一种芦笋低聚糖的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，步骤为：（1）制备芦笋干粉；（2）加水，重复冻结解冻；（3）浸泡，微波处理；（4）加水混合，浸提，抽滤，浓缩滤液；（5）加入木瓜蛋白酶分解蛋白质；（6）将步骤（5）获得的产物与有机溶剂混合，震荡，离心，去沉淀得上清；（7）将上清液醇沉，离心，沉淀冷冻干燥，得芦笋粗多糖浓缩液；（8）过中性SephadexG-10柱，收集体积为1～2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得芦笋低聚糖。本发明方法提高了芦笋低聚糖提取效率；并用木瓜蛋白酶+Sevag法除蛋白，蛋白清除率高，粗糖损失率小；分离组分中不含杂质，分离条件温和、设备简便经济、流程简单、能耗低。
【专利说明】一种芦笋低聚糖的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于低聚糖的制备【技术领域】，涉及一种具有抗氧化、调节肠道菌群作用的芦笋低聚糖的分离纯化方法 。
【背景技术】
[0002]低聚糖(Oligosaccharide)又名寡糖,是指有三个或三个以上的单糖通过糖苷键聚合在一起(聚合度< 10),形成支链状、分支链状或环状的、经水解后分解为以单糖为单位的碳水化合物，构成低聚糖的单糖主要有五碳糖和六碳糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖等。一些植物中低聚糖的含量较高，如大豆饼柏中的棉籽糖和水苏糖，甜菜糖蜜中含有棉籽糖，有研究报道，芦笋、地黄、大蒜、洋葱、牛蒡、香蕉、野西瓜等植物中都有低聚糖的存在。大量研究已表明低聚糖具有改善人体内微生态环境，调节肠道菌群、润肠通便、调节血脂、调节免疫等作用。其最显著的特征是能使人体内的双歧杆菌迅速繁殖，改变肠道中菌群比例，保持良好的肠道环境。
[0003]芦笋低聚糖具有还原性的半缩醛羟基，可以捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行。芦笋低聚糖可以与O2^发生氧化反应来清除超氧阴离子自由基。芦笋低聚糖对羟基自由基的清除效率很高，是良好的自由基清除剂。芦笋低聚糖可以促进肠道双歧杆菌的生长，抑制肠道大肠杆菌的生长，而双歧杆菌会产生抑菌素增强抑制大肠杆菌的作用，进而起到调节和纠正肠道内菌群紊乱，促进肠道蠕动，润肠通便，防治便秘等作用。芦笋低聚糖是一种优良的天然抑菌因子，能够促进益生菌的增殖，同时抑制有害菌的繁殖，对于调节肠道菌群平衡有重要的作用。
[0004]对于低聚糖分离纯化方法的研究多见于大豆、地黄、魔芋、牛蒡等植物中，目前还没有关于芦笋低聚糖分离纯化方法的报道。从植物中提取低聚糖一般采用水浸提取、碱液提取、膜分离技术等，水浸提取效率很低，碱液提取有效成分含量高但时间太长，膜分离技术设备投资大，工艺复杂，并不适合工业化生产，目前低聚糖提取工艺的研究主要集中在提取辅助技术、设备的改进和生产工艺技术的改善方面。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种过程简单，能耗低的芦笋低聚糖的分离纯化方法。
[0006]本发明的技术方案概述如下:
[0007]一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，包括下述步骤:
[0008]( I)将速冻芦笋破碎，冷冻干燥，粉碎，过30~100目筛，得到芦笋干粉；
[0009](2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量10~30倍的水，在-30~-18°C冻结6~12h，微波解冻；重复冻结解冻I~2次；
[0010](3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡I~3h，在微波功率为100~300W，处理5 ~15min ；
[0011](4)按质量比为1:5~40的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在50~100°C浸提30~150min，抽滤，重复浸提I~4次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/5-1/3 ；
[0012](5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为20万~30万u/L，40~60°C揽祥4~6h ;
[0013](6)将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为4~6:1混合，震荡20~30min，3500~5000r/min离心10~20min，去除蛋白质沉淀，得到上清液，重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为4~6:1的氯仿和正丁醇混合液；
[0014](7)向步骤(6)获得的上清液中加入2~4倍体积的体积浓度为95%的乙醇水溶液，4°C醇沉8~12h，将醇沉后的提取液在3500~5000r/min离心10~20min，依次用乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀1-3次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；
[0015](8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为2~3r/min,进样体积为0.4~1.0mL,收集体积为I~2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。
[0016]本发明采用工艺较为简单，适用性强的水浸提法并加以改进。通过水浸提取与醇沉、融冻破壁和微波法相结合，大大提高了芦笋低聚糖的初步分离效率；采用木瓜蛋白酶+Sevag法除蛋白，蛋白脱除率高,粗糖损失量小；利用SephdexG-1O可以较好地分离出芦笋粗多糖提取物中的低聚糖成分，产物经纯度鉴定，分离组分中不含淀粉、蛋白质、核酸等杂质，纯度可达96%。本发明所提出的分离纯化方法分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便、流程简单、能耗低、可以连续循环操作，易于工业化生产。利用GPC-MwA-DNDC联用技术对芦笋低聚糖的分子量进行测定，两种芦笋低聚糖的分子量分别为524.566和568.615，推断其为三糖或者四糖。最后通过红外光谱对其结构进行验证。
[0017]从芦笋中分离低聚糖并测定其结构的方法。该方法过程简单，能耗低。分离得到的芦笋低聚糖是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，作为益生元可以促进肠道双歧杆菌的生长，抑制肠道大肠杆菌的生长，进而起到维持肠道菌群平衡的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为芦笋低聚糖层析图谱。
[0019]图2为芦笋低聚糖分子量GPC图谱。
[0020]图3为芦笋低聚糖红外光图谱。
[0021]图4为芦笋低聚糖气相色谱图。
[0022]图5-1为芦笋低聚糖组分I质谱图。
[0023]图5-2为芦笋低聚糖组分2质谱图。
[0024]图6为芦笋低聚糖体外清除.0H自由基的能力。
[0025]图7为芦笋低聚糖体外清除超氧阴离子自由基的能力。
【具体实施方式】
[0026]本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不能对本发明作任何限制。
[0027]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。[0028]实施例1
[0029]一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，包括下述步骤:
[0030](1)将速冻芦笑破碎,冷冻干燥,粉碎,过60目筛，得到芦笑干粉；
[0031](2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量20倍的水，在_20°C冻结8h，微波解冻；重复冻结解冻I次；
[0032](3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡2h，在微波功率为200W，处理IOmin ；
[0033](4)按质量比为1:20的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在80°C浸提90min，抽滤，重复浸提2次，将滤液合并，浓缩至滤液体积的1/4 ；
[0034](5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为25万u/L，50°C搅拌5h ；
[0035](6)将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为5:1混合，震荡25min，4000r/min离心15min,去除蛋白质沉淀,得到上清液,重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为5:1的氯仿和正丁醇混合液；
[0036](7)向步骤(6)获得的上清液中加入3倍体积的体积浓度为95%乙醇水溶液，4°C醇沉10h，4000r/min下离心15min，依次用乙醇、乙醚和丙酮反复洗涤沉淀2次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；
[0037](8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为3r/min,进样体积为
0.8mL，收集体积为lmL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。所述检测方法为硫酸一苯酚法。最终芦笋低聚糖收率可达9.7%。冷冻干燥得到两种芦笋低聚糖，见图1层析图谱。
[0038]GPC-MwA-DNDC联用技术确定芦笋低聚糖的绝对分子量及其分布:
[0039](I)GPC:泵:二元梯度；流速范围:0.001-10.0mL/min ;流速精度:0.1%RSD ;保留时间重现性:< 0.3%RSD ；
[0040](2) DNDC:样品池角度:45° ;控温稳定性:±0.01°C ;温度范围:从室温到80°C ；波长:620nm ；
[0041](3)MwA:角度:35、50、75、90、105、130、145 和 Reference 角;光源:30mff,677nm ;样品池体积:90μ L ;分子量测量范围:500-106 ；
[0042]试验得到的芦笋低聚糖主要有两种分子量的物质，其分子量分别为524.566和568.615，推断其为三糖或者四糖，见图2。
[0043]红外光谱检测芦笑低聚糖结构液质:
[0044]将Img实施例1分离纯化的芦笋低聚糖样品与IOOmg溴化钾混合研磨压片，在4000-400cm_1区间进行红外光谱扫描。主要技术参数为:波数范围:440~4000CHT1 ;分辨率:0.1~16CHT1 ;波数精度:优于0.1cnT1 ;信噪比:30000。推断芦笋低聚糖的单糖残基以吡喃环或呋喃环的形式存在，见图3。
[0045]GC-MS联用技术对芦笋低聚糖进行定性、定量分析:
[0046]取40mg实施例1分离纯化的芦笋低聚糖干粉置于带塞试管中，加入IOmLImoI/L的硫酸，封管，于110°C恒温水解8h，冷却后用BaCO3中和，离心除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得水解样品。在水解样品中加入1.2mL吡啶，振荡，使样品充分溶解，然后依次加入0.8mL六甲基二娃胺烧和0.4mL三甲基氯硅烷,在60°C水浴中恒温反应10min, 5000r/min离心20min，去沉淀取上清液作为GC/MC分析的样品。色谱条件为:色谱柱:RTX_5石英毛细管柱(30mX0.32mm，0.25 μ m) ;FID 检测器:柱温:150°C _250°C，150°C保持 0.5min，7°C /min 程序升温到190°C，再以15°C /min程序升温到250°C;检测器温度:250°C;进样口温度:250°C;载气:氮气30mL/min,空气35mL/min,氢气35mL/min。气相色谱图见图4,质谱图见图5(组分1:图5-1，组分2:图5-2)。分析结果判定芦笋低聚糖由l，2，3，4，6-5-0-a-D-吡喃葡萄糖、1，2，3，4，6-5-0-吡喃半乳糖、2，3,4.5，6，-5-0-D-葡萄糖、5_0_ 吡喃葡萄糖和 2，3，4，5，6-5-0-甘露糖组成。
[0047]实施例2
[0048]一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，包括下述步骤:
[0049]( I)将速冻芦笋破碎，冷冻干燥，粉碎，过30目筛，得到芦笋干粉；
[0050](2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量30倍的水，在_30°C冻结6h，微波解冻；重复冻结解冻2次；
[0051](3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡3h，在微波功率为300W，处理5min ；
[0052](4)按质量比为1:40的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在50°C浸提150min，抽滤，重复浸提I次，将滤液合并，浓缩至滤液体积的1/5 ；
[0053](5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为20万u/L，40°C搅拌6h ；
[0054](6)，将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为4:1混合，震荡30min，3500r/min离心20min,去除蛋白质沉淀,得到上清液，重复，加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；有机溶剂是体积比为4:1的氯仿和正丁醇混合液；
[0055](7)向步骤(6)获得的上清液中加入2倍体积的体积浓度为95%乙醇水溶液，4°C醇沉8h，3500r/min下离心20min，依次用乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀I次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；
[0056](8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为2r/min,进样体积为
0.4mL，收集体积为lmL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。所述检测方法为硫酸一苯酚法。最终芦笋低聚糖收率可达9.2%。
[0057]实施例3
[0058]一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，包括下述步骤:
[0059]( I)将速冻芦笋破碎，冷冻干燥，粉碎，过100目筛，得到芦笋干粉；
[0060](2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量10倍的水，在_18°C冻结12h，微波解冻；重复冻结解冻2次；
[0061](3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡lh，在微波功率为100W，处理15min ；
[0062](4)按质量比为1:5的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在100°C浸提30min，抽滤，重复浸提4次，将滤液合并，浓缩至滤液体积的1/3 ；
[0063](5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使其浓度为30万u/L，60°C搅拌4h ；
[0064](6)，将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为6:1混合，震荡20min，5000r/min离心IOmin,去除蛋白质沉淀,得到上清液,重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为6:1的氯仿和正丁醇混合液；
[0065](7)向步骤(6)获得的上清液中加入4倍体积的体积浓度为95%乙醇水溶液，4°C醇沉12h，5000r/min下离心lOmin，依次用乙醇、乙醚和丙酮反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；
[0066](8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为3r/min,进样体积为1.0mL，收集体积为2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。所述检测方法为硫酸一苯酚法。最终芦笋低聚糖收率可达9.5%。
[0067]实施例4
[0068]芦笋低聚糖体外清除.0H自由基的能力
[0069]对.0H清除能力的测定方法:在干燥的试管中依次加入2mL50mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4), 1.5mL5mmol/L邻二氮菲溶液(空白组不加)，1.0mL7.5mmol/L的FeSO4溶液(空白组不加)，样品组加一定浓度的实施例1分离纯化的芦笋低聚糖溶液，样品组与损伤组各加1.0mLl%H202，所有组补充蒸馏水使各管终体积为10mL。摇匀后置于37°C恒温水浴中保温Ih后取出，置于510nm处测定吸光度A值，重复三次，并以相同浓度的甘露醇作为对照，按下式计算羟基自由基清除率:
[0070].0H清除率(％) = [ (A样品一A损伤)/ (A未损一A损伤)]X 100%
[0071]试验结果显示，在浓度为0.5~30mg/mL范围内，随着浓度增大，.0H自由基清除能力显著增高，当浓度达到30mg/mL时,清除率达到64.86%。从图6可以看出，在相同浓度添加条件下，芦笋低聚糖对羟基自由基的清除能力显著的高于甘露醇(P < 0.05)，10mg/mL芦笋低聚糖对羟基自由基的清除率与30mg/mL的甘露醇相近。表明芦笋低聚糖对羟基自由基的清除效率很高，是良好的自由基清除剂。
[0072]用实施例2或实施例3分离纯化的芦笋低聚糖替代实施例1分离纯化的芦笋低聚糖，其它同本实施例，结果表明，实施例2或实施例3分离纯化的芦笋低聚糖对羟基自由基的清除效率与实施例1相近。
[0073]实施例5
[0074]芦笋低聚糖体外清除超氧阴离子自由基的能力:
[0075]清除超氧阴离子自由基的测定方法:取三支试管分别加入pH=8.2的Tris-HCL缓冲液4.5mL，置于恒温水浴锅中，25°C保温20min，加入0.lmL45mmol/L的邻苯三酚溶液(空白组不加)，样品组加入0.4mL 一定浓度的实施例1分离纯化的芦笋低聚糖溶液，补齐蒸馏水至各管终体积为5.0mL，快速振荡混匀，以空白作对照，在325nm下每隔30s记录一次数值，连续记录3min，重复三次。按下式计算超氧阴离子自由基的清除率:
[0076]
【权利要求】
1.一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，其特征包括下述步骤: (1)将速冻芦笑破碎，冷冻干燥，粉碎，过30~100目筛，得到芦笑干粉； (2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量10~30倍的水，在-30~-18°C冻结6~12h，微波解冻；重复冻结解冻I~2次； (3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡I~3h，在微波功率为100~300W，处理5~15min ； (4)按质量比为1:5~40的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在50~100°C浸提30~150min，抽滤，重复浸提I~4次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/5-1/3 ； (5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为20万~30万u/L，40~60°C搅拌4~6h ; (6)将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为4~6:1混合，震荡20~30min，3500~5000r/min离心10~20min，去除蛋白质沉淀，得到上清液，重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为4~6:1的氯仿和正丁醇混合液； (7)向步骤(6)获得的上清液中加入2~4倍体积的体积浓度为95%的乙醇水溶液，4°C醇沉8~12h，将醇沉后的提取液在3500~5000r/min离心10~20min，依次用乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀1-3次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液； (8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为2~3r/min,进样体积为0.4~1.0mL，收集体积为I~2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。
【文档编号】C07H3/06GK103524568SQ201310466135
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】寇晓虹, 张莹, 薛照辉, 谢冰 申请人:天津大学