Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及免疫原性和疫苗组合物，其包含来自化11化日病毒化eV)和/或Nipah病 毒(NiV)的G糖蛋白，并且设及与其相关的使用方法。本发明还设及包含适用于预防由NiV引 起的感染和疾病的来自HeV的G糖蛋白的组合物。
【背景技术】
[0002] NiV的导致大量人类灾祸的复发型发作最近已很成问题（参见例如Butler(2000) 化 1:ure 429,7;Gu;rley等，（2007化merging Infectious Diseases 13(7),1031-1037)。病 例研究已经将人的疾病与来自猪的动物传染病传播联系起来（参见例如Parashar等， (2000)J Infect Dis. 181，1755-1759)。还已知化V会导致人和动物的灾祸，并且在基因和 免疫学上与NiV紧密相关。Nipah病毒与化η化a病毒都是美国国家过敏症和传染病研究所生 物防御问题C类优先试剂，并且是USDA-APHIS Hi曲-Consequence Tier 3外来兽疫试剂，运 意谓关于对策储备要求，其在程序优先级方面得到极大考虑。
[0003] 目前有一种得到许可的用于预防由Hendra病毒引起的感染或疾病的疫苗（ Equivac?lleV;z〇etis);而不存在用于预防Nip址病毒感染的得到许可的疫苗。因为运些病 毒是动物传染病的4级生物安全试剂(BSL-4)，所W与安全问题关联的疫苗生产和/或诊断 具有极高成本并且是困难的。
[0004] 多个团队已经证明基于源自HeV(参见例如McEachern等，（2008)Vaccine 26 , 3842-3852;8〇33日的等，（2012)5(^ Transl Med.4(146) ,1-8)或源自化八参见例如Mungall 等，（2006)J Virol.80(24),12293-12302;Weingartl等，（2006)J Virol.80(16),7929-7938)的抗原的重组型G蛋白疫苗可提供针对感染的保护。然而，无一已成功商业化运些疫 苗中的任一种。因此，仍需要允许高产量生产的Nipah病毒或化iKlra病毒疫苗和诊断剂。
[0005] 副粘病毒如化V和NiV在病毒颗粒的包膜中具有两种主要的膜错定糖蛋白。将病毒 颗粒与宿主细胞上的受体连接所需的一种糖蛋白命名为血凝素-神经氨酸酶蛋白化N)或血 凝素蛋白化），并且另一个是糖蛋白（G)，其既不具有血细胞凝集活性也不具有神经氨酸酶 活性。连接糖蛋白是II型膜蛋白，其中分子的氨基(N)端向着细胞质定向并且蛋白质的簇基 (C)端是细胞外的。另一种主要糖蛋白是融合(F)糖蛋白，其为含有两个屯肤重复化R)区域 和疏水性融合肤的I类Ξ聚融合包膜糖蛋白。HeV和MV通过与抑值无关的进入受体宿主细 胞的膜融合过程、通过其连接G糖蛋白与F糖蛋白在受体结合之后的一致行动来感染细胞。 HeV和MV连接G糖蛋白的主要功能在于将适当受体接合在宿主细胞的表面上，对于大部分 充分表征的副粘病毒来说为唾液酸部分。HeV和NiV G糖蛋白利用宿主细胞蛋白受体肝配蛋 白B2和/或肝配蛋白B3,并且已经开发出阻断通过G糖蛋白实现的病毒连接的抗体 (W02006137931，Bishop(2008)J. Virol. 82:11398-11409)。此外，已经开发出还使用G 糖蛋 白作为产生针对化V和NiV感染的免疫保护反应的手段的G糖蛋白的疫苗(W02009117035)。 1(.8〇33日1'1:等〇〇111']1日1〇;1!'￥;[1'010邑7,第79卷，第6690-6702页，2005)和8.]\111]1邑日11等 (Journal of Virology,第80卷，第 12293-12302页，2006)合理地提出，Hemlra病毒G糖蛋白 可能交叉预防由Nip址引起的病毒感染。当然，待解决的问题是提供增强交互保护并且使其 高效并且在医学上和商业上实用的高效疫苗组合物。
[0006] HeV和/或NiV G糖蛋白与生物学上可接受的佐剂在疫苗中的组合代表了开发有效 HeV和MV疫苗中的进步，运是考虑到当运些组分组合施用时，有着免疫反应性增强与佐剂 副作用减小的潜力。
【发明内容】
[0007] 本发明涵盖一种免疫原性组合物，其包含化η化a和/或Nipah病毒G蛋白、佐剂和一 种或多种赋形剂，其量会在向受试者施用之后有效引发针对Hendra和/或Nipah病毒的中和 抗体的产生。
[000引在一些实施方案中，可溶性化rulra病毒G糖蛋白由原生化11化日G糖蛋白的氨基酸 73至604(569 10側:2)组成。在一些实施方案中，可溶性化11化曰病毒6糖蛋白由包含沈9 10 NO: 16的核巧酸64至1662的核巧酸序列编码。在一些实施方案中，可溶性化11化曰病毒G蛋白 W二聚体形式存在，其中每一可溶性化η化a病毒G糖蛋白二聚体亚单元由一个或多个二硫 键连接。在一些实施方案中，可溶性化11化曰病毒G蛋白W四聚体形式存在。在一些实施方案 中，四聚体形式W由一个或多个二硫键非共价键联和/或连接的二聚体的二聚体形式存在。 在一些实施方案中，可溶性化η化a病毒G蛋白的浓度可为在免疫原性组合物中约扣g/ml至 250μg/ml (也参见W02006/085979)。
[0009] 在一些实施方案中，佐剂可为水包油乳液。
[0010] 在一些实施方案中，佐剂可为SP-油。
[0011] 在一些实施方案中，佐剂可W包含皂角巧、固醇、季锭化合物、聚合物、糖脂和免疫 刺激性低核巧酸。
[0012] 在一些实施方案中，本发明还涵盖一种在受试者中产生针对化η化a和/或Nip址病 毒的中和抗体反应的方法，其包括W有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者 施用本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，中和抗体反应会减少Hendra和/或 Nipah病毒在受试者体内复制，并且还可W减少化11化曰和/或Nip址病毒在受试者体内脱落。 在一些实施方案中，受试者已经暴露于化η化a和/或Nip址病毒，而在其它实施方案中，受试 者正遭受化11化曰和/或Nip址病毒感染。在一些实施方案中，本发明涵盖一种在受试者中产 生针对Hen化a病毒的中和抗体反应的方法，其包括W有效产生中和抗体反应的量和持续时 间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，本发明涵盖一种在 受试者中产生针对Nipah病毒的中和抗体反应的方法，其包括W有效产生中和抗体反应的 量和持续时间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物。
[0013] 在一些实施方案中，肌肉内施用免疫原性组合物。在一些实施方案中，分多次剂量 施用免疫原性组合物，并且第二剂在第一剂之后至少约21天至约28天。在一些实施方案中， 每一剂含有约50yg、约l(K)yg或约25化g可溶性化η化a病毒G蛋白。
[0014] 本发明进一步涵盖一种区分接种有本文所述的免疫原性组合物的受试者与暴露 于化ndra和/或Nipah病毒的受试者的方法，其包括针对选自融合蛋白（F)、基质蛋白（M)、憐 蛋白（P)、大型蛋白质化)和核衣壳蛋白（N)的W下HeV和/或NiV病毒蛋白中的任意种中的至 少一种，检测从受试者分离的生物样本中抗体的存在。
[001引可向受试者如人、马、奶牛、绵羊、猪、山羊、鸡、狗或猫施用本发明的免疫原性组合 物和方法。
[0016] 本发明还涵盖一种在人受试者中产生针对化11化曰和/或Nip址病毒的中和抗体反 应的方法，其包括W有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用包含化ndra 病毒可溶性G糖蛋白的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐 剂。关于适用于实践本发明的化ndra病毒G糖蛋白多肤、其重组表达和配制到疫苗组合物 中，已公布的国际专利申请W0 2012/158643和W02006/085979的整个公开内容W引用的方 式并入本文中，如同完整地阐述一样。
【附图说明】
[0017] 图1描绘了 sG化V接种和NiV激发时程的示意图。sGHeV接种、NiV激发和安乐死的日 期由箭头指示。如所示(*)在激发后第-42、-7、0、3、5、7、10、14、21和28天收集血液和拭子样 品。灰色文本表示激发时间线(顶行）；黑色文本表示接种时间线(底行）。示出了在每一疫苗 剂量组中的受试者和一个对照受试者的非洲绿猴(AGM)数目。
[0018] 图2描绘了NiV感染受试者的存活率曲线。使用来自对照受试者(n = 2)和sG化V接 种受试者(n = 9)的数据W产生Kaplan-Meier存活率曲线。对照包括来自另一个历史对照受 试者的数据。接种受试者接受皮下施用的l〇yg、5化g或l(K)yg sG化V两次。在对照受试者中 到末级疾病的平均时间为11天，而所有接种受试者都存活到研究结束时安乐死为止。
[0019] 图3描绘了接种受试者中的MV和化V特异性免疫球蛋白（Ig)。从接种受试者收集 血清和鼻拭物，并且使用sG化V和sGNiV多工微球分析来评价IgGJgA和IgM反应。个别地分 析来自同一疫苗剂量组(n = 3)中的受试者的血清或拭抹物，并且计算微球中值巧光强度 (M.F.I)的平均值，将其示于Y轴上。误差条表示平均值的标准误差。血清sG特异性Ig示为黑 色（S細eV(空屯、Ξ角形）、sGNiV(实屯、Ξ角形）），并且粘膜sG特异性IgA示为灰色符号（sGHeV (空屯、Ξ角形）、sGNiW固体状Ξ角形））。
[0020] 序列表简述
[0021] SEQ ID N0:1提供原生化11化曰G糖蛋白和相应密码子的氨基酸序列。
[0022] 沈Q ID NO:2提供原生化11化曰G糖蛋白的氨基酸序列。
[0023] 569 10^:3提供原生化9曰}1〇糖蛋白和相应密码子的氨基酸序列。
[0024] 沈0 1〇^:4提供编码化9曰}1〇糖蛋白的氨基酸序列。
[002引 SEQ ID N0:5提供人造引物，参见实施例1。
[00%] 沈Q ID N0:6提供人造引物，参见实施例1。
[0027] SEQ ID N0:7提供人造引物，参见实施例1。
[0028] 沈Q ID N0:8提供人造引物，参见实施例1。
[0029] SEQ ID N0:9提供人造引物，参见实施例1。
[0030] SEQ ID NO: 10提供人造引物，参见实施例1。
[0031] 沈Q ID N0:11提供人造引物，参见实施例1。
[00创 SEQ ID NO: 12提供人造引物，参见实施例1。
[00削 SEQ ID NO: 13提供人造引物，参见实施例1。
[0034] SEQ ID NO: 14提供另一化rulra G蛋白可溶性片段氨基酸序列，和相应核巧酸序 列。
[00对 SEQ ID NO: 15提供具有Ig(K)前导序列的Hen化a G糖蛋白。
[0036] SEQ ID NO: 16提供编码可溶性化11化曰G糖蛋白的密码子优化的核巧酸序列。
[0037] 沈910備：17提供另一化11化日0蛋白序列。
[0038] 沈Q ID NO: 18提供人造引物，参见实施例1。
[0039] SEQ ID NO: 19提供人造引物，参见实施例1。
【具体实施方式】
[0040] 疫苗和免疫原性组合物
[0041] 本发明的疫苗和免疫原性组合物在已被施用所述组合物的受试者中诱导许多体 液和细胞免疫反应中的至少一种，或者有效增强至少一种针对HeV和/或Μ V病毒株中的至 少一种病毒株的免疫反应，W使所述施用适用于接种目的和/或通过一种或多种化V和/或 NiV病毒株来预防化V和/或NiV感染。本发明的组合物从化V和/或NiV和佐剂向有需要的受 试者递送G糖蛋白，包括可溶性G糖蛋白。在一些实施方案中，G糖蛋白的量包括但不限于5、 10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或25化邑/1111。对于猪，6糖蛋白抗原的推荐 量在每剂约扣g与l(K)yg之间，每剂优选为约0.5ML至约2.0ML。优选给予2剂，例如隔开2周与 3个月之间，保护性免疫的持续时间延长到一年或更长。按照本发明的实践，还可W对断奶 前后（即在约21天寿命之前或之后）的小猪接种。
[0042] A.HeV和