一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法，它包括铜纳米簇原液的制备、叶酸的活化、叶酸标记铜纳米簇的制备等步骤。本发明制备的铜纳米簇具有显著的抑制MCF?7肿瘤细胞的增殖作用，并且能促进MCF?7细胞凋亡，证明其具有一定的抗乳腺癌肿瘤细胞的活性，动物实验结果表明，本发明能抑制MCF?7细胞裸鼠成瘤，进一步证明了其抗肿瘤细胞活性。由于本发明的铜纳米簇采用了叶酸进行标记，因此还具有明显的靶向性，可用于乳腺癌的临床靶向治疗。
【专利说明】
一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于药物合成领域，具体涉及一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌长期以来严重影响人类公共健康。目前，乳腺癌的治疗方法有很多种，主要 包括内分泌治疗、放化疗、手术切除治疗以及靶向治疗。内分泌治疗相对经济，疗效好，能被 大众接受，但容易复发。放化疗通常针对性较差，病人生活质量严重下降，非首选治疗方案。 手术切除可以根治乳腺癌，疗效非常好，安全性高，但影响美观，难以接受。靶向治疗和放化 疗相比，提高了安全性和针对性，是目前较好的治疗方案。
[0003] 叶酸受体是一种跨膜单链糖蛋白，在大部分人体肿瘤细胞表面过度表达，包括乳 腺癌，但其在正常细胞中表达水平很低甚至不表达。因此叶酸受体介导的抗肿瘤药物分子 设计是目前肿瘤靶向治疗的热点。本发明设计合成了一种叶酸标记的铜纳米簇，能在体外 体内抑制乳腺癌细胞的增殖，迀移，诱导乳腺癌细胞凋亡。为临床靶向治疗乳腺癌提供了新 的思路。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法，采用该方法制备的铜纳 米簇可抑制乳腺癌肿瘤细胞，可用于制备抗乳腺癌药物。
[0005] 本发明提供的制备方法包括以下步骤：
[0006] 1)铜纳米簇原液的制备:将BSA溶解在水中配成浓度为15~20mg/ml的澄清透明溶 液，按照BSAXu2+重量比为（10~40):(1~10)的比例加入铜离子，混合均匀，边搅拌边调节 pH至碱性，在37~60°C下搅拌反应6~8h，然后再调节溶液pH至酸性，生成铜纳米簇沉淀，将 铜纳米簇沉淀离心、分离、清洗后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并调节pH至碱性，即获得铜 纳米簇原液；
[0007] 2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.2~0.5mg/ml的叶酸溶液，然后 按体积分别加入〇 . 5~2%的10~5〇11^/111]^/^0(]水溶液和10~5〇11^/1111的顺5水溶液，在黑 暗、40~60°C条件下陈化10~15h，得活化的叶酸溶液；
[0008] 3)叶酸标记铜纳米簇的制备：将活化的叶酸溶液与5~20倍体积的TriS-HCl缓冲 液混合，然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合，所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶 酸溶液体积的15~30倍，在黑暗，40~60 °C下反应10~15h，然后调节pH至3~6，生成叶酸标 记的铜纳米簇沉淀，将沉淀离心、分离、清洗后重新分散在Tris-HCl缓冲液中形成澄清透明 的溶液，调节溶液的PH值至9~12,即获得叶酸标记铜纳米簇。
[0009] 优选地，步骤1)中，所述的BSA: Cu2+重量比为25:5。
[0010] 优选地，步骤2)中，将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.4mg/ml的叶酸溶液，然后按 体积分别加入1 %的30mg/ml的EDC水溶液和20mg/ml的NHS水溶液。
[0011]优选地，步骤3)中，所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的20倍。
[0012]本发明的有益效果是:本发明制备的铜纳米簇具有显著的抑制MCF-7肿瘤细胞的 增殖作用，并且能促进MCF-7细胞凋亡，证明其具有一定的抗乳腺癌肿瘤细胞的活性，动物 实验结果表明，本发明能抑制MCF-7细胞裸鼠成瘤，进一步证明了其抗肿瘤细胞活性。由于 本发明的铜纳米簇采用了叶酸进行标记，因此还具有明显的靶向性，可用于乳腺癌的临床 靶向治疗。
[0013] 本发明提供的制备方法反应充分，产物收率和纯度高，杂质少，周期短。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例对本发明进行详细地说明。
[0015] 实施例1
[0016] 1)铜纳米簇原液的制备:将BSA (牛血清白蛋白）溶解在水中配成浓度为16mg/ml的 澄清透明溶液，按照BSAXu2+重量比为25:5的比例加入铜离子，混合均匀，边搅拌边加氢氧 化钠调节PH值至11，在50°C下搅拌反应8h，然后再用冰醋酸调节溶液pH至4，生成铜纳米簇 沉淀，将铜纳米簇沉淀离心、分离、去离子水清洗3次后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并用 氢氧化钠调节溶液的PH值至11，即获得铜纳米簇原液；
[0017] 2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO (二甲基亚砜）中配成浓度为0.4mg/ml的叶酸溶 液，然后按体积分别加入1 %的30mg/ml的EDC (碳二亚胺)水溶液和20mg/ml的NHS (N-羟基硫 代琥珀酰亚胺)水溶液，在黑暗、50°C条件下陈化12h，得活化的叶酸溶液；
[0018] 3)叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与10倍体积的TriS-HCl缓冲液混 合，然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合，所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶 液体积的20倍，在黑暗，50°C下反应12h，然后再用冰醋酸调节pH至4,生成叶酸标记的铜纳 米簇沉淀，将沉淀离心、分离、去离子水清洗3次后重新分散在Tri s-HCl缓冲液中形成澄清 透明的溶液，用氢氧化钠调节溶液的PH值至11，即获得叶酸标记铜纳米簇。
[0019] 实施例2P十酸标记铜纳米簇体外抑制MCF-7细胞增殖试验
[0020] 取生长良好的对数生长期MCF-7细胞，胰蛋白酶消化后接种到96孔板，置细胞培养 箱37度，5 %二氧化碳条件培养24小时。设计5个药物浓度，每个浓度4个复孔，以空白培养基 为对照。给药后48小时按照MTT实验标准步骤，酶标仪测定OD值，计算细胞生长抑制率。结果 如表1所示。
[0021 ]表1叶酸标记铜纳米簇对MCF-7细胞增殖的抑制作用
[0023]以上实验结果表明：本发明制备的铜纳米簇对MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作 用，抑制率随浓度增加而增加，当浓度达到20μg/ml时，抑制率显著增加。
[0024]实施例3叶酸标记铜纳米簇促进MCF-7细胞凋亡试验
[0025] 培养MCF-7细胞，分别以lμg/ml、5μg/ml、10μg/ml叶酸标记铜纳米簇处理细胞24小 时，采用Annexin V-FITC/PI染色的方法，经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡率见表2。
[0026] 表2叶酸标记铜纳米簇诱导MCF-7细胞凋亡
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[0029]实施例4体内裸鼠成瘤实验
[0030]造模:取对数生长期的MCF-7细胞，用PBS调整细胞浓度为IO8Ail。在无菌条件下将 0.2ml细胞接种于Balb/c裸鼠右腋下皮下。接种后观察肿瘤生长状况，肿瘤体积长到IOOmm3 左右进行分组，每组6只，包括模型对照组，低（lμg/ml)中（5μg/ml)高（lOμg/ml)计量组。实 验组每周两次瘤内注射给药，三周后剥离肿瘤组织，考察相关参数。
[0031 ]表3叶酸标记铜纳米簇对MCF-7细胞裸鼠成瘤的抑制
[0033]实验结果表明：本发明制备的铜纳米簇给药组肿瘤重量明显低于对照组。
【主权项】
1. 一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 铜纳米簇原液的制备:将BSA溶解在水中配成浓度为15~20mg/ml的澄清透明溶液， 按照BSA:Cu2+重量比为（10~40):(1~10)的比例加入铜离子，混合均匀，边搅拌边调节pH至 碱性，在37~60°C下搅拌反应6~8h，然后再调节溶液pH至酸性，生成铜纳米簇沉淀，将铜纳 米簇沉淀离心、分离、清洗后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并调节pH至碱性，即获得铜纳米 簇原液； 2) 叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.2~0.5mg/ml的叶酸溶液，然后按体 积分别加入0.5~2%的10~50mg/ml的EDC水溶液和10~50mg/ml的NHS水溶液，在黑暗、40 ~60 °C条件下陈化10~15h，得活化的叶酸溶液； 3) 叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与5~20倍体积的Tris-HCl缓冲液混 合，然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合，所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶 液体积的15~30倍，在黑暗，40~60 °C下反应10~15h，然后调节pH至3~6,生成叶酸标记的 铜纳米簇沉淀，将沉淀离心、分离、清洗后重新分散在Tris-HCl缓冲液中形成澄清透明的溶 液，调节溶液的pH值至9~12,即获得叶酸标记铜纳米簇。2. 如权利要求1所述的叶酸标记铜纳米簇的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述的 85八:(：112+重量比为25:5。3. 如权利要求1所述的叶酸标记铜纳米簇的制备方法，其特征在于：步骤2)中，将叶酸 溶解在DMSO中配成浓度为0.4mg/ml的叶酸溶液，然后按体积分别加入1 %的30mg/ml的EDC 水溶液和20mg/ml的NHS水溶液。4. 如权利要求1所述的叶酸标记铜纳米簇的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述铜 纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的20倍。
【文档编号】A61P35/00GK105963709SQ201610401909
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】陈勇, 梁继超, 骆爱玲
【申请人】湖北大学