专利名称：茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法
技术领域：
本发明涉及茶叶深加工技术领域，具体涉及茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法。
背景技术：
茶鲜叶是茶树顶端新梢的总称，经过不同加工后形成不同品质特征的成品茶。茶鲜叶是形成茶叶品质的物质基础，茶鲜叶质量的高低和制茶技术的是否合理共同决定了成
品茶得质量。茶鲜叶中的主要营养成分之一是儿茶素类，儿茶素又称茶单宁，和咖啡因同属茶叶中的两大重要机能性成分，但是又以儿茶素为茶汤中最主要的成分。儿茶素类属于多元酚类中的一种，又称黄烷醇类，是茶叶中最主要的多元酚类成分，约占茶中多元酚类成分总含量的75 80%。占茶青的12 26%
儿茶素对人类健康有着积极的作用，儿茶素包括酯型儿茶素和简单儿茶素，其主要成分有:EGCG(epigallocatechin gallate), EGC(epigallocatechin), ECG(epicatechin gallate),EC(epicatechin)和catchin。酯型儿茶素是茶鲜叶茶多酚中主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占儿茶素的70%左右，其中有两个主要的成分L-表型没食子酸儿茶素没食子酸酯(L-EGCG)和L-表型儿茶素没食子酸酯(L-ECG)。酯型儿茶素是茶鲜叶中最有效的抗氧化多酚，具有抗氧化、抗癌、抗突变等活性。抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍，能够保护细胞和DNA受损害，这种损害相信与癌症、心脏疾病和其他重大疾病有关，酯型儿茶素的这些功效归结于他们对氧自由基的清除 (抗氧化)能力。因此，酯型儿茶素又被认定是儿茶素中活性最大的一种单体，也是茶鲜叶的主要活性成分。儿茶素有溶剂萃取法、离子沉淀法和吸附法等多种提取方法。在各种提取工艺过程中，溶剂热提取均为必要阶段，但此工艺提取时间长，温度高，茶多酚尤其是儿茶素易于氧化生成茶色素，并进一步与体系中咖啡因、蛋白质生成茶乳酪。本发明提供一种提高茶鲜叶中酯型儿茶素提取效果的提取方法，在乙酸乙酯搅拌提取茶鲜叶酯型儿茶素的过程中，加入液氮，使茶鲜叶中酯型儿茶素的提取效果提高。
发明内容
本发明的目的在于提供茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，本发明能提高茶鲜叶中酯型儿茶素的提取效果，具体技术方案如下。茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，包括如下步骤
(1)在乙酸乙酯为萃取溶剂的条件下，按料液比为1:20-1:40g/mL的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到搅拌器中，再加入液氮，使搅拌时温度维持在0-10°C，搅拌时间为 1-2. 5min ；
(2)搅拌结束后用滤纸过滤，得儿茶素提取液，定容，置于2-10°C冷藏保存。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)之前还包括采集茶鲜叶，采集后置于2-10°C冰箱冷藏备用。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中，所述茶鲜叶为华南农业大学绿茶茶鲜叶，茶鲜叶中水分质量含量为67. 57%，干物质占总质量的 32. 43%ο上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中，料液质量比为l:35g/mL。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中所述搅拌时维持的温度为5°c。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中所述搅拌时间为anin。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中，所述乙酸乙酯为分析纯乙酸乙酯。上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是，步骤(1)中所述搅拌速度为200(Γ4000转/分。所述液氮为广州市深华实验仪器设备有限公司的液氮。本发明用酒石酸亚铁法进行比色法测定茶多酚含量的步骤是吸取试液lmL，注入25mL的容量瓶中，加蒸馏水4mL和酒石酸亚铁溶液5mL (称取硫酸亚铁(GB664) 1. 0g，酒石酸钾钠(GB1288) 5. Og,加水溶解并定至1L)，充分混合，再加pH7. 5磷酸盐缓冲液(a液 l/15mol/L的磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠(GB1263)23. 877g，加水溶解并稀释至1L。 b液l/15molL/的磷酸二氢钾溶液称取经110°C烘干2h的磷酸二氢钾(GB1274)9. 073g, 加水溶解至IL。取a液85ml和b液15mL混勻，即得pH7. 5的缓冲液。)至刻度，用Imm比色杯，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。茶多酚(%)= (A XL 957 X 2)/1000 X L1/(L2 X M0 Xm) XlOO公式 1
其中=L1——试液的总质量，mL ;L2——测定时的用液量，mL ；M0——试样的质量，g ； m——试样干物质含量，% ；A——试样的吸光度
本发明用HPLC快速测定儿茶素提取液酯型儿茶素含量的步骤是采用C18色谱柱，紫外检测器(280nm),流动相为水甲醇乙酸=73 23 2，流速1. Oml/min的等度洗脱。进样量20μ L。吸取一定量的各儿茶素标准溶液，混勻后，得混合标准溶液，再逐级稀释得到一系列不同浓度的混合标准溶液。依上述操作，分别注人混合标准溶液，利用外标法得出各儿茶素标准品的标准曲线。然后把儿茶素提取液过膜进样，得出峰面积，根据各儿茶素标准品的标准曲线算出儿茶素提取液的酯型儿茶素含量。与现有技术相比，本发明具有以下优点
(1)本方法采用液氮低温提取酯型儿茶素，解决了高温提取是酯型儿茶素易被多酚氧化酶和过氧化氢氧化的问题。(2)氮气作为惰性气体可以很好的隔绝空气中的氧气，起到保鲜作用可减缓酯型儿茶素的氧化反应。本发明提取条件温和易于控制，步骤简单，所需设备少，提取时间短，易于操作，成本较低。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的实施作进一步详细说明，但本发明的实施不限于此。实施例1
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1:35的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000
转/分。对比例1 称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈钢搅拌器当中，不加入液氮，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000转/分。分别对实施例1和对比例1所得的两种提取液过滤，得儿茶素提取液，用蒸馏水定容。分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例1和对比例1的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为20. 75%。不加液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为7. 75%，少了 13%。分别用HPLC快速测定法测定实施例1和对比例1的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为9. 83%。不加液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为5. 75%，少了 4. 08%。实施例2
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000
转/分。对比例2 称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈钢搅拌器当中，加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000转/分。分别对实施例2和对比例2所得的两种提取液过滤，得儿茶素提取液并分别用蒸馏水和乙酸乙酯定容。分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例2和对比例2的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为20. 75%。 液氮乙酸乙酯提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为23. 06%，提高了 2. 31%。分别用HPLC快速测定法测定实施例2和对比例2的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为9. 83%。液氮乙酸乙酯提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为10. 96%，提高了 1. 13%。实施例3
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:v，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈钢搅拌器当中，在加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000转/分。对比例3 称取新鲜茶鲜叶，按照料液比(W: V，g/mL) 1 :35，提取温度80°C，用蒸馏水水浴提取，提取时间为20min。分别对实施例3和对比例3所得的两种提取液过滤，得儿茶素提取液并分别用蒸馏水定容。
分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例3和对比例3的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为20. 21%。液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为20. 75%，提高了 0. 54%0分别用HPLC快速测定法测定实施例3和对比例3的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为7. 03%。液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为9. 83%，提高了 2. 83%。实施例4
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:v，g/mL)为1 :40的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000
转/分。对实施例4所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例4的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例4的儿茶素提取液的茶多酚含量为21. 23%。用HPLC快速测定法测定实施例4的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 4的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为9. 23%。实施例5:
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:v，g/mL)为1 :40的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000转/分。对实施例5所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例5的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例5的儿茶素提取液的茶多酚含量为19. 23%。用HPLC快速测定法测定实施例5的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 5的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为8. 92%。实施例6
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为lmin，搅拌速度为4000
转/分。对实施例6所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例6的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例6的儿茶素提取液的茶多酚含量为18. 23%。用HPLC快速测定法测定实施例6的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 6的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为7. 92%。实施例7
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:v，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2. 5min,搅拌速度为 4000转/分。对实施例7所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例7的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例7的儿茶素提取液的茶多酚含量为22. 75%。用HPLC快速测定法测定实施例7的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 7的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为10. 54%0实施例8
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，加入液氮，使搅拌温度维持在10°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为4000转/分。对实施例8所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例8的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例8的儿茶素提取液的茶多酚含量为22. 34%。用HPLC快速测定法测定实施例8的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 8的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为10. 12%。实施例9
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:V，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器当中，再加入液氮，使搅拌温度维持在0°C，搅拌时间为aiiin，搅拌速度为4000
转/分。对实施例9所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用乙酸乙酯定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例9的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例8的儿茶素提取液的茶多酚含量为20. 34%。用HPLC快速测定法测定实施例9的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例 9的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为9. 12%。实施例10
称取新鲜茶鲜叶，按料液比(W:v，g/mL)为1 :35的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈钢搅拌器当中，在加入液氮，使搅拌温度维持在5°C，搅拌时间为2min，搅拌速度为2000转/分。对实施例10所得的提取液过滤，得儿茶素提取液，用蒸馏水定容。用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例10的儿茶素提取液的茶多酚含量，根据公式1，得出实施例10的儿茶素提取液的茶多酚含量为15. 75%。用HPLC快速测定法测定实施例10的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量，得出实施例10的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为7. 12%。
权利要求
1.茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是(1)在乙酸乙酯为萃取溶剂的条件下，按料液质量体积比(g/mL)为1:20-1:40的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器中，再加入液氮，使搅拌时温度维持在0-10°C，搅拌时间为1-2. 5min ；(2)搅拌结束后用滤纸过滤，得儿茶素提取液，定容，置于2-10°C冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)之前还包括采集茶鲜叶，采集后置于2-10°C冰箱冷藏备用。
3.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)中， 所述茶鲜叶为华南农业大学绿茶茶鲜叶，茶鲜叶中水分含量为67. 57%，干物质占总质量的 32. 43%ο
4.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)中，料液质量体积比(g/mL)为1:35。
5.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)中，搅拌温度为5°C。
6.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)中，搅拌时间为anin。
7.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，其特征是，步骤(1)中，所述乙酸乙酯为分析纯乙酸乙酯。
8.根据权利要求1所述的茶鲜叶中酯型儿茶素的的提方法，其特征是，步骤(1)中，所述液氮为广州市深华实验仪器设备有限公司的液氮。
全文摘要
本发明提供茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，在乙酸乙酯为萃取溶剂的条件下，按料液重量体积比为1:20-1:40的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不锈钢搅拌器中，再加入液氮，使搅拌时温度维持在0-10℃，搅拌时间为1-2.5min；搅拌结束后用滤纸过滤，得儿茶素提取液，定容，置于2-10℃冷藏保存。与未加入液氮提取的茶多酚和酯型儿茶素含量相比较得出，加入液氮后提取的茶多酚和酯型儿茶素含量增加。本发明可以显著提高酯型儿茶素的提取效果，且方法步骤简单，成本较低，提取时间短，易于操作。
文档编号C07D311/62GK102304115SQ20111023919
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者尹文颖, 王娟, 邓志汇, 黄惠华 申请人:华南理工大学