专利名称：一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法
技术领域：
本发明属于生物材料检测技术领域，具体涉及一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。
背景技术：
茶树中酯型儿茶素主要有表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，非酯型儿茶素主要有表儿茶素(EC)和表没食子儿茶素(EGC)；结构上，酯型儿茶素(表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))是在非酯型儿茶素(表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC))结构的3-0H位置上和没食子酸(GA)形成的酸酯。茶树中酯型儿茶素含量较高，为茶多酚总量的55%左右，为鲜叶干物重的 12%-19% [1]。酯型儿茶素比非酯型儿茶素具有更强的药用价值[2_3]，酯型儿茶素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多种药理活性，对帕金森疾病也有一点的疗效M。除此之外，酯型儿茶素还是决定茶叶饮料品质的关键因子之一 M。酯型儿茶素人工合成难度较大，茶叶依旧是酯型儿茶素的主要来源[5]。植物体内的非酯型儿茶素的生物合成途径较为清晰，涉及的主要催化酶有二氢黄酮醇4-还原酶、无色花色素还原酶、花青素合成酶、花青素还原酶等"^]。酯型儿茶素合成是类黄酮生物合成途径中的关键一环，而酯型儿茶素生物合成途径一直是的未解之谜M。本申请人首次利用薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MQ技术，从茶树中鉴定了一种能催化酯型☆成的(epicatechin: 1-0-galloyl- -D-glucose 0-galIoyltransferase, ECGT)，在它的催化下，1-0-没食子酰-β-D-葡萄糖(i3G)和非酯型儿茶素(表儿茶素 (EC)或表没食子儿茶素(EGC))反应形成相应的酯型儿茶素(表儿茶素没食子酸酯(ECG) 或表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))。本申请人利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和凝胶过滤层析对该酶进行了初步纯化。迄今为止，尚无酯型儿茶素合成酶的酶活检测方法的文献报道。
发明内容
在首次发现并鉴定茶树酯型儿茶素合成酶存在的基础上，本发明提供一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。实现上述的目的的技术解决方案如下
一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法包括以下操作步骤 1.1、酶液制备
取2克茶树鲜叶，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 0. 5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液溶液和^iiL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4°C条件下研磨成勻浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4°C条件下，离心分离 15分钟，取上清液，即得浓度1. 2mg/mL的酶液；
41. 2、酶活性的测定
1.2. 1、反应液的制备
总体积为1. 5mL的反应液包括下列原料
酶液1. 2mg/mL的酶液、
抗氧化剂20 mmol/L的抗坏血酸溶液、
水解抑制剂30. 4 mmol/L的水杨酸溶液、
反应底物3. 8 mmol/L的表没食子儿茶素(EGC)溶液或3. 8 mmol/L的表儿茶素(EC) 溶液、
9. 6 mmol/L的1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖(β G)溶液、 缓冲液0. 1 mol/L、ρΗ=6· 0的磷酸缓冲液，
将0. 46mL酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、0. 15mL反应底物表儿茶素(EC) 溶液或0. 15mL表没食子儿茶素(EGC)、溶液0. 075mL反应底物1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖(0G)溶液和0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得反应液； 1. 2. 2、对照液的制备反应液包括下列原料 酶液温度100°C煮沸5分钟的酶液、 抗氧化剂20 mmol/L的抗坏血酸溶液、 水解抑制剂30. 4 mmol/L的水杨酸溶液、
反应底物3. 8 mmol/L的表没食子儿茶素(EGC)溶液或3. 8 mmol/L的表儿茶素(EC) 溶液、
9. 6 mmol/L的1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖(β G)溶液、 缓冲液0. 1 mol/L、pH=6. 0的磷酸缓冲液；
将0. 46mL的温度100 °C煮沸5分钟的酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、 0. 15mL反应底物表没食子儿茶素(EGC)溶液或0. 15mL表儿茶素(EC)溶液、0. 075mL反应底物1-0-没食子酰-β -D-葡萄糖(β G)溶液和0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得对照液；
1. 2. 3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备在反应液和对照液中，分别加入3mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别60°C减压浓缩10分钟，分别用甲醇溶解并定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；
1.2. 4、酶反应产物的高效液相色谱(HPLC)分析
采用高效液相色谱技术分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)的含量；在反应甲醇液中检测到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)，而在对照甲醇液中检测不到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)，即可以证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素合成酶酶活。 利用酶活计算方法，计算酯型儿茶素合成酶活力，即以在30°C下每分钟每毫克酶催化形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)的量，单位为mg/分钟/毫克蛋白；
酯型儿茶素合成酶酶活=Δ m/60分钟/0. 55毫克蛋白，
上式中Am表示60分钟内形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)的量；60分钟表示酶反应60分钟；0. 55毫克蛋白表示1. 5mL反应液中加入酶含量。本发明方法具有以下几方面的优点
1、该方法操作简单，不需要纯化酶提取液；
2、准确性强、灵敏度高，能够准确检测到酯型儿茶素合成酶反应产物，证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素水解酶酶活；
3、操作方便，检测时间短，检测时间在2-3小时即可完成，避免了繁琐的实验操作；
4、酯型儿茶素合成酶酶活检测方法的建立为后续酯型儿茶素合成酶的分离纯化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆及其功能验证奠定坚实的实验技术基础；并对开展儿茶素生物合成的代谢基因工程研究，开拓茶树育种新途径以及改善茶叶品质均具有重要理论价值。
图1为反应底物为表没食子儿茶素(EGC)的酯型儿茶素合成酶反应产物的高效液相色谱图(上反应体系，下反应对照)。图2为反应底物为表儿茶素(EC)的酯型儿茶素合成酶反应产物的高效液相色谱图(上反应体系，下反应对照)。图3为酯型儿茶素合成酶反应的底物EGC最适浓度图。图4为酯型儿茶素合成酶反应的底物β G最适浓度图。图5为酯型儿茶素合成酶反应的最适ρΗ图。图6为酯型儿茶素合成酶反应的最适反应时间图。图7为酯型儿茶素合成酶反应的最适温度图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地说明。实施例1:
主要设备1.高效液相色谱仪(HPLC) ；2.恒温水浴锅；3.旋转蒸发仪；4.离心机； 5. ρΗ 计；
材料与试剂
1、被检测材料茶树鲜叶(_80°C保存备用)；
2、主要试剂
(1)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，购于上海索莱宝生物科技有限公司，用来吸附酶液中的多酚类物质，保持酶蛋白的较高活性；
(2)石英砂(市售)增加摩擦力，提高酶蛋白的提取率；
(3)0. 1 mol/L ρΗ7· 4 磷酸缓冲液
A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2Η20) 7. 8克，溶解于500mL的蒸馏水中； B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 3H20) 17. 9克，溶解于500mL的蒸馏水中，备用；
6临用前，取A溶液或B溶液一定体积，互调pH值到7. 4，即为0.1 mol/L pH7. 4磷酸缓冲液。4°C保存备用；
(4)0. 1 mol/L pH 6. 0 磷酸缓冲液
A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H20) 7. 8克，溶解于500mL的蒸馏水中； B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 3H20) 17. 9克，溶解于500mL的蒸馏水中，备用； 临用前，取A溶液或B溶液一定体积，互调pH值到6. 0，即为0. 1 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液。4°C保存；
(5)20 mmol/L抗坏血酸(购于武汉市金诺化工有限公司)溶液称取0. 0605毫克抗坏血酸，加入25mL蒸馏水，振荡至完全溶解，4°C以下保存备用；
(6)3.8 mmol/L表没食子儿茶素(EGC)(购于上海融禾医药有限公司)溶液称取 0.0023克EGC溶于2mL水中，4°C以下保存备用；
(7)9. 7 mmol/L 1_0_没食子酰-β-D-葡萄糖(β G，购于香港先进技术工业有限公司)溶液称取0.0012克1-0-没食子酰-β-D-葡萄糖溶于ImL水中，4°C以下保存备用；
(8)30. 4 mmol/L水杨酸(购于上海华壹生物科技有限公司)溶液称取0. 0042克水杨酸溶于ImL水中，40C以下保存备用。 一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法包括以下操作步骤 1. 1、酶液制备
称2克茶树鲜叶，加入液氮后，快速研磨成粉末状，在加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 0. 5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液和2mL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4°C条件下研磨成勻浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4°C条件下，离心分离15 分钟，取上清液，即得1. 2mg/mL酶液； 1. 2、酶活性的测定 1.2. 1、反应液的制备总体积为1. 5mL反应液包括下列原料 酶液1. 2mg/mL酶液、 抗氧化剂20 mmol/L抗坏血酸溶液、 水解抑制剂30. 4 mmol/L水杨酸溶液、 反应底物3. 8 mmol/L表没食子儿茶素(EGC)溶液、 9. 6 mmol/L 1-0-没食子酰-β -D-葡萄糖(β G)溶液、 缓冲液0. 1 mol/L pH=6. 0磷酸缓冲液，
将0. 46mL的酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、0. 15mL反应底物表没食子儿茶素(EGC)溶液、0. 075mL反应底物1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖溶液和0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得反应液；
表没食子儿茶素(EGC)和1-0-没食子酰- β -D-葡萄糖结构式分别如下
1. 2. 2、对照液的制备
反应液包括下列原料
酶液100°C煮沸5分钟的酶液、
抗氧化剂20 mmol/L抗坏血酸溶液、
水解抑制剂30. 4 mmol/L水杨酸溶液、反应底物3. 8 mmol/L表没食子儿茶素(EGC)溶液、 9. 6 mmol/L 1-0-没食子酰-β -D-葡萄糖(β G)溶液、 缓冲液0. 1 mol/L pH=6. 0磷酸缓冲液、
将0. 46mL的100°C煮沸5分钟的酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、0. 15mL反应底物表没食子儿茶素(EGC)溶液、0.075mL反应底物1-0-没食子酰-β-D-葡萄糖(β G) 溶液和0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得对照液； 1. 2. 3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备
在反应液和对照液中，分别加入3mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别60°C减压浓缩10分钟，分别用甲醇溶解并定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；
1. 2. 4、酶反应产物的高效液相色谱分析
利用公知的高效液相色谱技术(HPLC)分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量。在反应甲醇液中检测到表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)，而在对照甲醇液中检测不到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，即可以证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素合成酶酶活。
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)结构式如下
权利要求
1. 一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法，其特征在于包括以下操作步骤1.1、酶液制备取2克茶树鲜叶，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 0. 5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液溶液和^iiL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4°C条件下研磨成勻浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4°C条件下，离心分离 15分钟，取上清液，即得浓度1. 2mg/mL的酶液； 1. 2、酶活性的测定1.2.1、反应液的制备总体积为1. 5mL的反应液包括下列原料 酶液1. 2mg/mL的酶液抗氧化剂20 mmol/L的抗坏血酸溶液水解抑制剂30. 4 mmol/L的水杨酸溶液反应底物3. 8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3. 8 mmol/L的表儿茶素溶液、 9. 6 mmol/L的1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖溶液缓冲液0. 1 mol/L、ρΗ=6· 0的磷酸缓冲液将0. 46mL酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、0. 15mL反应底物表儿茶素溶液或0. 15mL表没食子儿茶素、溶液0. 075mL反应底物1_0_没食子酰- β -D-葡萄糖溶液和 0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得反应液； 1. 2. 2、对照液的制备反应液包括下列原料 酶液温度100°C煮沸5分钟的酶液抗氧化剂20 mmol/L的抗坏血酸溶液水解抑制剂30. 4 mmol/L的水杨酸溶液反应底物3. 8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3. 8 mmol/L的表儿茶素溶液、 9. 6 mmol/L的1_0_没食子酰-β -D-葡萄糖溶液缓冲液0. 1 mol/L、pH=6. 0的磷酸缓冲液将0. 46mL的温度100°C煮沸5分钟的酶液、0. 3mL抗氧化剂、0. 074mL水解抑制剂、 0. 15mL反应底物表没食子儿茶素溶液或0. 15mL表儿茶素溶液、0. 075mL反应底物1_0_没食子酰- β -D-葡萄糖溶液和0. 59mL磷酸缓冲液混合均勻，温度30°C水浴反应60分钟，得对照液；1. 2. 3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备在反应液和对照液中，分别加入3mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别60°C减压浓缩10分钟，分别用甲醇溶解并定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；1. 2. 4、酶反应产物的高效液相色谱分析采用高效液相色谱技术分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的含量；在反应甲醇液中检测到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，而在对照甲醇液中检测不到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，即可以证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素合成酶酶活。
2.根据权利要求1所述的一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法，其特征在于 利用酶活计算方法，计算酯型儿茶素合成酶活力，即以在30°C下每分钟每毫克酶催化形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的量，单位为mg/分钟/ 毫克蛋白；酯型儿茶素合成酶酶活=Δ m/60分钟/0. 55毫克蛋白，上式中Am表示60分钟内形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的量；60分钟表示酶反应60分钟；0. 55毫克蛋白表示1. 5mL反应液中加入酶含量。
全文摘要
本发明涉及一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。本发明包括酶液的制备、反应液制备、对照液制备、酶活性的检测、酶活力的计算五个步骤。其中利用高效液相色谱法检测酶反应产物酯型儿茶素来检测酶活性，在反应体系中加入抗氧化剂和水解酶抑制剂可以避免氧化酶和酯型儿茶素水解酶对酶活性检测的干扰。本发明方法简单，准确性强、灵敏度高，能够准确检测到酯型儿茶素合成酶反应产物；操作方便，检测时间短，避免了繁琐的实验操作，检测时间在2-3小时即可完成。
文档编号C12Q1/25GK102174639SQ20111004617
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘亚军, 刘莉, 夏涛, 高丽萍 申请人:安徽农业大学