专利名称：一种酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法
技术领域：
本发明属于生物材料检测技术领域，具体涉及一种酯型儿茶素水解酶酶活的检测方法。
背景技术：
茶树中的儿茶素不仅是茶树重要的次生代谢成分，也是构成茶叶滋味的品质成分。同时临床研究表明，儿茶素是茶饮料中重要的功能成分，具有降血脂、降血压、增强免疫力、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性，因此成为医药与食品研究的热点[h]。儿茶素属于类黄酮中的黄烷3-醇类物质，根据3-0H位置上是否连接没食子基团， 可以分为酯型和非酯型儿茶素两类。酯型儿茶素包括表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，非酯型儿茶素包括儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素 (GC)和表没食子儿茶素(EGC)。从结构上看，酯型儿茶素是非酯型儿茶素和没食子酸形成的酯M。许多研究表明，植物体内的非酯型儿茶素(黄烷3-醇类)的生物合成途径较为清晰，主要涉及的催化酶有苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羟化酶、4-香豆酰CoA连接酶、查耳酮合成酶、查耳酮异构酶、黄烷酮3-羟化酶、类黄酮3’-羟化酶、类黄酮3’，5’-羟化酶、二氢黄酮醇4-还原酶、无色花色素还原酶、花青素合成酶、花青素还原酶等[7_1(1]。本发明的申请人首次利用薄层层析、高效液相色谱、液质联用技术，从茶树中鉴定了一种能催化酯型儿茶素水解的酶类(Galloylated Catechins Hydrolase, GCH)，在它的催化下，酯型儿茶素发生水解反应，生成没食子酸和非酯型儿茶素。并利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和凝胶过滤层析对该酶进行了初步纯化。迄今为止，尚无酯型儿茶素水解酶检测方法的文献报道。酯型儿茶素水解酶酶活检测方法的建立为后续酯型儿茶素水解酶的分离纯化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆及其功能验证奠定坚实的实验技术基础，以及为今后茶叶品种改良、改善茶叶品质具有重要理论价值。
发明内容
为了解决酯型儿茶素水解酶的分离纯化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆及其功能验证奠定坚实的实验技术基础，本发明提供一种茶树酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法。实现上述目的的技术解决方案如下
一种酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法包括以下操作步骤 1.1、酶液制备
称2克茶树鲜叶，加入液氮后，快速研磨成粉末状，在加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 0. 5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液溶液和^iiL浓度20mmol/L的抗坏血酸溶液，温度4°C条件下，研磨成勻浆，在离心机速度为12000转/分钟、4°C条件下离心15 min，取上清液，得1. 2mg/mL酶液；
41. 2、酶活性的测定
1.2. 1、反应液的制备
反应液包括下列原料
酶提取液1.2mg/mL酶液
缓冲液0. 1 mol/L ρΗ6· 5磷酸缓冲液
抗氧化剂40mmol/L抗坏血酸
反应底物4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶液或没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)溶液或表儿茶素没食子酸酯(ECG)溶液；
将0. 33mL的酶液、0. 25mL抗氧化剂、0. 125mL反应底物表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)溶液或没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)溶液或表儿茶素没食子酸酯(ECG)溶液和1. 795mL磷酸缓冲液，混勻，置于30°C水浴中反应30min，得反应液； 1. 2. 2、对照液的制备对照液包括下列原料 酶提取液100°C煮沸5分钟的酶液缓冲液0. 1 mol/L ρΗ6· 5磷酸缓冲液抗氧化剂40mmol/L抗坏血酸溶液
反应底物4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶液或没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)溶液或表儿茶素没食子酸酯(ECG)溶液；
将0. 33mL 100°C煮沸5min的酶液、0. 25mL抗氧化剂、0. 125mL反应底物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶液或没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)溶液或表儿茶素没食子酸酯 (ECG)溶液和1.795mL磷酸缓冲液，混勻后置于30°C水浴中反应30min，得对照液； 1. 2. 3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备
在反应液和对照液中，分别加入5mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别在温度60°C减压浓缩10分钟，再分别用甲醇溶解，并分别定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液； 1.2. 4、酶反应产物的高效液相色谱(HPLC)分析
利用儿茶素公知的高效液相色谱技术检测反应甲醇液和对照甲醇液中表儿茶素(EC) 或表没食子儿茶素(EGC)或没食子儿茶素(GC)的含量；在反应甲醇液中检测到酶反应产物表儿茶素(EC)或表没食子儿茶素(EGC)或没食子儿茶素(GC)，而在对照甲醇液中检测不到酶反应产物表儿茶素(EC)或表没食子儿茶素(EGC)或没食子儿茶素(GC)，即可以证明检测到茶树鲜叶中酯型儿茶素水解酶酶活。 利用酶活计算方法，计算酯型儿茶素水解酶活力，即以在30°C下每分钟每毫克酶催化形成的酶产物表儿茶素(EC)或表没食子儿茶素(EGC)或没食子儿茶素(GC)的量，单位为mg/分钟/毫克蛋白；
酯型儿茶素水解酶酶活=Δ m/30分钟/0. 40毫克蛋白
式中Am表示30分钟内形成的酶产物表儿茶素(EC)或表没食子儿茶素(EGC)或没食子儿茶素(GC)的量；30分钟表示酶反应30分钟；0. 40毫克蛋白表示2. 5mL反应液中加入酶含量。
本发明的有益技术效果体现在以下几方面
1、本发明的检测方法简单，不需要纯化酶提取液；
2、本发明方法的检测结果准确性强、灵敏度高，能够准确检测到酯型儿茶素水解酶反应产物，证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素水解酶酶活；
3、操作方便，检测时间短，在1-2小时即可完成检测，避免了繁琐的实验操作；
4、酯型儿茶素水解酶酶活检测方法的建立为后续酯型儿茶素水解酶的分离纯化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆及其功能验证奠定坚实的实验技术基础，以及为今后茶叶品种改良、改善茶叶品质具有重要理论价值。
图1为反应底物为表儿茶素没食子酸酯(ECG)的酯型儿茶素水解酶反应产物的高效液相色谱图(上反应体系，下反应对照)。图2为反应底物为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的酯型儿茶素水解酶反应产物的高效液相色谱图(上反应体系，下反应对照)。图3为反应底物为没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)的酯型儿茶素水解酶反应产物的高效液相色谱图(上反应体系，下反应对照)。图4为酯型儿茶素水解酶反应的最适反应温度图。图5为酯型儿茶素水解酶反应的最适pH图。图6为酯型儿茶素水解酶反应的最适反应时间图。图7为酯型儿茶素水解酶反应的最适底物EGCG浓度图。
具体实施例方式下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。实施例1
主要设备1.高效液相色谱仪(HPLC) ；2.恒温水浴锅；3.旋转蒸发仪；4.离心机； 5. pH 计。材料与试剂
1.被检测材料茶树鲜叶(_80°C保存备用)；
2.主要试剂
(1)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)购于上海索莱宝生物科技有限公司。用来吸附沉淀粗酶液中的多酚类物质，保持酶蛋白的较高活性；
(2)石英砂(市售)增加摩擦力，提高酶蛋白的提取率；
(3)0.1 mol/L pH7.4 磷酸缓冲液
A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H20) 7. 8克，溶解于500mL的蒸馏水中； B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 3H20) 17. 9克，溶解于500mL的蒸馏水中，备用； 临用前，取A溶液或B溶液一定体积，互调pH值到7. 4，即为0.1 mol/L pH7. 4磷酸缓冲液。4°C保存备用；
(4)0. 1 mol/L pH 6. 5 磷酸缓冲液
A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H20) 7. 8克，溶解于500mL的蒸馏水中；
6B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 3H20) 17. 9克，溶解于500mL的蒸馏水中，备用； 临用前，取A溶液或B溶液一定体积，互调pH值到6. 5，即为0. 1 mol/L pH6. 5磷酸缓冲液。(4°C保存)
(5)40mmol/L抗坏血酸(购于武汉市金诺化工有限公司)溶液称取0. 007克抗坏血酸，加入ImL蒸馏水，振荡至完全溶解，4°C保存；
(6)4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(购于上海融禾医药有限公司)溶液称取0. 0018克EGCG，加入ImL蒸馏水，振荡至完全溶解，4°C放置保存。 一种酯型儿茶素水解酶的活性检测方法包括以下操作步骤 1. 1、酶液制备
称2克茶树鲜叶，加入液氮后，快速研磨成粉末状，在加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 0. 5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液溶液和2mL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4°C条件下研磨成勻浆，在离心机速度为15000g、4°C条件下离心15 min，取上清液，得1. 2mg/mL酶液； 1. 2、酶活性的测定 1.2. 1、反应液的制备
总体积为2. 5mL酯型儿茶素水解酶反应体系包括下列原料酶液1. 2mg/mL酶液抗氧化剂40mmol/L抗坏血酸溶液
反应底物4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶液缓冲液0. 1 mol/L ρΗ6· 5磷酸缓冲液
将0. 33mL的酶液、0. 25mL抗氧化剂、0. 125mL反应底物表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)溶液和1. 795mL磷酸缓冲液，混勻后置于30°C水浴中反应30min，得反应液； 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)结构式如下
权利要求
1. 一种酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法，其特征在于包括以下操作步骤1.1、酶液制备称2克茶树鲜叶，加入液氮后，快速研磨成粉末状，在加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.5克石英砂、18mL预冷的0. 1 mol/L pH 7. 4的磷酸缓冲液溶液和^iiL浓度20mmol/L的抗坏血酸溶液，温度4°C条件下，研磨成勻浆，在离心机速度为12000转/分钟、4°C条件下离心15 min，取上清液，得1. 2mg/mL酶液；1. 2、酶活性的测定1.2.1、反应液的制备反应液包括下列原料 酶提取液1.2mg/mL酶液缓冲液0. 1 mol/L ρΗ6· 5磷酸缓冲液抗氧化剂40mmol/L抗坏血酸反应底物4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯溶液或没食子儿茶素没食子酸酯溶液或表儿茶素没食子酸酯溶液；将0. 33mL的酶液、0. 25mL抗氧化剂、0. 125mL反应底物表没食子儿茶素没食子酸酯溶液或没食子儿茶素没食子酸酯溶液或表儿茶素没食子酸酯溶液和1. 795mL磷酸缓冲液，混勻，置于30°C水浴中反应30min，得反应液； 1. 2. 2、对照液的制备对照液包括下列原料 酶提取液100°C煮沸5分钟的酶液缓冲液0. 1 mol/L ρΗ6· 5磷酸缓冲液抗氧化剂40mmol/L抗坏血酸溶液反应底物4mmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯溶液或没食子儿茶素没食子酸酯溶液或表儿茶素没食子酸酯溶液；将0. 33mL 100°C煮沸5min的酶液、0. 25mL抗氧化剂、0. 125mL反应底物表没食子儿茶素没食子酸酯溶液或没食子儿茶素没食子酸酯溶液或表儿茶素没食子酸酯(ECG)溶液和1.795mL磷酸缓冲液，混勻，置于30°C水浴中反应30min，得对照液；1. 2. 3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备在反应液和对照液中，分别加入5mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别在温度60°C减压浓缩10分钟，再分别用甲醇溶解，并分别定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；1.2. 4、酶反应产物的高效液相色谱分析利用儿茶素公知的高效液相色谱技术检测反应甲醇液和对照甲醇液中表儿茶素或表没食子儿茶素或没食子儿茶素的含量；在反应甲醇液中检测到酶反应产物表儿茶素或表没食子儿茶素或没食子儿茶素，而在对照甲醇液中检测不到酶反应产物表儿茶素或表没食子儿茶素或没食子儿茶素，即可以证明检测到茶树鲜叶中酯型儿茶素水解酶酶活。
2.根据权利要求1所述的一种酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法，其特征在于利用酶活计算方法，计算酯型儿茶素水解酶活力，即以在30°C下每分钟每毫克酶催化形成的酶产物表没食子儿茶素或表儿茶素或没食子儿茶素的量，单位为mg/分钟/毫克蛋白；酯型儿茶素水解酶酶活=Δ m/30分钟/0. 40毫克蛋白式中Am表示30分钟内形成的酶产物表没食子儿茶素或表儿茶素或没食子儿茶素的量；30分钟表示酶反应30分钟；0. 40毫克蛋白表示2. 5mL反应液中加入酶含量。
全文摘要
本发明涉及茶树酯型儿茶素水解酶的酶活性检测方法。该检测方法包括如操作步骤1、用茶树鲜叶制备酶液，2、用酶液制备反应液和对照液，3、用反应液和对照液分别制备反应甲醇液和对照甲醇液，4、采用高效液相色谱技术(HPLC)分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中的非酯型儿茶素。本发明的检测方法简单，不需要纯化酶提取液；检测结果准确性强、灵敏度高，能够准确检测到酯型儿茶素水解酶反应产物，证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素水解酶酶活；操作方便，检测时间短，在1-2小时即可完成检测，避免了繁琐的实验操作。
文档编号C12Q1/44GK102174642SQ20111004614
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘亚军, 夏涛, 聂志银, 高丽萍 申请人:安徽农业大学