专利名称：病毒核酸提取试剂及核酸纯化柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从液体中提取和纯化病毒核酸的试剂、方法及其生产工艺，是分子生物学试验最基本的步骤之一，涉及了病毒学研究、核酸检测、基因克隆等领域。
背景技术：
随着分子生物学研究的快速进展，对疾病相关的病毒载量的测定，成为对疾病可靠诊断、病程预后、药物治疗效果评价、疫苗保护作用评价的重要手段，而从生物材料中高效、简便地分离和纯化到完整的、高纯度的目标核酸是很重要的技术。传统的核酸纯化方法采用变性剂、蛋白酶K等裂解组织，释放出核酸后，用苯酚、氯仿萃取，异丙醇沉淀，去除上清后得到核酸。步骤繁琐，耗时长，提取率低，重复性差。
目前，已经商品化的病毒核酸提取试剂盒的价格都比较昂贵，面对如此昂贵的价格，我国的绝大多数病毒感染者(如艾滋病和病毒性肝炎患者)无能力接受常规检测，这也严重影响了我国对这些疾病的及时监控与预防。因此，迫切需要研究开发价格便宜、高效、稳定和简便的病毒核酸提取试剂盒。
1990年R.Boom等在《临床微生物期刊》发表的文章介绍了核酸在高浓度Chaotropic盐的条件下可以和硅材料发生结合，而改变环境后核酸又可以洗脱下来，利用硅材料的这种特性可以快速地分离和纯化得到核酸。用于病毒核酸的提取的试剂盒，应包括病毒核酸提取过程中需要的各种试剂和用于吸附核酸的核酸吸附介质。我们对不同的Chaotropic盐(如盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钠，氯化钠，高氯酸钠，溴化钾等)进行了分析研究，配制了含盐酸胍的混合试剂作为病毒裂解液。同时还配制了促吸附液，去蛋白液，洗涤液和洗脱液，它们与裂解液组成完整的核酸提取试剂。通过研究，发现玻璃纤维深层截留滤膜对核酸具有良好的吸附性能，经加工后可作为核酸吸附介质，即纯化柱的滤膜。将各种提取试剂与纯化柱组合即成为小量柱离心式病毒核酸提取试剂盒。
发明内容
本发明人经过艰苦摸索，获得了一种病毒核酸的提取方法以及用于该方法的试剂盒以及在该提取过程中所需要的试剂。令人惊讶的，该方法超出了现有技术的预料，不但能够安全、高效、完整地提取病毒核酸，而且不需要在提取过程中使用有机溶剂，从而避免产物中有机物污染的产生。
本发明在第一方面提供了一种用于提取病毒核酸的纯化柱，包括柱体和柱体内的吸附介质，其特征在于以玻璃纤维滤膜作为吸附核酸的吸附介质，该滤膜具有与核酸可逆性的结合的特点。所述柱体的结构对于本领域技术人员来说是公知的。柱体通常包括诸如进样孔的进样构件、能够容纳吸附介质容器和诸如流出孔的流出构件，例如，样品液可以从进样孔中加入，流经容器中的吸附介质，最后从流出孔中排除柱体之外。现在已经有许多商品化的柱体了，如上海生工有限公司销售的质粒提取试剂盒中的柱体、上海华舜生物工程有限公司及Roche公司核酸提取试剂盒中的柱体。吸附介质是指硅材料，尤其是指具有的与核酸可逆性的结合特点的硅材料，这样可以有效地分离和纯化核酸。本发明中优选以玻璃纤维滤膜作为核酸的吸附介质，将其制备成一定规格后装入聚丙乙烯材料制备的中空柱体中，压入垫圈固定即可作为纯化柱使用。玻璃纤维滤膜对于本领域技术人员来说是公知的。已经有多种商品化的玻璃纤维滤膜可供选择，如美国Millipore和英国Whatman公司生产的玻璃纤维深层截流滤膜(初滤用)。
本发明的核酸提取试剂共有病毒裂解液，促吸附液，去蛋白液，洗涤液和洗脱液5个部分。
本发明在第二方面提供了一种用于提取病毒核酸的裂解液，其能够彻底裂解病毒，释放核酸，并且促进核酸与吸附介质(玻璃纤维滤膜)结合。优选该裂解液含有6mol/L盐酸胍和20％ Triton X-100，而且pH为酸性，同时还包括尿素、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)。优选该裂解液的pH为3.5-4.5，更优选为4。盐酸胍(浓度为6mol/L)、TritonX-100和尿素作为变性剂，这种组合可以保证完全裂解病毒并释放出病毒核酸，并且有利于核酸与玻璃纤维膜的结合；三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)作为pH缓冲剂。
本发明在第三方面提供了一种用于提取病毒核酸的促吸附液，其主要成分是异丙醇，优选该促吸附液是含有大于80％异丙醇的水溶液或纯异丙醇，可以提高核酸在高浓度盐酸胍溶液中与玻璃纤维膜的结合。
本发明在第四方面提供了一种用于提取病毒核酸的去蛋白液，所述去蛋白液是含醇和盐酸胍的溶液，其特征在于其中盐酸胍的浓度大于5mol/L，pH大于6，醇的浓度为30-70％，优选醇是乙醇，浓度为50％；优选其中盐酸胍的浓度为5mol/L。而且优选该去蛋白液的pH为5.5-6.5，更优选pH为6。该去蛋白液可以去除玻璃纤维膜上吸附的蛋白及其它杂质。
本发明在第五方面提供了一种用于提取病毒核酸的洗涤液，所述洗涤液是含醇和低盐的溶液，如含醇和氯化钠的溶液，其特征在于其中氯化钠浓度为20mmol/L，醇的浓度大于80％，而且pH为7-8。该洗涤液可以去除玻璃纤维膜上吸附的蛋白及其它杂质，如多糖、纤维素、脂等。优选该洗涤液的pH为7.5，优选其中的优选醇是乙醇。
本发明在第六方面提供了一种用于提取病毒核酸的洗脱液，所述洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水，而且pH为7-8。该洗脱液的pH优选为7.5。优选制备本发明的洗脱液的方式是将水经过焦磷酸二乙酯(DEPC)处理，从而可以将玻璃纤维膜上吸附的核酸洗脱下来。
本发明在第七方面提供了一种病毒核酸的提取方法，该方法的步骤包括(1)在含有病毒的液体中加入本发明第二方面所述的裂解液，50-95℃作用1-30分钟，再加入本发明第三方面所述的促吸附液，混合均匀。其中，优选在70℃作用10分钟。
(2)将步骤(1)得到的混合溶液加入本发明第一方面的纯化柱的柱体中，弃流出液。其中，流出液可以通过重力作用从流出孔流出，优选通过离心让流出液流出并弃去。
(3)在步骤(2)得到的纯化柱的柱体中加入本发明第四方面所述的去蛋白液，弃流出液。其中，流出液可以通过重力作用从流出孔流出，优选通过离心让流出液流出并弃去。
(4)在步骤(3)得到的纯化柱的柱体中加入本发明第五方面所述的洗涤液，弃流出液，再加入权利要求5所述的洗涤液洗涤1次。其中，流出液可以通过重力作用从流出孔流出，优选通过离心让流出液流出并弃去。
(5)在步骤(4)得到的纯化柱的柱体中加入本发明第六方面所述的洗脱液，收集流出液。其中，流出液可以通过重力作用从流出孔流出，从而获得病毒核酸的溶液，优选通过离心让流出液流出并将病毒核酸的溶液收集在干净的容器内，。
本发明第七方面所述的方法中，病毒核酸可以是DNA或RNA。
本发明第七方面所述的方法中，含有病毒的液体可以是血浆、尿液或病毒培养上清。
本发明在第八方面提供了一种小量柱离心式病毒核酸提取试剂盒，包括病毒核酸提取过程中需要的玻璃纤维滤膜和本发明第二至六方面的产品。
本发明的纯化柱的制备可以是在中空的柱体内装入玻璃纤维膜，压入垫圈固定即可。结构简单，成本低，制备方便。
本发明提供了一种操作简便，快捷、提取完整性好、纯度高的病毒核酸提取试剂及方法。所提取的核酸可以直接进行PCR及RT-PCR扩增检测。
通过上述要素的组合可以达到安全、高效、快速提取病毒核酸。无需使用有机溶剂，不存在产物中有机物污染的问题。病毒核酸提取过程简洁，核酸纯度高，提取效率高。提取产物可直接用于PCR、RT-PCR及基因克隆等分子生物学实验研究及临床检测。
附图的简要说明附
图1为病毒滴度与CT值的相关性曲线，相关系数为0.99。
附图2为初始病毒量与CT值的相关性曲线。
发明简述1、制备核酸提取纯化柱玻璃纤维滤膜的主要成分为硅酸盐，具有与核酸可逆性结合的特点，可以用于核酸的分离和纯化。纯化柱的柱体可以委托加工(如江苏省海门联合塑料制品公司)，材料为聚丙乙烯(PP)，可耐高温、高压。将玻璃纤维滤膜用打孔器制成直径为7毫米膜片，再将膜片压入纯化柱的柱体中，作为核酸吸附介质。
柱质量的评价方法以商品化的核酸提取试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)中的提取试剂，配合本发明的纯化柱对病毒核酸进行提取，通过常规的荧光实时定量PCR技术对所提取的核酸进行病毒载量测定，以CT值的高低为评价指标(在实时定量PCR检测中，CT值的含义为反应管内荧光信号达到所设定阈值的循环次数，CT值的高低与起始模板数成反比)。通过比较CT值的大小，可以分析不同纯化柱吸附介质(玻璃纤维滤膜)的核酸吸附效率。
2、配制试剂完整的核酸提取试剂的组合由本发明的裂解液，促吸附液，去蛋白液，洗涤液和洗脱液5种试剂组成。其中裂解液是由盐酸胍、Triton X-100等组成混合溶液，洗涤液为含盐的醇溶液，洗脱液为经DEPC处理的蒸馏水。
试剂质量评价方法以商品化的核酸提取试剂盒中的纯化柱，配合本发明的5种试剂提取病毒核酸，以荧光实时定量PCR技术进行病毒载量测定，以CT值为评价指标，分析本发明的各种提取试剂的提取效率，并对配方进行优化。
3、提取效率评价将含病毒(如HIV、HBV、HCV等)的血浆与正常人血浆混合后进行10倍梯度稀释，设6个梯度，用本发明的核酸提取试剂和纯化柱提取病毒核酸，并与商品化的病毒核酸提取试剂盒提取的同一份核酸进行提取量的比较。以常规的荧光实时定量PCR技术进行病毒载量测定，以CT值为评价指标，分析本发明的核酸提取试剂及纯化柱的提取效率。
4、回收率评价将含病毒的血浆与正常人血浆混合，用本发明的核酸提取试剂盒，分别进行两份相同样品的提取。进行一次提取，提取得到了核酸溶液，其中一份再将得到的核酸溶液重复一次核酸提取过程，将两份核酸进行荧光定量检测，比较其CT值。
5、纯度评价将提取到的病毒核酸用紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm的吸光度(OD值)，根据A260/A280比值判断核酸的纯度。
6、病毒灭活效率评价按我国卫生部《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB15981-1995)要求完成。
7、工艺设备7.1制膜委托江苏省海门联合塑料制品公司生产本发明所需的纯化柱柱体；根据柱体的结构，用打孔器将玻璃纤维滤膜加工成圆型的玻璃纤维膜片。
7.2组装设备委托江苏省海门联合塑料制品公司生产组装设备，用该设备将制备好的玻璃纤维膜片和垫片压入纯化柱的柱体内。
实施例1以玻璃纤维深层截流滤膜(购自Millipore公司)作为核酸吸附介质，用打孔器制成直径为7mm膜片。将膜片装入聚苯乙烯材料制备的中空柱体中，压入垫圈，将膜片固定在柱体底部即可。
实施例2裂解液是一种含盐酸胍的变性剂取分析纯盐酸胍(Guanidine Hydrochloride分子式CH5N3HCl，分子量为95.53)28克、尿素0.03克，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCL)0.06克、曲拉通(Triton X-100)10毫升，然后用蒸馏水20毫升溶解，用盐酸调至pH4即可。促吸附液是纯异丙醇。去蛋白液是一种含醇和盐酸胍的溶液取盐酸胍23克、三(羟甲基)氨基甲烷0.12克，加入15毫升蒸馏水溶解，用盐酸调至pH 6，再加入20毫升95％乙醇即可。洗涤液是一种含醇和氯化钠的溶液取氯化钠0.1克、三(羟甲基)氨基甲烷0.025克、加入20毫升蒸馏水溶解，再加入80毫升95％乙醇即可。洗脱液焦磷酸二乙酯(DEPC)处理后的蒸馏水经高温灭菌即可。
实施例3按实施例2制备好试剂后，核酸提取操作按以下方法进行1)裂解病毒在1.5ml离心管中加入200μl含病毒的血浆，再加入500μl裂解液，混匀，置于70℃温浴10分钟。
2)核酸吸附在离心管中再加入600μl的促吸附液，混匀。移取650μl至纯化柱的柱体中，8,000g离心1分钟，将纯化柱柱体移入新收集管中。将剩下的650μl裂解物移入纯化柱的柱体中，8000g离心1分钟。将纯化柱柱体移入新收集管中。
3)洗涤加入500μl去蛋白溶液，8,000g离心1分钟。弃收集管中的液体，将纯化柱柱体移入新收集管中，加入500μl洗涤液，8,000g离心1分钟。将纯化柱的柱体移入新收集管中，加入500μl洗涤液，8,000g离心1分钟。
4)核酸洗脱将纯化柱柱体移入新收集管中。在纯化柱的柱体的玻璃纤维膜中央加入50μl洗脱液，室温静置1分钟后，8,000g离心1分钟，收集洗脱液。
实施例4将含病毒(HIV、HBV及HCV)的血浆5倍梯度稀释，共6个梯度，用本发明的核酸提取试剂和纯化柱进行核酸提取，并且用常规的荧光实时定量PCR技术对所提取的核酸进行病毒载量测定。结果显示，在一定范围内其提取量与初始病毒量具有良好的线性关系，相关系数为0.99。(图1、图2)。
实施例5将含病毒HIV的血浆用本发明的核酸提取试剂和纯化柱进行核酸提取并且做如下测定1)检测RNA溶液的吸光度(OD)A260/A280＝1.8，其比值在RNA纯度的正常质量范围内。
2)根据RNA溶液的吸光度(OD)A260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml的计算公式，我们得出本试剂盒纯化柱核酸吸附力为140μg。
3)对同一含病毒的血浆进行多个提取，用常规的荧光实时定量PCR技术对所提取的核酸进行病毒载量测定，核酸提取量的变异系数小于25％。
4)试剂盒中的试剂裂解液、促吸附液、去蛋白溶液、洗涤液及洗脱液，置室温保存，未开封可以保存一年，开封后半年内用完。样品起始量为200μl血清/其它液体样品，得率大于85％。
实施例6柱质量的评价方法将含病毒(如HIV和HBV)的血浆与正常人血浆混合后进行10倍梯度稀释，设6个梯度，用本发明的纯化柱和商品化的核酸提取纯化柱(购自上海华舜生物工程有限公司的产品，产品编号W6751)配与商品化(华舜)的核酸提取试剂进行病毒核酸提取，以深圳匹基公司生产的荧光实时定量PCR试剂盒进行病毒载量测定(HIV和HBV)。以CT值为评价指标(在实时定量PCR检测中，CT值的含义为反应管内荧光信号达到所设定阈值的循环次数，CT值的高低与起始模板数成反比)。比较本发明的纯化柱与商品化试剂盒中纯化柱核酸吸附效率。检测显示，用本发明的纯化柱提取的病毒核酸经过常规的荧光实时定量PCR测定，其CT值低于所比较的商品化纯化柱的CT值，即本发明的纯化柱提取到的核酸量高于所比较的商品化纯化柱，并且其CT值与病毒浓度梯度具有良好的线性关系，证明本发明的纯化柱具有优良的核酸吸附效率。
提取试剂质量评价方法将含病毒(如HIV和HBV)的血浆与正常人血浆混合后进行10倍梯度稀释，设6个梯度，用本发明的核酸提取试剂和商品化的核酸提取试剂(购自上海华舜生物工程有限公司，产品编号W6751)配与商品化(华舜)的核酸提取纯化柱进行病毒核酸提取，以深圳匹基公司生产的荧光实时定量PCR试剂盒进行病毒载量测定(HIV和HBV)。以CT值为评价指标，比较本发明的病毒核酸提取试剂与商品化的核酸提取试剂的提取效率。检测显示，用本发明的核酸提取试剂提取的核酸经过常规的荧光实时定量PCR测定，其CT值等于所比较的商品化纯化柱的CT值，证明本发明的病毒核酸提取试剂具有可靠的核酸提取效率。
权利要求
1.一种用于提取病毒核酸的纯化柱，包括柱体和柱体内的吸附介质，其特征在于以玻璃纤维滤膜作为吸附核酸的吸附介质，该滤膜具有与核酸可逆性的结合的特点。
2.一种用于提取病毒核酸的裂解液，其含有6mol/L盐酸胍和20％Triton X-100，而且pH为3.5-4.5，同时还包括尿素、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)。
3.一种用于提取病毒核酸的促吸附液，其主要成分是异丙醇。
4.一种用于提取病毒核酸的去蛋白液，所述去蛋白液是含醇和盐酸胍的溶液，其特征在于其中盐酸胍的浓度为5mol/L，而且pH为5.5-6.5。
5.一种用于提取病毒核酸的洗涤液，所述洗涤液是含醇和氯化钠的溶液，其特征在于其中氯化钠浓度为20mmol/L，醇的浓度大于80％，而且pH为7-8。
6.一种用于提取病毒核酸的洗脱液，所述洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水，而且pH为7-8。
7.一种病毒核酸的提取方法，该方法的步骤包括(1)在含有病毒的液体中加入权利要求2中所述的裂解液，50-95℃作用1-30分钟，再加入权利要求3中所述的促吸附液，混合均匀；(2)将步骤(1)得到的混合溶液加入权利要求1的纯化柱的柱体中，弃流出液；(3)在步骤(2)得到的纯化柱的柱体中加入权利要求4所述的去蛋白液，弃流出液；(4)在步骤(3)得到的纯化柱的柱体中加入权利要求5所述的洗涤液，弃流出液，再加入权利要求5所述的洗涤液洗涤1次；(5)在步骤(4)得到的纯化柱的柱体中加入权利要求6所述的洗脱液，收集流出液。
8.如权利要求7所述的方法，其中病毒核酸是DNA或RNA。
9.如权利要求7所述的方法，其中含有病毒的液体是血浆、尿液或病毒培养上清。
10.一种小量柱离心式病毒核酸提取试剂盒，包括病毒核酸提取过程中需要的玻璃纤维滤膜和权利要求2-6的产品。
全文摘要
本发明涉及病毒核酸(DNA/RNA)的提取试剂、提取方法及材料制备，适用于各种分子生物学研究及临床检测。本发明的核酸提取试剂包括裂解液、促吸附液、去蛋白液、洗涤液及洗脱液；核酸提取的纯化柱包括柱体和核酸吸附膜两部分。本发明使病毒核酸提取过程安全、简洁，提取的核酸完整、纯度高，提取产物(DNA/RNA)可直接用于PCR、RT－PCR及基因克隆等分子生物学实验研究及临床检测。
文档编号C07H1/00GK1786013SQ20051009018
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者陶剑, 贲昆龙, 李卫云, 任若通, 李汝润 申请人:李卫云, 李燕琴