] (2)5-氧代-5-(((41S，7aS，13bR)-10-氧代十二氨細-二化晚并[2，l-f: 3'，2'，1'-。'][1，6]糞晚-12-基)氧基)戊酸巧12)的制备：
[0084] 20°C下在50毫升圆底烧瓶中加入120毫克TMl和1.2毫升四氨巧喃，此溫度揽拌下 再依次加入138毫克=乙胺和77毫克戊二酸酢，此溫度下揽拌反应24小时;将反应液浓缩后 进行柱层析分离(流动相为二氯甲烧/甲醇，体积比为20/1;固定相为100~200目硅胶），收 集目标馈分，并减压旋转蒸发除去溶剂得到125毫克淡黄色油状物TM2,收率73%。
[0085] (3)5-氧代-5-(((41S，7aS，13bR)-10-氧代十二氨-1H，5H，8H-二化晚并[2，l-f: 3'，2'，^-リ][l，6]糞晚-12-基)氧基)戊酸-N-?基下二酷亚胺醋(TM3)的合成：
[0086] 在50毫升的圆底烧瓶中加入1.25毫升四氨巧喃，20°C揽拌下依次加入125毫克 TM2、169毫克下二酷亚胺碳酸醋和137毫克碳酸钟，此溫度下揽拌18小时;反应液浓缩至干， 加入正己烧洗涂3次，每次1毫升，干燥得80毫克淡黄色油状物TM3，收率51 %。
[0087] (4)S-(5-氧代-5-(((41S，7aS，13bR)-10-氧代十二氨-1H,甜，8H-二化晚并[2，1-f:3'，2'，^-ij][l，6]糞晚-12-基)氧基)戊酷基)-N-((5-氧代-5-(((41S，7aS，13bR)-10-氧代十二氨-1H，5H，8H-二化晚[2，l-f:3'，2'，^-ij][l，6]糞晚-12-yl)氧基)戊酷基）-D-亮氨酷)-D-半脫胺酷-D-亮氨酷-D-精氨酷-D-脯氨酷l-D-鄉氨酷甘氨酸(TP)的合成：
[008引在2毫升的反应器中加入0.7毫升N，N-二甲基甲酯胺，20°C揽拌下依次加入35毫克 SM2、18毫克N，N-二异丙基乙胺和48毫克TM3,此溫度下揽拌反应120分钟；在20°C下减压浓 缩除去溶剂，得粗品油状物，用制备液相色谱仪进行分离纯化(流动相为水/乙腊/ =氣乙 酸，体积比为90/10/0.1~10/90/0.1;检测波长为214纳米;固定相为Cl姉圭胶），收集目标物 馈分，20°C下除去有机溶剂后得水溶液，进行冻干处理，得到17毫克白色固体TP，收率 24.9%。
[0089] 上述制备得到的TP的核磁氨谱图如图1所示，质谱图如图2所示，核磁氨谱数据为：
[0090] Ih NMR(400MHz，d6-DMS0/D20):S卵m 0.61-0.88(m，l細），1.13-1.25(m，2H)，1.26-2.07(m，41H)，2.08-2.38(m，10H)，2.52-2.69(m，3H)，2.72-2.88(m，lH)，2.88-3.13(m，6H)， 3.19-3.38(m，5H)，3.41-3.56(m，3H)，3.59-3.77(m，細），4.07(d，J = 6.4Hz，lH)，4.21-4.48 (m,7H),4.91-5.19(m,2H).
[0091] 对比例：S-(5-氧代-5-( ((41S, 7aS, 13bR)-10-氧代十二氨-1H, 5H, 8H-二化晚并 [2，l-f :3'，2'，^-ij][l，6]糞晚-12-基）氧基）戊酷基）-N-((5-氧代-5-(((41S，7aS， 13bR)-10-氧代十二氨-1H，甜，8H-二化晚[2，1寸:3'，2'，1'-。'][1，6]糞晚-12-71)氧基)戊 酷基)-D-亮氨酷)-D-半脫胺酷-D-亮氨酷-D-精氨酷-D-脯氨酷^D-鄉氨酷甘氨酸(TP)的其 它制备方法对比：
[0092] 在2毫升的反应器中加入0.7毫升二甲基亚讽，20°C揽拌下依次加入35毫克SM2、14 毫克S乙胺和52毫克TM3,此溫度下揽拌反应135分钟;在20°C下减压浓缩除去溶剂，得粗品 油状，用制备液相进行分离纯化(流动相为水/乙腊/S氣乙酸= 90/10/0.1~10/90/0.1，检 测波长为214纳米），收集目标物馈分，20°C下除去有机溶剂后得水溶液，进行冻干处理，得 到11.5毫克白色固体TP，收率16.8%。
[0093] 实验透膜短肤-苦参碱的细胞实验
[0094] (1)透膜短肤-苦参碱快速透膜进入肝癌细胞实验：
[00M]人肝癌细胞系化pG2常规接种于8孔培养板，每孔5 X IO6个细胞，培养于含10 %胎 牛血清（fetal bovine serumJBS)的DMEM(Du化ecco's modified Eagle's medium)培养 液中。在37°C和5%C02条件下，解育过夜。然后用不含有胎牛血清的培养液洗S遍，加入巧 光标记的透膜短肤-苦参碱(最终浓度为1〇山0。解育5和30分钟后，用PBS冲洗，4%甲醒固定 30分钟。然后在Niko址600巧光显微镜下观察细胞。
[0096] 结果如图3所示，图3显示，巧光素（FITC)标记的透膜短肤-苦参碱和肝癌细胞 HepG2解育5分钟后透膜进入细胞;而30分钟后，更多的透膜短肤-苦参碱进入细胞浆和细胞 核。
[0097] (2)透膜短肤-苦参碱抑制肝癌细胞增殖的实验：
[009引将肝癌细胞化pG2接种96孔板，每孔1 X IO5个细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中。在37 °C和5 % C02条件下，解育过夜。然后用不含有胎牛血清的培养液洗S遍，每 孔加入含有不同浓度的苦参碱和透膜短肤-苦参碱(0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4山0的培 养液100微升。培养24小时后，每孔加入110微升新鲜培养液(含CCK-8溶液10微升），轻微震 荡96孔板10秒，然后放入培养箱继续解育2小时，随后再次振摇10秒后检测比色，去除气泡； W空白对照孔为调零孔，选择45化m波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值）， 记录结果。计算细胞增殖抑制抑制率（％ ) = ( 1-实验组OD值/对照组OD值）X 100%。所有实 验重复3次。同时利用流式细胞仪对0.祉M苦参碱和透膜短肤苦参碱处理的细胞进行细胞周 期分布进行检测。PI用氣离子激发巧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm， 产生红色巧光。WModFitLT3.0软件计算分析细胞周期中各期的分布，至少计数10000个细 胞。
[0099] 结果如图4所示，图4A显示，与苦参碱相比较，透膜短肤-苦参碱在同样的摩尔浓度 下，具有更强的抑制细胞增殖的作用。图4B显示，与苦参碱(34.7%)相比较，透膜短肤-苦参 碱处理的细胞有更多的细胞(67.1%)阻滞于Gl期。结论:与苦参碱相比较，透膜短肤-苦参 碱具有更强的抑制肝癌细胞增殖的作用。
[0100] (3)透膜短肤-苦参碱诱导肝癌细胞调亡的实验：
[0101] 肝癌细胞分别与相同摩尔浓度(0.SiiM)的苦参碱W及透膜短肤-苦参碱解育相同 时间m含10%胎牛血清的DMEM培养液解育相同时间为空白对照），利用Annexin V-門TC细 胞调亡检测试剂盒进行了细胞调亡的检测。
[0102] 结果如图5所示。图5B中的细胞的一部分，利用Annexin V-FITC细胞调亡检测试剂 盒进行了细胞调亡的检测。取5~10万重悬的细胞，1000 g离屯、5分钟，弃上清，加入19化L Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入化L Annexin V-FITC，室溫避光解育10分钟。 1000 g离屯、5分钟，弃上清，加入190化Annexin V-FITC结合液和加入10化舰化丙晚(PI)染 色液，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。同时对运些细胞进行confocal巧光显微镜 观察。Annexin V-FITC染色为绿色巧光，表示早