专利名称：一种抗细胞色素b5异构体b抗体及其在纯化线粒体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和细胞学等生物技术领域，具体而言本发明涉及线粒体外膜蛋白细胞色素B5异构体B(CYB5B)、CYB5B多克隆抗体制备、CYB5B抗体与磁性材料偶联后形成免疫磁珠(CYB5B磁珠)、以及利用CYB5B磁珠纯化细胞中线粒体的方法。该方法制备出的线粒体结构完整，富集效率高，可用于生物技术的各个领域。
背景技术：
线粒体是真核生物中的一种重要细胞器，它的基本生物学功能是合成细胞所需的能量化合物，ATP。线粒体还具有许多重要生物功能，包括离子稳态维护、物质代谢和细胞凋亡等。因此,线粒体功能紊乱可以导致多种疾病,例如引起神经肌肉疾病、心血管病、糖尿病、神经退行性疾病如帕金森氏病等多种疾病。对线粒体的分析有助于我们对上述疾病的 深入研究，而从有限的生物样品中分离纯化得到一定数量的、纯度较高的线粒体是进行线粒体生化及功能研究的基础。目前公认的线粒体分离纯化技术包括以下几种离心分离纯化法，自由流电泳分离法，流式细胞分选法，和免疫磁珠分离法。离心分离纯化法是根据线粒体与其它细胞器具有不同的沉降系数和密度通过离心而将线粒体与其它细胞组分分开。使用Percoll、Necodenz或鹿糖铺设连续或不连续的密度梯度溶液，将细胞匀浆液置于介质溶液中，离心开始后，原来分布均匀的粒子发生重新分布。粒子进入到一个与它本身的密度相同的位置，此时粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。由于离心技术操作过程简单、省时，得到的线粒体纯度高，一次性可以处理大量的样品。因此，离心法在线粒体的分离纯化中得到很广泛的应用。比如大鼠的脑、肝、肌肉、心等组织的线粒体，人293T细胞、小鼠LDTK-等细胞(一般IO8以上)。但是离心法不适合小规模提取线粒体。首先，微量组织和细胞中所含的线粒体很少，在离心处理的过程中容易丢失，造成线粒体回收率显著下降。其次，由于离心体积过小，介质几乎无法形成稳定的梯度，也就无法按照梯度的层次分离线粒体。自由流电泳分离法是根据不同细胞器表面的负电荷密度各不相同，继而在电场中的电泳迁移率不同而达到线粒体的分离目的。样品通过进样口进入分离腔后，被液流所带动流向另一端；而在与液体流动方向垂直的方向上同时加有电场，所以具有不同电泳迁移率的物质将在电场中迁移不同的距离，样品被分为若干束，从而在分离腔另一端的不同出口处得到收集分离。由于自由流电泳是一个全液相分离过程，不使用任何固体支持介质，分离条件非常温和，而且一般不使用有机溶剂.因此对于线粒体细胞器等，可以得到良好的分离纯化，其生物活性也同时得到较好的保存。自由流电泳技术已成功应用于酵母和拟南介线粒体的分离。但是相对于过氧物酶体、晚期胞内体而言，线粒体电迁移能力较差，在电泳的过程中容易产生沉淀，并且由于电泳本身固有的影响因素(焦耳热，电动力学变形)夕卜，还有层流(流体力学变形)以及一些综合因素的影响(电流体力学变形等)，而且这些因素又常常相互关联，使整个过程变得极为复杂，导致在电泳后有条带扩散现象和稀释效应。因此，目前自由流电泳一般也只用于大规模样品的分离。流式细胞分选法的原理是将细胞裂解液用荧光染料偶联的抗体标记，标记后的线粒体与其它组分进入流动室，形成一连串的均匀小液滴，标记有荧光染料线粒体被激光激发后产生荧光，光学系统已测定了它们的信号，仪器给整个液流充以电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定线粒体液滴就带有电荷，而不被选定的其它组分则不带电。线粒体液滴通过高压偏转板时发生偏转，从而得到分离。已有人使用流式细胞法分离过大鼠肝脏和脾脏的线粒体。但由于线粒体远比细胞小，线粒体上带上的荧光染料也较少，使得分选时的信号较弱，回收率低，分离效果差。免疫磁珠法分离的一般步骤是将抗体与磁珠混合,磁珠是以顺磁性材料如三氧化二铁(Fe2O3)或四氧化三铁(Fe3O4)为核心，在其外表面包裹高分子材料如聚苯乙烯、乙基纤维素等，制成直径从几十纳米到几十微米的微球，通过吸附结合或化学偶联将特异性抗体结合到磁珠表面，便形成免疫磁珠。免疫磁珠上的抗体能够专一地识别含有抗原的组分，然 后使用磁铁吸附磁珠，便能够有效地将该组分与其它组分分离。然后，再利用温和洗脱液将结合于磁珠上的组分析脱下来。在处理少量样品时，相对于前三种方法，免疫磁珠法具有很好的技术优势。首先免疫磁珠法没有繁琐的多次离心步骤，避免了线粒体的损失。其次免疫磁珠是通过免疫吸附作用与线粒体结合，可以吸附具有不同密度的线粒体，避免了因为线粒体的密度差异而在梯度离心中造成的损失。迄今为止，仅有一篇文献报道使用免疫磁珠法分离线粒体(Hue-Tran Hornig-Do,Gritt Giinther,Maria Bust,Patricia Lehnartz,Andreas Bosio, Rudolf J. ffiesner. Isolation of functional pure mitochondria bysuperparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry(2009)389 :1-5)。在该文章中，作者利用直接偶联了抗线粒体外膜蛋白T0M22(22-kDa translocase of outermitochondrial membrane)的单抗的磁珠来分离线粒体。但是,这个方法仍存在较大的技术不足。首先，作者显然忽略了线粒体蛋白质具有很大程度的组织特异性。如果无法找到一个非组织特异性的线粒体蛋白质及其对应的抗体，免疫磁珠方法在线粒体制备上的应用将受到很大的限制。事实上，无论是本实验室还是其他实验室都有充分证据表明T0M22的确是一个组织特异性的线粒体蛋白质(图 6), (Mootha VK, Bunkenborg J, Olsen JV, HjerrildM, Wisniewski JR, Stahl E,Bolouri MS, Ray HN,Sihag S, Kamal M,Patterson N,LanderES, MannM. Integrated analysis of protein composition,tissue diversity, and generegulation in mouse mitochondria. Cell. 2003Nov 26 ；115 (5) :629-40)。其次，作者没有意识到线粒体外膜蛋白质的丰度高低严重地影响到免疫磁珠的效率。选择高丰度线粒体蛋白质作为抗原是一个较为重要的技术考虑。再次，作者没有系统地考察在什么规模的细胞数目水平上，免疫磁珠法能够制备高质量和产率的线粒体。因此，发展一个适合于制备线粒体的广谱性免疫磁珠技术，就必须在这三个方面有革命性的突破。
发明内容
为了解决以上技术难题，本发明的第一个目的是提供一种特异定位于线粒体外膜，在各个组织中均稳定表达且具有较高丰度和免疫原活性的抗原细胞色素B5异构体B (Cytochrome b5 type B, CYB5B)。
本发明的第二个目的是提供一种特异识别CYB5B线粒体外膜蛋白质的多克隆抗体。本发明的第三个目的是提供一种在少量样品中纯化线粒体及线粒体蛋白质的方法。本发明的第四个目的是提供一种用于纯化细胞线粒体蛋白质的免疫学试剂(CYB5B 磁珠)。为解决技术问题所采用的技术方案利用生物信息学的方法，寻找一种定位于线粒体外膜的、非组织特异性表达的、丰度适中的、并且其膜外部分的免疫原性较强的候选蛋白，CYB5B。通过克隆其膜外部分的编码基因，连接到表达载体中，在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白作为免疫原。免疫新西兰大白兔，收集兔血清，利用重组免疫原亲和层析纯化特异性和高敏感性的CYB5B多克隆抗体。 将CYB5B抗体与磁性材料结合，生产免疫磁珠材料CYB5B磁珠。把CYB5B磁珠加入到细胞裂解液中，以富集细胞中的线粒体。使用免疫印迹方法(Western Blot)和电镜检测所富集得到的线粒体的纯度和完整性。以Bradford法定量检测制备的线粒体的蛋白质含量。具体地，本发明涉及以下几方面内容I. 一种多克隆抗体，其特征在于能够特异结合线粒体外膜蛋白质细胞色素B5异构体 B (CYB5B)。2.上述的多克隆抗体，其免疫原含有下述氨基酸残基之一I)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列中任意连续14个(或以上)氨基酸的多肽片段；3)与序列表中SEQ ID NO :2序列中任意连续14个氨基酸的相似性大于80%的多肽片段。3.上述的多克隆抗体，其在利用抗原抗体结合的方法纯化线粒体蛋白质中的应用。4.上述的多克隆抗体，将其偶联到一个固相载体上纯化线粒体的应用。5.上述的多克隆抗体，其作为免疫学试剂进行抗原抗体反应的用途。6. 一种免疫磁珠(CYB5B磁珠)，其特征在于磁珠上偶联有上述的多克隆抗体。7.上述的免疫磁珠，其用于抗原抗体结合的用途。8.上述的免疫磁珠，其用于纯化线粒体的用途。9. 一种纯化线粒体的方法，其特征在于使用上述的免疫磁珠特异结合生物样品中的线粒体蛋白质CYB5B。本发明的优点及其有益效果I)本发明所选用的抗原CYB5B为线粒体外膜蛋白，并仅在线粒体上表达；而且CYB5B表达不具有组织特异性，与之前报道的T0M22相比较，具有更为广谱的表达范围。2)本发明所采用的抗原CYB5B在线粒体中的表达丰度较高，适合作为免疫法提取线粒体的祀标抗原，提闻提取效率。3)本发明采用免疫纯化的多克隆抗体，不仅利用了多识别位点带来的高亲和力，也因免疫纯化提高了特异性，保证了线粒体提取的效率和纯度。
4)本发明提供的线粒体富集方法-免疫磁珠法富集效率高，能够从小量样品中进行线粒体的富集。可以在最少IO4个细胞中有效提取线粒体。5)本发明提供的线粒体富集方法纯化得到的线粒体富集效率较传统方法高3-4倍，且该方法富集得到的线粒体纯度高，完整性好，有非常高的应用价值。6)本发明提供的偶联方法 是抗体通过Protein A与载体连接在一起的,相对于抗体直接与载体连接的方法，本方法既可以避免抗体与载体直接偶联带来的亲和活力降低，又可以使抗体活性基团更加充分的暴露，增加其与线粒体蛋白结合的特异性。7)本发明提供了一种用于纯化线粒体的免疫学试剂(CYB5B磁珠)。该免疫学试剂不仅能应用于肝癌细胞和胃癌细胞中线粒体的纯化，而且也可以应用于其他细胞系中线粒体的纯化。
图I :表示pET32a_CYB5B重组质粒的构建和CYB5B重组蛋白的表达纯化结果，结果显示CYB5B片断成功的插入到pET32a载体中，表达后的CYB5B重组蛋白经纯化后具有较高的纯度。图2 :表示纯化前后CYB5B抗体的滴度和特异性的检测。具体而言，纯化前CYB5B血清滴度为I. 2 X IO4,纯化后CYB5B抗体的滴度为2. I X IO5,纯化前后抗体都有较好的特异性，纯化后抗体仅与线粒体发生作用。图3 :表示利用CYB5B磁珠对线粒体的富集作用。具体而言，磁珠能从人胃癌细胞系BGC823和人肝癌细胞系HuH7中富集线粒体，洗脱后的线粒体经透射电镜和WesternBlot检测表明其具有较高的特异性和结构完整性。图4 :表示利用CYB5B磁珠所富集的线粒体的蛋白质含量，从I X IO7的BGC823和HuH7细胞中分别可以提取得到46 μ g和41 μ g的线粒体蛋白。图5 :表示差速离心法与CYB5B磁珠法富集线粒体效果的比较。具体而言，CYB5B磁珠富集线粒体的效果是差速离心法的3-4倍。图6 :表示CYB5B与T0M22表达特异性的比较。Western blot结果显示，T0M22具有组织表达特异性，其在小鼠肝脏组织和人肝脏细胞系L-02中均表达量很低，而CYB5B在被检测的组织和细胞水平上都稳定表达且丰度较高。图7 :表示利用CYB5B磁珠纯化线粒体的效率，通过该方法可以在低至IO4个细胞中提取出线粒体。
具体实施例方式下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。实施例I CYB5B免疫原的制备一、CYB5B 基因克隆根据已公布的人CYB5B的基因序列(gi =83921613)设计PCR引物CYB5B 5，正向引物5’ CCG GAA TTC ATG TCC GGT TCA ATG GCG 3’CYB5B 3’ 反向引物5’ CCG CTC GAG TTT TGA AGG GTC CTT GCT 3’
以人肝cDNA文库为模板，PCR扩增出CYB5B基因的1-345位核酸序列(SEQ ID NO 2。PCR 参数95°C 5min ；94°C 30s 54°C 30s 72°C lmin，共 40 个循环；72°C后延伸 IOmin)。二、CYB5B基因片段亚克隆入pET32a载体将上述PCR得到的CYB5B片段和pET32a质粒分别用EcoR I和Xho I 37°C双酶切8小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，然后使用的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TianGEN公司)纯化酶切后的载体和基因片断。16°C连接载体和基因片段过夜，将连接产物转化至DH5ci，挑取单克隆小量培养后提取质粒进行酶切鉴定。双酶切结果(图I)表明酶切后的片段大小约为300bp，与预期一致。挑取阳性克隆质粒进行测序，测序结果表明，目的基因正确插入pET32a，并保持正确的读码框架。得到的阳性克隆即为重组有his-tag的CYB5B的原核表达重组子，命名为pET32a-CYB5B。 三CYB5B重组蛋白的表达纯化将pET32a-CYB5B转入BL21菌株，当菌液的OD值达到O. 6左右时，加入Immol/ L IPTG诱导4小时后收菌，超声破碎、离心、收集上清。使用Ni-NAT亲和层析柱对表达的CYB5B蛋白进行纯化，柱子经平衡、上样、淋洗后，使用IO、20、50mM咪唑进行分段洗脱，去除其中的杂蛋白，最后采用IOOmM咪唑洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，表明纯化后的CYB5B重组蛋白具有较高的纯度(图I)，符合抗体制备的要求。实施例2抗人CYB5B多克隆抗体的制备一、CYB5B多克隆抗体的制备和检测取O. 5mL(750ug)的CYB5B重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分混合，取I只新西兰大耳白兔进行背部及腹股沟皮下多点注射。2周后开始加强免疫，加强免疫剂量为500μ gCYB5B重组蛋白，与等体积弗氏不完全佐剂充分混合后皮下注射，每2周一次。第4次加强免疫后7天取血，分离血清。对血液中的抗血清进行滴度检测。取100 μ I (O. Ing)的CYB5B重组蛋白加入96孔板子中，用封口膜覆盖96孔板，4度冰箱中过夜。用TPBS洗三次，加入TPBS 200μ1，放置5分钟，甩去溶液。加200 μ I封闭液(3% BSA in TPBS)，37度温育I小时，用封闭液稀释纯化抗体，在相应孔中各加入100 μ 1，37度温育I小时。用TPBS洗三次，用TPBS按一定比例稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37度温育I小时。用TPBS洗三次，每孔加入ΙΟΟμ I含O. 1% TMB(Sigma公司)和O. 03% H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色lOmin，加50 μ I O. 5Μ硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。结果(图2)表明CYB5B抗血清的滴度为I. 2X 104。对血液中的抗血清进行免疫印迹(Western blot)检测。选择人胃癌细胞BGC823和人肝细胞HuH7全蛋白裂解液作为抗原检测抗血清的特异性。每种蛋白上样约20μ g，使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后立即进行电转移，将蛋白质转移到PVDF膜上，冰浴中350mA恒流转移2小时。杂交过程如下膜以PBST浸湿，加PBST配制5%脱脂奶粉封闭，室温摇床上摇2小时，4°C过夜，PBST洗膜后加入I : 4000稀释的兔抗血清，室温下孵育2小时，洗膜后加入I : 3000的HRP标记的羊抗兔IgG的二抗，孵育I小时，再次PBST洗膜，使用ECL增强型免疫印迹检测试剂盒(RPN2132，GE Healthcare)显色。实验结果(图2)显示，在兔血清中已经成功产生了抗CYB5B蛋白的抗体。CYB5B只在细胞的线粒体上表达，理论上CYB5B抗体只与线粒体发生相互作用。因此取小鼠肝细胞的细胞核、线粒体、溶酶体、过氧物酶体、胞浆作为抗原进行免疫印迹(Western blot)检测，结果(图2)表明CYB5B抗体只与线粒体发生相互作用。二、CYB5B多克隆抗体的纯化与检测称取66Omg CNBR-activated sepharose 4B 柱料(GE healthcare 公司)，用 7Oml冷HCl (ImM)溶解，4度lh。将预处理处理好的柱料先用10倍体积的纯水淋洗，然后用10倍柱体积的 IXcoupling buffer A(O. IM NaHC03、0. 5M NaCl pH8. 3)淋洗。在处理好的柱料中加入IOmg纯化的CYB5B重组蛋白质，在旋转混合仪上混和(4度过夜)。用O. 2M glycine封闭柱子，在旋转混合仪上混合(室温下2小时)，用coupling bufferA与c oupling bufferB (O. IM醋酸纳、O. 5M NaClpH 4. O)交替洗涤柱子4次。取抗血清3ml，然后加入4倍体积的PBS，混匀后加到平衡好的柱料中，在旋转混合仪上混合(4度过夜)。用O. IM glycinepH2. 4洗脱样品，收集样品，然后分别加入3M Tris-HCl pH8.8和5M NaCl中和溶液至中性。对纯化后的CYB5B抗体进行滴度和特异性检测。结果(图2)表明纯化并浓缩后的抗体的滴度为2. I X 105，是纯化前的18倍。免疫印迹(Western blot)结果(图2)表明抗体具有较好的特异性。实施例3线粒体的制备一、磁珠与抗体的连接每100 μ I用ρΗ8的0. IM憐酸缓冲液平衡过的Dynabeads Protein A磁珠(Invitrogen公司)与25 μ g纯化后的抗CYB5B抗体在旋转混合仪上室温混合20分钟。利用磁架使磁珠贴壁，去除液体。用PH8的0. IM磷酸缓冲液洗3次。二、线粒体的富集及纯度检测收集IxlO7个BGC823细胞，使用PBS清洗细胞两次，使用线粒体匀浆液重悬细胞，在冰上匀浆40-60次。收集细胞匀浆溶液，500g离心5分钟，收集上清置于冰上，沉淀使用线粒体匀浆液重悬后再匀浆40-60次，收集上清并合并。合并后上清IOOOg离心10分钟去除细胞核，将连接有抗体的磁珠加入到去除细胞核后的细胞裂解液中，在旋转混合器上4°C混合2小时。然后将离心管置于磁架上2分钟，待磁珠贴壁后去除液体。往离心管中加入
0.5ml线粒体重悬液，在旋转混合器上4°C混合10分钟，然后将离心管置于磁架上2分钟，待磁珠贴壁后去除液体。往离心管中加入0.5ml 2M MgCl2溶液，重悬磁珠，然后将离心管置于磁架上2分钟，待磁珠贴壁后收集溶液，IOOOOg离心10分钟，收集沉淀，然后使用线粒体重悬液重悬线粒体，IOOOOg离心10分钟，沉淀即为纯化后线粒体。取洗脱前磁珠、洗脱得到的线粒体、洗脱后磁珠进行SDS-PAGE检测(图3)，可见线粒体得到充分的洗脱。取洗脱后线粒体通过免疫印迹(Western Blot)来检测线粒体的纯度(图3)，本发明以Prohibitin作为线粒体标志物，以检测线粒体组分；采用Aldehyde reductase作为胞浆提取物，以检测获得的线粒体是否存在胞浆的污染。从图上可见采用免疫磁珠法分离得到的线粒体具有较高的纯度。取洗脱的线粒体使用2. 5%的戊二醛固定48小时，应用透射电镜扫描观察其形状(图3)。结果表明线粒体的完整度和纯度均在90%以上。三、定量纯化得到的线粒体蛋白分别使用30 μ g、60 μ g、120 μ g、240 μ g CYB5B抗体与磁珠结合后纯化线粒体，使用Bradford法测定得到的线粒体蛋白量，从一盘IOcm培养基获得的BGC823和HuH7细胞(I X IO7)分别最多可以提取约41 μ g和46 μ g线粒体蛋白(图4)。实施例4免疫磁珠法与传统差速离心法富集线粒体效果的比较收集2xl07个BGC823细胞，一半细胞使用上述的免疫磁珠法进行纯化线粒体，另一半细胞使用传统差速离心法纯化线粒体，即使用PBS清洗细胞两次，使用线粒体匀浆液重悬细胞，在冰上匀浆40-60次。收集细胞匀浆溶液，500g离心5分钟，收集上清置于冰上，沉淀使用线粒体匀浆液重悬后再匀浆40-60次，收集上清并合并。合并后上清IOOOg离心
10分钟去除细胞核，然后取上清IOOOOg离心20分钟即得到粗提的线粒体。两种方法得到的线粒体分别用裂解液溶解，定量后使用Western Blot检测并比较线粒体的纯度(图5)，选用的线粒体标记物为ATP synthase和Prohibitin。通过ImageQuant ECL的定量计算，对于 BGC823，ATP synthase (233759/47370) = 4. 93, Prohibitin (283200/70057 = 4. 04)；对于 HuH7，ATP synthase (333861/90471) = 3. 69, Prohibitin (388615/123351 = 3. 15)。磁珠亲合纯化法对线粒体的富集效果是传统差速离心法的3-4倍。
实施例5 CYB5B与T0M22在组织表达特异性上的比较对6种小鼠组织心、肝、肾、脾、肺、胃和5种细胞系H9C2、L-02、TRE293、A549、BGC823进行匀浆，通过差速离心法分别提取线粒体，将得到的粗提线粒体用SM尿素溶解，各取10 μ g线粒体蛋白进行WB检测(图6)，分别利用anti-CYB5B (本发明)和anti_T0M22抗体(Sigma公司)检测两种抗原在各个组织中的表达情况。结果显示，CYB5B在各种组织中的表达量均衡，而T0M22存在组织表达特异性。实施例6有效纯化线粒体的最小细胞样品量的确定收集104、105、106个BGC823细胞，分别使用上述的偶联CYB5B抗体的免疫磁珠法提取线粒体。将得到的线粒体裂解、定量后使用WB检测线粒体的有效纯化，利用ATPsynthase β和Τ0Μ20作为线粒体特异标志物(图7)。结果显示，本方法可以从最少IO4细胞中提取到线粒体。
权利要求
1.一种多克隆抗体，其特征在于能够特异结合线粒体外膜蛋白质细胞色素B5异构体B(CYB5B)。
2.权利要求I所述的多克隆抗体，其免疫原含有下述氨基酸残基之一 1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列中任意连续14个(或以上)氨基酸的多肽片段；3)与序列表中SEQID NO :2序列中任意连续14个氨基酸的相似性大于80%的多肽片段。
3.权利要求I所述的多克隆抗体，其在利用抗原抗体结合的方法纯化线粒体蛋白质中的应用。
4.权利要求I所述的多克隆抗体，将其偶联到一个固相载体上纯化线粒体的应用。
5.权利要求I所述的多克隆抗体，其作为免疫学试剂进行抗原抗体反应的用途。
6.一种免疫磁珠(CYB5B磁珠)，其特征在于磁珠上偶联有权利要求I所述的多克隆抗体。
7.含有权利要求6所述的免疫磁珠，其用于抗原抗体结合的用途。
8.含有权利要求6所述的免疫磁珠，其用于纯化线粒体的用途。
9.一种纯化线粒体的方法，其特征在于使用权利要求6所述的免疫磁珠特异结合生物样品中的线粒体蛋白质CYB5B。
全文摘要
本发明涉及一种特异性针对人线粒体外膜蛋白细胞色素B5异构体B(Cytochrome b5 type B，CYB5B)的多克隆抗体，以及利用固化CYB5B抗体的免疫磁珠(CYB5B磁珠)从细胞中提取线粒体。具体地说，经抗原亲和层析纯化的CYB5B抗体可以特异地识别各种组织和器官中的线粒体，而几乎不与其它细胞器发生作用。纯化的CYB5B抗体与磁珠材料相结合可产生CYB5B磁珠。利用CYB5B磁珠可以从少量细胞中提取到完整的线粒体(细胞数目≥104)。本发明特别适合于从实验室培养的细胞中制备线粒体。较之传统差速离心法，本方法的富集效果提高了3-4倍。
文档编号C07K16/18GK102827276SQ201110158700
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者不公告发明人 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司