专利名称：一种聚阳离子转基因载体及其合成方法
技术领域：
本发明涉及一种聚阳离子转基因载体，具体涉及一种聚阳离子载体及合成方法。
背景技术：
基因药物治疗是近三十年来兴起的新型治疗方式，它是将外源表基因导入目的细胞并有 效表达，从而达到治疗疾病的目的。在基因药物释放体系中，对载体的研究始终是研究的热 点问题。携带正常基因或治疗基因的载体主要有病毒载体和非病毒载体。对于病毒载体介导 体系，在体内有很高的基因转染效率，但其存在着细胞毒性大、DNA的携带能力小、制备时 间长和价格昂贵等问题的存在。出于对治疗安全性的考虑，特别是1999年，美国基因治疗临 床实验因使用腺病毒载体导致"Jesse Gelsinger"死亡事件，病毒载体在临床上的应用受到 很大的局限，研究者在病毒类载体的临床使用上更为谨慎。对于非病毒性转基因载体，其具 有免疫原性低，安全性能高，易于人工合成等特点，在基因药物的研究中日益受到重视。
在基因药物治疗中，作为治疗作用的DNA片段，必须定位于细胞核才能发挥作用，因而， 克服细胞膜屏障、溶酶体屏障和核孔运转屏障是载体/DNA微粒进入细胞核进行细胞转染必须 克服的三道屏障。因此，本发明始终围绕着如何克服这些屏障。
在众多的非病毒性载体材料中，聚阳离子材料是一类典型的非病毒性转基因载体，如 聚赖氨酸(polylysin),聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI),壳聚糖(chitosan)，树枝状 聚合物(dendrimer)以及其他聚阳离子衍生物。而PEI的作用尤为突出，其在体外和体内实 验中均表现出很高的基因转染效率。PEI结构中的-NH2具有很强的DNA结合作用，而-NH-和 -N-被质子化后，具有很强的缓冲作用，能保护DNA在细胞溶酵体中不被核酸酶降解，促进 DNA从内含体中逃逸。PEI的高基因转染效率与其分子量、表面电荷及缓冲能力有十分密切的 关系。高分子量的PEI (大于25KDa)转染效率很高，但毒性也大，不能被生物降解以及在体 内滞留时间较长；低分子量的PEI毒性低，分子量低于2KDa的PEI几乎没有基因转染效率， 因此不能单独作为基因药物的载体。
环糊精(简称CyD)是一类由D-吡喃型葡萄糖分子以a-1， 4-糖苷键连接，互为椅式构象 的环状化合物。按形成环糊精的葡萄糖残基数分别为6、 7、 8，相应地称为a ， e ， Y环糊 精。它们具有"内疏水，外亲水"的特殊分子结构，这种结构使环糊精内腔与弱极性有机化 合物结合而生成主客体化合物，是一种常用的药物辅料，由于其结构的特殊性，其表面的羟 基具有亲水特性，且这些羟基可增加细胞膜的附着性，提高对膜屏障的通透性，且环糊精与
阳离子结合可以用作于基因转染和低聚核苷酸的释放。P-环糊精与阳离子偶合而成的材料与 DNA形成纳米微粒在细胞表面黏附性强，生物体内稳定性好，易于纳米微粒对细胞膜的穿透。 用叶酸作为配体接入高分子载体已有报道，Conry Sun报道了叶酸和聚乙二醇偶合载体 (Co咖y Sun, Raymond, Miqin Zhang, Journal of Biomaterials Research Part A. 2006:550-557)。 Younsoo Bae报道了叶酸与聚乙二醇-(天冬酰胺-腙-阿霉素)多元聚和物(Younsoo Bae, Woo-Dong Jang, Nobuhiro Nishiyama etal. Molecular Biosystems. 2005(1):242-250)。 Sun Hwa
Kim报道了叶酸与聚乙二醇-聚赖氨酸共聚物(Sun Hwa Kim, Ji Hoon Jeong Cheol O Joe, Tan
Gwan Park. Journal of Controlled Release. 2005;103:625-634)。 Shao-Qiong Liu报道了叶酸偶联 多元共聚物P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)用于抗肿瘤药物(Shao-Qiong Liu， Nikken Wiradharma, Shu-Jun Gao， Yen Wah Tong and Yi-Yan Yang。 Biomaterials. 2006;28(7): 1423-1433.。 You-Kyoung Kim等报道了叶酸联结于PEG-桿狀病毒(You-Kyoung Kim, Jae Young Choi, Mi-Kyong Yoo, Hu-Lin Jiang, Rohidas Arote, Yeon Ho Je, Myung-Haing Cho and Chong-Su Cho. Journal of Biotechnology.2007;131(3):353-361 。但众多文献未涉及本专利的环糊 精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式纳米聚阳离子载体材料。
本发明目的是提供一种聚阳离子非病毒性转基因载体及合成方法，使得载体材料的肿瘤 靶向性的作用更加明显，提高在肿瘤细胞上的转染效率。
本发明提供的聚阳离子转基因载体，是环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式纳米聚阳离 子载体，结构式如下
式中n为环糊精-聚乙烯亚胺单元结构的个数，m!为聚乙烯亚胺中伯氨基单元的数 量，m2为聚乙烯亚胺中仲氨基单元的数量。其中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的分 子量有关，m,，ra2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关
发明内容
本发明提供的聚阳离子转基因载体的合成方法，是以环糊精为交联骨架，连接低分子量 的聚乙烯亚胺(PEI),制成线型的载体材料，将在肿瘤细胞上具有受体的小分子药物叶酸偶 合于上述载体材料，构建成纳米聚阳离子载体。为使小分子药物叶酸等能偶合于载体上，必 须让带阳离子的PEI有一个裸露的空间，使叶酸能与其充分的接触，载体材料有一个舒展的 线性结构是一种理想的模型。
本发明提供的聚阳离子转基因载体的合成方法，反应式如下-
步骤1 <formula>formula see original document page 7</formula>
步骤2 <formula>formula see original document page 7</formula>
步骤3 <formula>formula see original document page 7</formula>
反应式中, (1)式环糊精结构式, (2)式活化的环糊精结构式, (3)式聚乙烯亚胺结构式，(4)是环糊精连接了聚乙烯亚胺的结构式，(5)是叶酸的结构式，(6)是最终 产物环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的结构式；结构式中n为环糊精-聚乙烯亚胺单元结构的 个数，m,为聚乙烯亚胺中伯氨基单元的数量，rri2为聚乙烯亚胺中仲氨基单元的数量。其 中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的分子量有关，m,，m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关。
本发明提供的聚阳离子转基因载体的合成方法，包括如下步骤 *环糊精的活化将环糊精溶解于重量体积比20-50倍量的二甲基亚砜中，加人活化羟基 的连接剂，用量为环糊精重量比5-20倍量，将连接剂溶解于重量体积比l一5倍量的二 甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处将连接剂加入环糊精溶液中，加入催化剂三乙胺，搅 拌反应120-240分钟。反应完毕后，在冷冻的乙醚中析出白色沉淀物，过滤，得到经过 活化环糊精，溶于二甲基亚砜中保存。
*聚乙烯亚胺的偶联取经过活化环糊精，加人小分子量聚乙烯亚胺，用量为经过活化环 糊精重量比3 — 15倍量，将聚乙烯亚胺溶解于重量体积比2 — 5倍量的二甲基亚砜中，在 氮气保护下于暗处，将聚乙烯亚胺溶液滴加在环糊精溶液中，在90-120分钟加完，加入 催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反应90-120分钟。反应完毕后的溶液在透析袋 中48小时，然后冰冻干燥48小时，得到白色粉末状物质，即环糊精-聚乙烯亚胺载体材 料。
*叶酸的接入取环糊精-聚乙烯亚胺载体材料，溶解于重量体积比10—25倍量的二甲基 亚砜中，将叶酸溶解于重量体积比20—50倍量的二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处逐 滴加入上述环糊精-聚乙烯亚胺载体材料的溶液中，加入环糊精-聚乙烯亚胺与叶酸的重 量比为l一5倍量，在90-120分钟加完，加入催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反 应10小时。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻干燥48小时。得到淡黄色 粉末状物质，即环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式的纳米聚阳离子非病毒性转基因载 体。
本发明所述的环糊精包括a 、 0、 Y环糊精中的任何一种，最佳为p-环糊精。 本发明所述的能活化羟基的连接剂为N,N'-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、
羰基咪唑、N,N，-二琥珀酰亚胺基硫酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯中的任一种。最佳为
N,N'-羰基二咪唑。
本发明所述催化剂三乙胺的用量是环糊精、聚乙烯亚胺或叶酸与三乙胺的重量体积比 为10-50倍量。
本发明所述小分子量聚乙烯亚胺的分子量为600、 1200、 2000的聚乙烯亚胺中任一种。
本发明所述透析袋的分子量在3500-15000范围内。
本发明的技术效果
本发明以环糊精为交联骨架，连接低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)，将在肿瘤细胞上具有 受体的小分子药物叶酸偶合于上述载体材料，构建成环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的结构纳米聚 阳离子载体。由于环糊精具有"内疏水，外亲水"的特殊分子结构，生物体内稳定性好，易 于纳米微粒对细胞膜的穿透；选择具有3种不同的氨基形式的聚乙烯亚胺(PEI)，形成了不同 的缓冲体系，氨基的存在基本作用是结合DNA，扩展的功能是在携带DNA进入细胞时不同的 氨基组合成不同的缓冲对，能保护DNA免遭细胞质中的溶酶体降解。
本发明以环糊精(CyD)为骨架的系列材料，将其活化后与低分子的聚乙烯亚胺(PEI)聚 合，在整个系统组装技术平台结构中，经过表面修饰后将低分子量的PEI连接起来，制成分 子量高、电荷密度大及缓冲能力强的基因载体，再在载体上偶联小分子靶向药物叶酸。此结 构中(3-环糊精中的羟基可以增强载体和细胞膜的黏附作用，其柔软的结构可以偕同PEI顺利 穿透细胞膜屏障。进入细胞膜后，由于连接的PEI仍保持着原来的基本结构，具有足够的表 面电荷和缓冲能力，使得载体/DNA结合物在穿越细胞膜屏障并进入溶酶体后，能有效抵抗溶 酶体内酶的降解作用，延长载体在细胞内的作用时间，并有效地保证DNA穿过核膜进入核内 进行表达转染。连接叶酸后，使得载体材料的肿瘤靶向性的作用更加明显，在肿瘤细胞上的 转染效率提高。本发明环糊精用连接剂处理后，连接小分子的聚乙烯亚胺。环糊精具有一定 的生物学活性，所用的连接剂具有特殊的结构，能修饰环糊精上的羟基，活化后连接的小分 子聚乙烯亚胺保留原先的结构和功能。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明进行祥细的描述，但不限于实施例公开的内容。 实施例h
l)环糊精的活化取a-环糊精中1.9克，加入10毫升二甲基亚砜使其溶解，活化羟基的连 接剂N，N，-二琥珀酰亚胺基硫酸酯10克溶解于20毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处 将连接剂加入环糊精溶液中，加入200微升的催化剂三乙胺，搅拌反应120-240分钟。反 应完毕后，在冷冻的乙醚中析出，得到白色沉淀物，过滤，溶于二甲基亚砜中保存。
2 )聚乙烯亚胺的偶联取2.5克经过活化的环糊精，将9克分子量为600的聚乙烯亚胺溶 解于20毫升的二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精溶液中，滴加速度 缓慢，在90-120分钟加完，加入300微升的催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反应
90-120分钟。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻干燥48小时。得到白色粉 末状物质。
3)叶酸的接入取120毫克的环糊精-聚乙烯亚胺载体材料溶解于5毫升二甲基亚砜中，将 50毫克的叶酸溶解于3毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精-聚 乙烯亚胺载体材料的溶液中，滴加速度缓慢，在90-120分钟加完，加入300微升的催化剂 三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反应IO小时。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时， 然后冰冻干燥48小时。得到淡黄色粉末状物质。
实施例2:
l)环糊精的活化0-环糊精2. l克，加入15毫升二甲基亚砜使其溶解，活化羟基的连接剂
N,N'-羰基二咪唑15克溶解于2毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处将连接剂加入环 糊精溶液中，加入300微升的催化剂三乙胺，搅拌反应120-240分钟。反应完毕后，在冷 冻的乙醚中析出，得到白色沉淀物，过滤，溶于二甲基亚砜中保存。
2 )聚乙烯亚胺的偶联取2.5克经过活化的环糊精，将12克分子量1200的聚乙烯亚胺溶 解于20毫升的二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精溶液中，滴加速 度缓慢，在90-120分钟加完，加入300微升的催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续 反应90-120分钟。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻干燥48小时。得到 白色粉末状物质。
3)叶酸的接入取120毫克的环糊精-聚乙烯亚胺载体材料溶解于二甲基亚砜中，将30毫克 的叶酸溶解于3毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精-聚乙烯亚 胺载体材料的溶液中，滴加速度缓慢，在90-120分钟加完，加入250微升的催化剂三乙 胺，滴加完毕后在室温下继续反应10小时。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后 冰冻干燥48小时。得到淡黄色粉末状物质。
实施例3:
l)环糊精的活化Y-环糊精中2.5克，加入20毫升二甲基亚砜使其溶解，活化羟基的连接 剂苯并三唑碳酸酯20克溶解于20毫升倍量二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处将连接剂 加入环糊精溶液中，加入150微升的催化剂三乙胺，搅拌反应120-240分钟。反应完毕后， 在冷冻的乙醚中析出，得到白色沉淀物，过滤，溶于二甲基亚砜中保存。
2 )聚乙烯亚胺的偶联取2.5克经过活化的环糊精，将15克分子量2000的聚乙烯亚胺溶
解于30毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精溶液中，滴加速度缓 慢，在90-120分钟加完，加入200微升的催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反应 90-120分钟。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻干燥48小时。得到白色粉 末状物质。
3)叶酸的接入取120毫克的环糊精-聚乙烯亚胺载体材料溶解于二甲基亚砜中，将100毫 克的叶酸溶解于5毫升二甲基亚砜中，在氮气保护下于避光逐滴加入上述环糊精-聚乙烯亚 胺载体材料的溶液中，滴加速度缓慢，在90-120分钟加完，加入300微升的催化剂三乙胺， 滴加完毕后在室温下继续反应10小时。反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻 干燥48小时。得到淡黄色粉末状物质。
上述实施例获得的产物-聚阳离子非病毒性转基因载体，用于多种肿瘤细胞株的筛选及 小鼠体内实验，表明该材料肿瘤靶向性的作用更加明显，在肿瘤细胞上的转染效率提高， 毒性低。
权利要求
1、一种聚阳离子转基因载体，其特征是环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体，结构式如下式中n为环糊精-聚乙烯亚胺单元结构的个数，m1为聚乙烯亚胺中伯氨基单元的数量，m2为聚乙烯亚胺中仲氨基单元的数量，其中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的分子量有关，m1，m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关。
2、权利要求1所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是以环糊精为交联骨架， 连接小分子量的聚乙烯亚胺，将叶酸偶合于环糊精-聚乙烯亚胺载体材料上，构建成纳 米聚阳离子载体结构，反应式如下步骤l <formula>formula see original document page 2</formula>步骤2<formula>formula see original document page 2</formula>(4〉步骤3<formula>formula see original document page 3</formula>反应式中，(1)是环糊精结构式，(2)是活化的环糊精结构式，(3)是聚乙烯亚胺 结构式，(4)是环糊精连接了聚乙烯亚胺的结构式，(5)是叶酸的结构式，(6)是最终 产物环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的结构式；结构式中n为环糊精-聚乙烯亚胺单元结构的 个数，m,为聚乙烯亚胺中伯氨基单元的数量，m2为聚乙烯亚胺中仲氨基单元的数量，其 中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的分子量有关，m,，m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有 关。
3、根据权利要2所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是所述反应步骤如下*环糊精的活化将环糊精溶解于重量体积比20-50倍量的二甲基亚砜中，加人活化羟基 的连接剂，用量为环糊精重量比5-20倍量，将连接剂溶解于重量体积比1 —5倍量的二 甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处将连接剂加入环糊精溶液中，加入催化剂三乙胺，搅 拌反应120-240分钟，反应完毕后，在冷冻的乙醚中析出白色沉淀物，过滤，得到经过 活化环糊精，溶于二甲基亚砜中保存；* 聚乙烯亚胺的偶联取经过活化环糊精，加人小分子量聚乙烯亚胺，用量为经过活化环 糊精重量比3 — 15倍量，将聚乙烯亚胺溶解于重量体积比2 — 5倍量的二甲基亚砜中，在 氮气保护下于暗处，将聚乙烯亚胺溶液滴加在环糊精溶液中，在90-120分钟加完，加入 催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反应90-120分钟，反应完毕后的溶液在透析袋 中48小时，然后冰冻干燥48小时，得到白色粉末状物质，即环糊精-聚乙烯亚胺载体材 料；*叶酸的接入取环糊精-聚乙烯亚胺载体材料，溶解于重量体积比10—25倍量的二甲基 亚砜中，将叶酸溶解于重量体积比20 — 50倍量的二甲基亚砜中，在氮气保护下于暗处逐滴加入上述环糊精-聚乙烯亚胺载体材料的溶液中，加入环糊精-聚乙烯亚胺与叶酸的重 量比为l一5倍量,在90-120分钟加完，加入催化剂三乙胺，滴加完毕后在室温下继续反 应10小时，反应完毕后的溶液在透析袋中48小时，然后冰冻干燥48小时，得到淡黄色 粉末状物质，即环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式的纳米聚阳离子非病毒性转基因载 体。
4、 根据权利要求1或2或3所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是环糊精包 括a、 0、 Y环糊精中的任何一种。
5、 根据权利要求3所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是活化羟基的连接剂 为N,N，-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰基咪唑、N，N'-二琥珀酰亚胺基硫 酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯中任一种。
6、 根据权利要求3所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是小分子量聚乙烯亚胺分子量为600、 1200、 2000的聚乙烯亚胺中任一种。
7、 根据权利要求3所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是透析袋的分子量在 3500-15000范围内。
8、 根据权利要求3所述的聚阳离子转基因载体的合成方法，其特征是催化剂三乙胺的用 量是环糊精、聚乙烯亚胺或叶酸与叶酸三乙胺的重量体积比为10-50倍量。
全文摘要
一种新型的纳米聚阳离子转基因载体，是环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式结构的纳米聚阳离子载体，以环糊精为骨架材料，将其活化后与小分子的聚乙烯亚胺(PEI)聚合，将修饰的叶酸偶联于环糊精-聚乙烯亚胺上，制成具有肿瘤靶向性的纳米聚阳离子载体。该载体材料合成方法简单高效，回收率高，经过多种肿瘤细胞株的筛选及小鼠体内实验，表明该材料具有毒性低、转染效率高等的特点。
文档编号C08B37/16GK101338318SQ20081005934
公开日2009年1月7日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者宏 姚, 孔祥复, 林李家宓, 汤谷平 申请人:林李家宓;汤谷平;姚 宏