病状的典型方案包括施用有效量的如上所述的疫苗组合物，作为单次治疗施用， 或作为增强或追加剂量来重复，历经最多并且包括一周至约二十四个月的时期。非限制性 实例包括第一剂，接着是在第一剂(第0天)之后约至少1〇、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23或24天的第二剂。免疫原性或疫苗组合物的剂量的量可^小于、等于或大于在 第0天施用的第一剂。
[008引根据本发明，疫苗或免疫原性组合物的"有效量"是足W达到所需生物效应(在运 种情况下是至少一种对一种或多种化V和/或NiV病毒株的细胞或体液免疫反应)的量。应了 解，有效剂量将取决于受试者的年龄、性别、健康状况和体重、同时进行的治疗的种类(有的 话）、治疗频率和所需效果的性质。下文提供的有效剂量的范围并不意图限制本发明，并且 代表了可适用于施用本发明的组合物的剂量范围的实例。然而，剂量可W适于个别受试者， 如可由本领域技术人员在没有不当实验的情况下了解和决定。
[0089] 本发明的疫苗和免疫原性组合物的接受者可为任何受试者，其可通过对HeV和/或 NiV的细胞或体液免疫反应来获取特异性免疫，其中所述细胞反应由MHC i类或ii类蛋白质 介导。在哺乳动物中，接受者可为灵长类动物级别的哺乳动物(包括人、黑猩猩、猿和猴）。在 本发明的一个实施方案中，提供一种用本发明的疫苗或免疫原性组合物治疗人的方法。受 试者可能感染HeV和/或NiV或提供如在实验研究中的HeV或NiV感染模型。在一些实施方案 中，受试者为驯化的哺乳动物，包括但不限于马、奶牛、牛、水牛、绵羊、猪(Mingyi(2010) Vet.Res.41,33)、山羊、狗（Biosecurity Ale;rt-胎 η 化a Virus Update,2011 年7月27 日， Press Release,Biosecurity如eensland)或猫。在一些实施方案中，受试者为家禽，包括 鸡。
[0090] 本发明的疫苗还在用于预防化η化a病毒感染的剂量下提供针对Nipah病毒感染的 交叉保护，因此还提供针对Nipah病毒的有效接种。
[0091] 对有效免疫反应的提及应理解成对直接或间接产生有利的防治或者治疗效果的 免疫反应的提及。在免疫原包含如本文所述的化V或NiV G糖蛋白的情况下，运种反应包括 在动物中减少或阻断病毒复制和/或病毒脱落和/或减轻病征。应了解，功效是功能度量并 且不由单独提及抗化V和/或抗MV抗体滴定度来定义，因为仅存在循环抗体未必表明所述 循环抗体阻断病毒复制和脱落的能力。
[0092] 又举例来说并且不加限制，如果正在施用本发明的可溶性G蛋白多肤W增强感染 或怀疑感染HeiKlra或Nip址的受试者的免疫反应，和/或如果正在W被动免疫疗法形式施用 本发明的抗体，那么组合物可进一步包含例如其它治疗剂(例如抗病毒剂）。
[0093] 下文实施例4提供了关于某些用于为马接种的优选组合物的信息。关于可能感染 化η化a病毒并因此要保证接种W保护动物与因此人都不受化11化日与Nip址病毒感染的其它 动物，W下信息通常适用并且可容易地由本领域技术人员进行调适。一般来讲，伴侣动物 (狗和猫)要保证约25微克化η化a抗原，并且可受益于在25-150微克范围内的ISC佐剂，5:1: 1比率的皂角巧、憐脂质和固醇为使用任一如本文所公开的组分物质时的优选ISC组合物。 对于伴侣动物，最终剂量优选为约1ml。化lygen?(MVP Technologies)，即一种基于共聚物 的佐剂也可W在优选约5-15% (v/v)下使用。
[0094] -般来讲，对于较大型农畜（绵羊、奶牛、猪等），在本文中另外为马提供的抗原和 佐剂给药(和最终给药体积)量为适用的，为50-250微克抗原，并且可W使用典型地约250微 克ISC，最终体积为例如l-3ml。关于猪，替代性并且有效的佐剂制剂包括(对于大约相同量 的抗原来说）W下的共混物:ISC与离子型多糖，具体地lOOmg DEAE葡聚糖与800微克ISC(最 终剂量体积l-3ml)(又是5:1:1如i 1 A:憐脂酷胆碱:胆固醇(参见W0 2000/41720))。
[00巧]接种动物的区分
[0096] 本发明还涵盖区分健康接种动物与暴露于或感染化V和/或NiV的动物的方法。在 病毒感染期间，HeV和MV表达除G糖蛋白（G) W外的其它蛋白质，包括融合蛋白（F)、基质蛋 白（M)、憐蛋白（P)、大型蛋白质化)和核衣壳蛋白（N)。运些其它蛋白质具有在动物中诱导免 疫反应结合于运些蛋白质的形式)或T细胞免疫性的潜力。对运些其它蛋白质的抗体反 应的水平通常可通过分析如酶联免疫分析化IA)来测量。本发明的免疫原性和疫苗制剂在 一些实施方案中仅含有作为化V和/或NiV抗原的G糖蛋白，因此将用抗体诱导仅对化V和/或 NiV的G糖蛋白的免疫反应。接种本文所述的免疫原性组合物的随后由HeV或NiV感染的动物 将产生对G糖蛋白的追加免疫反应，但是还将显示对一些除G糖蛋白W外的其它化V和NiV蛋 白的抗体呈现的变化。因此，融合蛋白（F)、基质蛋白（M)、憐蛋白（P)、大型蛋白质化)和核衣 壳蛋白（N)中的任一个的抗体的存在可在EIA中测量，W测定对血清样本中的运些蛋白质具 有特异性的抗体存在与否。如果检测到运些其它蛋白质（即除G糖蛋白W外）中的任一个的 抗体，那么动物已经暴露于化V和/或NiV。或者，如果没有发现运些其它蛋白质的抗体并且 仅检测到结合G蛋白的抗体，那么动物仅得到接种。
[0097] 本发明的EIA在检测和区分感染化V和/或NiV的动物与已经接种本文所述的免疫 原性组合物的健康动物方面具有高度特异性和高度选择性。本发明可W在同源和异源环境 中利用多种分析程序，包括化ISA。可W对样本如血液、血清、奶或含有抗体的任何其它体液 实施分析程序。
[0098] 在一些实施方案中，EIA中所用的抗体可W与由接种G糖蛋白诱导的抗体，而非在 动物中由感染化V和/或NiV诱导的抗体独特地竞争。运不仅允许血清学诊断化V和NiV感染， 而且在单一分析中将接种与感染区分开。可W对标准血清样本或含有抗体的任何体液或分 泌物进行EIA程序。EIA程序可W采用G糖蛋白和任何其它HeV和/或NiV病毒蛋白（例如融合 蛋白（F)、基质蛋白（M)、憐蛋白（P)、大型蛋白质化)和核衣壳蛋白（N)，因为运些蛋白质不存 在于还没有暴露于化V和/或MV的接过种的健康动物中）的单克隆和/或多克隆抗体。可W 在任何数目的有或无计算机辅助资料分析还原软件和硬件的商购获得的固定或便携式人 工、半自动化或机器人自动化化ISA设备中进行EIA。在一些实施方案中，可W对从驯化哺乳 动物(包括但不限于马、奶牛、绵羊、猪、山羊、狗或猫)分离的生物样本实施区分健康接种动 物与暴露于或感染HeV和/或NiV的动物的方法。在一些实施方案中，受试者为家禽，包括鸡。 在一些实施方案中，受试者是人。
[0099] 实施例
[0100] W下实例仅说明本发明的某些而非所有实施方案，因此不应被视为限制本发明的 范围。
[0101] 实施例1:载体构筑体
[0102] 构筑载体W表达跨膜/细胞质尾部缺失的化V G或NiV G。通过PCR扩增全长化V或 NiV G蛋白的克隆cDNA，W产生约2600个编码跨膜域/细胞质尾部缺失的化V或NiV G蛋白的 核巧酸的片段。
[0103] 合成W下低聚核巧酸引物W扩增Η e V G。s Η G S : 5 ' -GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3 ' （ SEQ ID NO : 5 ) 。 sHGAS : 5 ' -GTTTMACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTA TC-3'(沈Q ID N0:6)。
[0104] 合成W下低聚核巧酸引物W扩增N i V G。s N G S : 5 ' -CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3'(沈Q ID N0:7)。
[0105] sNGAS:5，-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATT GCTCTGGTATC-3,（沈Q ID NO: 8)。
[0106] 所有PCR反应都是使用Accupol DNApolymerase(PGS Scientifics公司）、用W下 设置进行的:起初94°C持续5分钟，然后94°C持续1分钟、56°C持续2分钟、72°C持续4分钟;25 个循环。运些引物产生侧接Sal 1位点的S胎V G 0RF和侧接趾0 1位点的sNiV G 0RF的PCR 产物。对PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen)。在凝胶纯化之后，将sHeV G和sNiV G亚克隆到 T0P0载体中（Invitrogen)。
[0107]购得？5日(31日肖2日（1醇;[化0肖6]1)并且改性成含有5肤标签或1]17(3抗原表位标签。合成 重叠低核巧酸，其编码S肤和消化的Κρη 1和EcoRl悬垂部分的序列。
[0108] SPEPS：5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGAT TCT-3'(SEQ ID NO:9)。SPEPAS:5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'(沈Q ID NO:10)。
[0109] 合成重叠低核巧酸，其编码myc抗原表位标签和消化的Κρη 1和EcoRl悬垂部分的 序列。
[0110] MTS：5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3'(SEQ ID NO:11)〇MTAS5'-AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3'(SEQ ID NO:12)。
[0111] 将64pmol S阳PS与64pmol S阳PAS混合并且加热至65°C持续5分钟，并且缓慢冷却 到50°C。将64pmol MTS与64pmol MTAS混合并且加热至65°C持续5分钟，并且缓慢冷却到50 °C。将两种混合物稀释并且克隆到Kpnl-EcoRl消化的pSecTag2B中W产生S肤改性的 pSecTag2B或myc抗原表位改性的pSec化g2B。所有构筑体起初都通过限制消化来筛选并且 通过测序来进一步验证。
[0112] 用纯化的Sal 1凝胶(Qiagen)消化T0P0 sG构筑体，并且框中亚克隆到S肤改性的 pSecTag2B或myc抗原表位改性的pSec化扣B的化0 1位点。所有构筑体起初都通过限制消化 来筛选并且通过测序来进一步验证。
[0113] 然后将IgK前导序列-S-肤-s(sGS-tag)并且IgK前导序列-myc标签-sHeVG (361117(3-*38)构筑体亚克隆到牛痘穿梭载体91(：02中。合成低核巧酸5695:5'-TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3'（SEQ ID NO: 13)并且与低核巧酸sHGAS组合使 用W通过PCR扩增sGS-tag和sGmyc-tag。所有PCR反应都是使用Accupol DNA polymerase(PGS Scientifics公司）、用W下设置进行的：起初94°C持续5分钟，然后94°C持续1分钟、56°C持 续2分钟、72°C持续4分钟;25个循环。运些引物产生侧接Sal 1位点的PCR产物。对PCR产物进 行凝胶纯化（〇1曰邑611)。在凝胶纯化之后，将365-*38和361117(3-*38亚克隆到1'0口0载体中 (Invi化ogen)。用Sal 1消化sG S-tag和sG myc-tag，并且亚克隆到PMC02的Sal 1位点。所有 构筑体起初都通过限制消化来筛选并且通过测序来进一步验证。随后产生密码子优化的核 巧酸序列W有助于描绘于SEQ ID NO: 16中的真核细胞系中的产生。
[0114] 为了使用化romos人造染色体表达(ACE)系统将化η化a sG蛋白表达于C册细胞中， 通过PCR使用Pfx聚合酶（Invitrogen)，根据制造商说明书来扩增编码化ndra sG蛋白的 DM。模板是pCDNA Hendra sG(没有S肤标签）。用于扩增DNA的低核巧酸引物为：5'-GATATCGCCACCATGGAAACCGACACCCTG-3'（沈Q ID N