专利名称：烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖衍生物非病毒转基因载体的制备方法。属于基因治疗领域新型高效非病毒载体的制备方法和技术。
背景技术：
转基因技术在生物、医药、环保等领域发挥着越来越重要的作用，一批批转基因动物和植物相继产生，已成为科学研究中新的亮点。目前基因转染主要采用显微注射、病毒载体、非病毒载体转化等方法，它们都存在容易造成DNA损伤、转染效率低、设备昂贵、需要高超的操作技能等缺点，制约着该技术的更广泛的应用。基因转染的核心问题和关键步骤是如何稳定、高效、无损伤的将外源基因导入目标细胞。但是，由于DNA和细胞膜表面均带负电，静电排斥作用阻碍了基因的进入。为了提高基因的转染率，研究人员尝试利用病毒和非病毒载体将基因“输送”至宿主细胞。尽管病毒载体可获得很高的转染率，但其缺点是易引起免疫反应和肿瘤化趋势。鉴于此，对非病毒载体的研发日益引起了广泛的关注，如脂质体、聚赖氨酸、二乙基氨基葡聚糖、树状高分子等，这些非病毒载体通过静电相互作用同DNA形成聚电解质复合物(PEC)，复合方法简便易行，并使包覆的DNA得到保护，但研究表明所开发的非病毒载体的转染率尚较低，且很多合成高分子非病毒载体存在较明显的细胞毒性。
壳聚糖是一种生物相容性良好、可降解、无细胞毒的天然碱性多糖，几十年来，壳聚糖广泛用于药物缓释剂、止血材料、组织工程支架、降固醇制剂等。随着对壳聚糖物化和生物性质的深入认识，研究人员发现壳聚糖具有独特的粘连性和跨细胞膜性。利用这一特性，Mumper等首次将壳聚糖用作转基因非病毒载体，通过改变其分子量可得到尺寸100-600nm的DNA/壳聚糖复合物微粒。MacLaughlin等将壳聚糖和其低聚物与质粒DNA形成复合物，考察了对COS-1细胞的转染情况。实验发现分子量小于105的壳聚糖可与DNA形成粒径100-200nm的纳米微粒，且复合物在10％的血清中稳定性好，能得到满意的转染率。Roy等利用口服途径将DNA/壳聚糖复合物释放到小鼠肠道上皮细胞，转染基因成功表达Arah2蛋白，减缓对免疫系统过敏性反应。
为了改进壳聚糖载体的转基因特性，近来，研究人员研制了一些壳聚糖衍生物载体。Lee等以脱氧胆酸对壳聚糖进行改性，与质粒DNA复合后，尽管转染率比脂质转染胺低，但仍可获得对COS-1细胞较高的转染率。
为了提高壳聚糖载体的靶向性，Mao等将运铁蛋白和KNOB蛋白配体结合到壳聚糖上，配体修饰的壳聚糖载体分别使基因对HEK293和HeLa细胞的转染率提高4倍和6倍。
但是，目前所研究的壳聚糖/DNA复合物均通过自身的质子化氨基与DNA通过静电相互作用而形成。强烈的静电相互作用一方面有助于复合物的形成，但另一方面对复合物解离起到阻碍作用，进而降低了转染率。Kuhn等以理论计算研究了DNA与阳离子两亲性分子形成复合物时电荷的变化，结果表明，疏水性足够强的两亲性分子可在很低的浓度下使复合物呈电中性或发生电荷反转，即呈正电性。从转基因的安全角度而言，减小载体的用量可降低毒副作用，且借助亲疏水性的调节可调控载体与细胞的亲和性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法。该方法采用转基因的载体烷基化壳聚糖亲疏水性可调，无细胞毒性，在较低的电荷比下能与质粒DNA复合，并能抗核酸酶对DNA的降解，以烷基化壳聚糖为载体复合DNA构成的微粒在血清中用ELISA方法测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值接近在相同的条件下以质子转染胺(lipofectamine)为载体转染的CAT光密度值1.26.
为达到上述目的，本发明是通过下述技术加以实现的。本发明方法包括烷基化壳聚糖的制备，及以其为载体与质粒DNA复合制备微粒的两个步骤，其特征在于，以分子量40000-50000，脱乙酰度90％以上的壳聚糖分散在10-20％的氢氧化钠和异丙醇混合比1∶5的溶剂中，并向该溶液中加入溴丁烷或溴辛烷、溴代十二烷、溴代十六烷烷基化剂，其加入量为与壳聚糖氨基摩尔比为20-30％，在50-60℃下反应3-4小时，然后经洗涤、过滤、透析处理得到取代度达20-30％的丁基或辛基、十二烷基、十六烷基壳聚糖衍生物。把上述某一种烷基化壳聚糖以及含有CAT报告基因的质粒DNA分别溶于0.02M醋酸/0.02M醋酸钠的溶液中，静置1-2小时后，再把它们的溶液按壳聚糖的氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数1∶2进行混合，使它们的电荷比为1∶2-1∶6，静置过滤得到粒径80-100nm的复合物微粒。
上述的烷基化剂优选溴代十二烷、溴代十六烷。
本发明合成的低分子量烷基化壳聚糖由于亲疏水性可调，可借助疏水相互作用，在较低的电荷比下可与质粒DNA复合，烷基化壳聚糖不仅能抗核酸酶对DNA的降解，且疏水烷基的引入提高了细胞的亲和性和跨膜能力，进而提高基因的转染率，接近商品质子转染胺(lipofectamine)水平。
具体实施例方式
将透析过的10mg十二烷基壳聚糖溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度1mg/ml，含有CAT报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度10mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl十二烷基壳聚糖溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得复合物粒子加入到已培养致指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，48小时后，裂解细胞，ELISA测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值为0.998。在相同的条件下，以lipofectamine为载体基因转染后的CAT光密度值为1.26.
将透析过的10mg十二烷基壳聚糖溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度1mg/ml，含有CAT报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度10mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl十二烷基壳聚糖溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得复合物粒子加入到已培养致指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，48小时后，裂解细胞，ELISA测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值为0.98。在相同的条件下，以lipofectamine为载体基因转染后的CAT光密度值为1.26.对比例一取5克分子量5000，脱乙酰化度为90％的壳聚糖，加入50ml吡啶，异丙醇20ml，40℃搅拌20分钟，加入溴代十二烷1.2克，60℃反应4小时，过滤，乙醇洗涤三次，抽滤，50℃烘箱中干燥24小时。将产物溶于去离子水中，透析5天，-50℃下冷冻干燥得最终载体。
将透析过的10mg十二烷基壳聚糖溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度1mg/ml，含有CAT报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度10mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl十二烷基壳聚糖溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得复合物粒子加入到已培养致指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，48小时后，裂解细胞，ELISA测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值为0.22。对比例二将1克分子量50000，脱乙酰化度为90％的壳聚糖溶于稀醋酸中，去离子水中透析5天，-50℃下冷冻干燥。再将精制的壳聚糖溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度1mg/ml，含有CAT报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度10mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl壳聚糖溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得壳聚糖/DNA复合物粒子加入到已培养致指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，48小时后，裂解细胞，ELISA测定细胞裂解液中CAT的含量以确定基因转染效率，CAT的光密度值为0.46.
权利要求
1.一种烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法，该方法包括烷基化壳聚糖的制备，及以其为载体与质粒DNA复合制备微粒的两个步骤，其特征在于以分子量40000-50000，脱乙酰度90％以上的壳聚糖分散在10-20％的氢氧化钠和异丙醇混合比1∶5的溶剂中，并向该溶液中加入溴丁烷或溴辛烷、溴代十二烷、溴代十六烷烷基化剂，其加入量为与壳聚糖氨基摩尔比为20-30％，在50-60℃下反应3-4小时，然后经洗涤、过滤、透析处理得到取代度达20-30％的丁基或辛基、十二烷基、十六烷基壳聚糖衍生物，把上述某一种烷基化壳聚糖以及含有CAT报告基因的质粒DNA分别溶于0.01-0.03M醋酸/0.01-0.03M醋酸钠的溶液中，静置1-2小时后，再把它们的溶液按壳聚糖的氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数1∶2进行混合，使它们的电荷比为1∶2-1∶6，静置过滤得到粒径80-100nm的复合物微粒。
2.按权利要求1所述烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法，其特征在于优选烷基化剂为溴代十二烷、溴代十六烷。
全文摘要
本发明公开了一种烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法。该方法包括烷基化壳聚糖的制备,及以其为载体与质粒DNA复合制备微粒,其特征在于:以分子量40000－50000,脱乙酰度90%以上的壳聚糖分散在氢氧化钠和异丙醇混合溶剂中,并向该溶液中加入烷基化试剂反应,经洗涤等处理得到取代度达20－30%的烷基化壳聚糖,将烷基化壳聚糖及含有CAT报告基因的质粒DNA分别溶于醋酸/醋酸钠的溶液中,静置后,再把它们的溶液按壳聚糖的氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比进行混合,静置过滤得到粒径80－100nm的复合物微粒。本发明采用的载体亲疏水性可调,无细胞毒性,在较低的电荷比下能与质粒DNA复合,并能抗核酸酶对DNA的降解,在相同的条件下转染率接近质子转染胺(lipofectamine)水平。
文档编号C08B37/08GK1386548SQ0212106
公开日2002年12月25日 申请日期2002年5月31日 优先权日2002年5月31日
发明者姚康德, 刘文广, 孙光洁, 张镜宇, 梁东春, 郭刚 申请人:天津大学