别适用。
[0039]发明的有益效果
[0040]本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物在EL-4细胞中抑制IL-4的表达，在动物模型 中能够抑制支气管内炎症细胞的扩散。另外，本发明的化合物在抑制CXCL-l，TNF_a以及 MIP-2的表达上具有非常好的效果，所以可以克服现阶段使用的慢性阻塞性肺病治疗剂的 副作用，作为无毒性且治疗效果卓越的化合物可以有益的使用为慢性阻塞性肺病的预防、 治疗及改善用组合物。
【具体实施方式】
[0041] 以下，在下述例中更加具体的说明本发明，但是下述例是为了帮助理解本发明，并 不是为了限定本发明。
[0042] 制备例1:制备标准烟提取物(Cigarette smoking;CS)
[0043] 制备例1_1:实验材料
[0044] 使用标准烟CM7(Coresta Monitering Cigarette 7，Heinr Borgwaldt，Germany) 60支以及异丙醇（isopropanol)、乙醇（Merck，Germany)、十七烧（n-heptadecane，Sigma-Aldrich, USA)，实验装备使用自动吸烟装置(Automatic smoking machine, ISO 3308 规格 品，模型：RM20，Heinr Borgwaldt)。
[0045] 制备例1-2:收集标准烟烟雾
[0046] 标准烟CM7(Coresta Monitering Cigarette 7，Heinr Borgwaldt,Germany)烟雾 凝结物的收集是根据IS03402规定在吸烟室(温度为22± 2°C，相对湿度为60±5% )进行，并 且根据IS03308的规定，使用RM20(Heinr Borgwaldt,Germany)自动吸烟装置（IS03308规格 品），以吸烟量为35.0±0.3 ntf,吸烟周期为60±0.5秒，吸烟时间为2.00±0.02秒，以及烟 蒂长度为烟嘴纸(tip paper)长度+3mm(overwrap+3mm)为止的以ISO标准吸烟方法燃烧香 烟，用92mm剑桥滤片（Cambridge f i Iter，IS03308规格品）收集香烟的烟雾凝结物 (IS03308,2000)〇
[0047] 制备例1-3:提取标准烟烟雾凝结物
[0048]收集香烟烟雾凝结物的剑桥过滤器（camberidge filter)在香烟用烟嘴 (cigaratte holder)中分离后分别放入丨00純三角烧瓶中，分别加上提取溶剂异丙醇 (isopropanol )5〇m€后再摇匀，在室温放置8小时以上后提取。提取后过滤并用减压过滤浓 缩机浓缩，将放在三个三角烧瓶内的浓缩液收集到闪烁管（scintillation vial)中使用氮 气进行完全浓缩。
[0049]制备例1-4:计算总颗粒物质(TPM)含量
[0050] 标准烟主流烟中TPM的含量用以下数学式1来计算。
[0051] [数学式1]
[0052]
[0053] TPM:总颗粒粉尘物质(mg/cig)，WFHA:吸烟后过滤器烟嘴(Filter Holder)的重量， [0054] WFHB:吸烟前过滤器烟嘴(Filter Holder)的重量，N:每Trap吸烟的支数(cig.)
[0055] 实施例1:EL_4细胞中单乙酰基二酰基甘油化合物的细胞毒性评价
[0056] 添加胎牛血清(Fetal Bovine Serum) 10%的RPMI培养基(Gibco)中，将小鼠 T淋巴 瘤细胞的EL-4细胞以5xl〇4cel Is/mi的浓度悬浮，每100成在96壁板上接种后培养12小时。 之后，用如下述表1所示的种类及浓度的单乙酰基二酰基甘油化合物(MADG)处理上述培养 液后，追加培养24小时的时间。如可数细胞数量的CCK-8(Dojindo公司）工具(Kits)上说明 的一样，添加 CCK-8溶液各10 _，反应最少30分钟最多4小时的时间后，测定波长570nm处的 吸光度(0D)。细胞生存率(cell viability)按下述数学式1计算，将其结果表示在下述表1 中。数学式1中阴性对照群显示将DMS0 0.2%处理的培养液。在下述表1所示，PLAG是指1_ palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol, P0AG是指 l-palmitoyl-2-〇leoyl-3-acety 1 glycero 1，PSAG是指 1-palmitoy 1-2-stearoyl-3-acetylglycerol，PPAG是指 1-palmi toy 1 _2_pa lmi toy 1 _3_ace ty 1 gl y cero 1，OPAG是指 1-oleoyl _2_pa lmi toy 1-3-acetylglycerol, OSAG是指 1-oleoy 1-2-stearoyl-3-acetylglycerol，LPAG是指 1-linoeoyl-2-palmitoyl-3_acetylglycerol，LSAG是指 1-1 inoeoy 1-2-stearoy 1_3_ acetylglycerol〇
[0057] [数学式1]
[0058]
[0059] 【表1】
[0060]
如上述表1所示，观察依据本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物(MADG)浓度的EL-4细 胞的细胞生存率的结果，确认了 EC-18在200yg/mL以下的浓度没有显示细胞毒性，而其他化 合物在20yg/mL以下的浓度下没有显示细胞毒性。
[0061] 实施例2:单乙酰基二酰基甘油化合物的EL-4mRNA表达抑制
[0062]以实施例1的结果为基础，将上述单乙酰基二酰基甘油化合物以20yg/mL的浓度给 药，测定了在EL-4细胞中的依据PMA的IL-4mRNA的表达抑制效果。具体的，由PMA(Ing/mL)诱 导的IL_4mRNA的表达量用实时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR,quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)来测定。细 胞准备是将EL-4细胞以lx 106cells/well的浓度分注在6壁板上培养12小时的时间后，将 单乙酰基二酰基甘油化合物以20yg/mL的浓度处理1小时的时间，将PMA以1 ng/ml的浓度处 理后，培养12小时。为了提取总RNA，使用Trizol B(invitr〇gen公司，美国）提取了核糖核酸 (RNA)，定量后，利用Omni script RT kit (Qiagen，GmbH, Hi lden，Germany)合成了互补核酸 (cDNA)。将合成的cDNA与模具和下述表2上的IL-4以及GAPDH引物分别混合，使用PCR mi x (PCR Master Mix，Bioneer，Korea)在94°C温度下用5分钟时间变性（Denaturation)，以在 95°C中30秒、在60°C中45秒、在72°C中45秒反应30周期（cycle)后，72°C中10分钟进行了使 酶惰性化的PCR。如上述测定的EL-4细胞的IL-4mRNA的表达抑制率在下述表3中表示如下。 下述表3中各样品名称如表1所述说明。
[0063] 【表2】
[0064]
[0065] 【表3】
[00661
[0067] 如上述表3中所示，处理PMA的群中IL-4的表达量增加了，以此为基准（100%)的时 候可以看出，单乙酰基二酰基甘油化合物显示了 20%至50%的表达抑制率。
[0068] 实施例3:阻塞性肺病模型以及样品给药
[0069] ⑶PD小鼠模型的制作如下。将8周龄BALB/c公鼠用7 %三氯乙醛水合物（ch 1 ora 1 hydrate)麻醉后，LPS100 jUg/mS和标准烟提取物（Cigarette smoking;CS)4' 观/故按 1:1混 合后的混合物(LPS+CS混合物)从鼻子吸入气管内（intratracheal ):100 每周共一次3周， 制成coro模型。即，轻微麻醉后不动的时候将小鼠的前牙用橡皮筋固定后往鼻子和嘴里分 别吸入LPS+CS混合物5:0淡量，共100泌量吸入到气管内（intratracheal)。按浓度类别 30mg/kg和60mg/kg的EC-18溶入到0 · 5 %CMC(carboxmethylcellulose sodium)中后，将PS+ CS混合物1Q0试吸入到气管内（intratracheal)的1小时之前口服给药。实验群分为（i)没有 进行任何处理的正常群（Intact)，（ii)处理LPS+CS的对照群（COPD-control)，（iii)处理 LPS+CS1小时前将EC-18 口服给药30mg/kg的实验群，（iv)处理LPS+CS混合物1小时前将EC-18 口服给药60mg/kg实验群。实验结束后将各群小鼠的血液、肺泡灌洗液以及肺组织予以分 开。
[0070] 实施例4:支气管肺泡灌洗液(BAL fluid;BALF)分泌及总细胞数测定
[0071] 血液采学后进行解剖，为了从肺泡灌洗液(BALF)分离细胞，将注入FBS-free/DMEM 培养液1!1^的注射器注射到支气管(trachea)后用线捆绑固定后，循环3次来分离将ACK溶液 在37 °C处理5分钟时间溶解红细胞，重新用FBS-free/DMEM培养液灌洗后用0.04 %台盼蓝 (trypan blue)染色后测定总细胞数，其结果如下述表4。
[0072] 【表4】 「00731
[0074]其结果如上述表4所示，对于慢性阻塞性肺病(