本发明属于化学医药领域，特别是涉及一类嘧啶类化合物以及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物，其制备方法、药物组合物以及医药用途。具体而言，本发明涉及一些嘧啶化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物，其制备方法，包含所述化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和/或溶剂合物(特别是这些化合物和盐的有用的多晶型)的药物组合物，和所述化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物在制备用于治疗由各种不同形式(激活突变体和/或抗性突变体形式)的EGFR介导的疾病的药物中的用途。
背景技术：
癌症正在成为人类最为致命的“杀手”，近年来，中国每年死于癌症的总人口，接近200万人。虽然各种各样的治疗途径以及药物的发现对癌症患者带来了希望，但这些常规治疗存在诸多弊端，譬如副作用大，治疗效果不佳，肿瘤术后复发，转移等。迫切需要新的治疗技术来解决癌症治疗的低成功率的现状。最近出现的个体化化疗和靶向治疗给肺癌治疗带来了新的希望。肿瘤分子靶向治疗是基于对肿瘤生长密切相关的关键分子通过化学或生物学手段选择性杀伤肿瘤细胞的一种治疗方法。靶向治疗方法具有特异性高，选择性强，毒副作用较轻的特点。当靶向治疗与传统化疗、放疗或肿瘤免疫联合应用时，可大大加强疗效，减少术后复发。肿瘤靶向治疗在最近几年内得到了迅速发展，是肿瘤治疗的新兴领域和未来发展趋势。
蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一类蛋白质酶，它们能够催化在多种重要蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基磷酸化反应，由此激活功能性蛋白的生物活性。这个过程在细胞内的信号传导通路中占据十分重要的地位，它调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化学过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调会引发生物体内的一系列疾病。研究表明，半数以上的癌症原基因和癌基因的激活都与蛋白酪氨酸激酶相关，蛋白酪氨酸激酶的异常表达可导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗药性密切相关。酪氨酸激酶已经成为抗肿瘤药物研发为的很重要靶点。
表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸蛋白激酶，属于erbB受体家族中的一种跨膜蛋白。
EGFR调控了细胞的增殖，存活，粘连，迁移与分化，它在多种肿瘤细胞中过度活化或持续活化，比如肺癌，乳腺癌，前列腺癌等细胞中。EGFR的异常活化在肿瘤的转化与增长中起着关键性的作用。阻断EGFR的活化已被临床证明为有效的靶向治疗肿瘤细胞方法之一。EGFR在50％的NSCLC(非小型性细胞肺癌)病例中有表达。这使得EGFR及其家族成员成为靶向治疗的主要候选者。吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)是EGFR的第一代小分子抑制剂，主要用于治疗晚期NSCLC的药物。临床结果显示吉非替尼或厄洛替尼对大约10％的白人NSCLC和大约35％的亚裔NSCLC患者有疗效。分析表明多数具有EGFR活化突变的NSCLC患者对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的反应率显著高于EGFR野生型的NSCLC患者。
但是临床研究表明许多患者很快(12-14个月)就对这些EGFR的小分子抑制剂药物产生了抗药性，即获得性耐药性。看门残基(gatekeeper residue)T790M突变是EGFR 20外显子中的一个突变点，是造成耐药的主要机制之一。针对这些EGFR突变的新一代抑制剂研究在进来获得了很大的成功。阿法替尼(Afatinib)是EGFR和人表皮生长因子受体2(HER2)酪氨酸激酶的强效、不可逆的双重抑制剂。其它类似的多靶点，高活性，不可逆的抑制剂，例如，卡奈替尼(canertinib)，达克替尼(Dacomitinib)也正在后期临床试验中。这些新型的第二代不可逆的抑制剂对L858R及T790M突变的EGFR具有很强的抑制作用，对吉非替尼或厄洛替尼已经产生抗药性的癌症病人有着显著的疗效。可是这些第二代EGFR突变体抑制剂对野生型EGFR(WT-EGFR)也同样具有极强的抑制性。临床研究已经证明对野生型EGFR的抑制在大部分患者身上会导致药物毒性和副作用，譬如在人体中表现为皮疹或腹泻。
要克服第二代EGFR抑制剂的毒性和副作用，就必须减少对野生型EGFR(WT-EGFR)的抑制作用。新一代的EGFR抑制剂应该保持对EGFR L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体和T790M抗性突变体有较强的抑制，同时对WT-EGFR及其它酪氨酸蛋白激酶受体显示相对较低的抑制作用。此类化合物可以用于治疗有EGFR L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体的癌症病人的治疗，以及对第一代EGFR抑制剂如吉非替尼、厄洛替尼或埃克替尼已经产生抗药性EGFR-T790M抗性突变体的癌症病人的治疗，而不用担心第二代EGFR突变体抑制剂如阿法替尼所带来的副作用。
本发明显示了许多对EGFR突变体(一种或多种)具有高抑制活性，但对野生型EGFR只有相对较低的抑制性的嘧啶化合物。本发明的化合物具有较好的物理化学性质和安全毒性参数。此类化合物在有EGFR激活突变体和/或EGFR的抗药性突变的癌症治疗中会有较好的效果。
本发明涉及某些嘧啶化合物及其药学上可接受的盐，其可用于由某些变异形态的表皮生长因子受体(例如L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体、和T790M抗性突变体)所介导的疾病或病况的治疗或预防。此类化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物，可用于很多不同的癌症的治疗或预防。本发明还涉及包含所述化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物(特别是这些化合物和盐的有用的多晶型)的药物组合物、所述化合物的制备中有用的中间体、和涉及利用所述化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药和溶剂合物治疗由激活和/或抗性突变体形式的EGFR所介导的疾病的方法。
因此，迫切需要新类型的，尤其是新颖骨架的化合物来解决耐药性，选择性差等问题。在以下文献列表中引证与专利申请最接近的现有技术的专利或非专利文件(期刊、杂志、手册和书籍等)：
1、New England Journal of medicine，2008，第358卷，第1160-1174页；
2、Chemical and Biophysical Research Communications，2004，第319卷，第1-11页；
3、Science，2004，第304卷，第1497-1500页；
4、New England Journalof medicine，2004，第350卷，第2129-2139页；
5、Molecular Cancer Therapeutics,2014,第13卷，第1468-1479页；
6、Journal of Medicinal Chemistry,2014,第57卷，第8249-8267页；
7、WO2013014448A1，对应于CN103702990A；
8、WO2013108754A1；
9、CN103374000A；
10、CN103804303A；
11、WO2013184766A1；
12、WO2009051822A1。
需要声明的是上述专利或非专利文件只是代表性的文献，并不是所有有关文献的完整列表。上述专利或非专利文件的全部公开内容在此通过引用并入本文，在存在矛盾或抵触的情况下，以本文中的描述为准。
目前的EGFR-TKI仍不能解决药物耐药性所引起的临床难题，而且现有的药物多是以喹唑啉或者喹啉胺类为基本母核的EGFR可逆或不可逆抑制剂，其对EGFR野生型细胞的选择性差带来的毒副作用仍然是不可避免的。因此，迫切需要新类型的，尤其是新颖骨架的化合物来解决耐药性，选择性差等问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一类下面式(I)所示的嘧啶化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子或溶剂合物。该类化合物可以对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白激酶的变异形态产生抑制作用，因此可有效抑制多种肿瘤细胞的生长，可用于制备抗肿瘤药物，用于很多不同的癌症的治疗或预防，并可以克服现有药物吉非替尼，厄洛替尼等诱发的耐药性。更特别地，该类化合物可用于制备用于治疗或预防由某些变异形态的EGFR(例如L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体、和/或T790M抗性突变体)所介导的疾病、障碍、紊乱或病况的药物。
本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供一种药物组合物，其包含选自上述嘧啶化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和溶剂合物中的一种或多种，以及一种或多种药学辅料。
本发明的又一目的是提供上述嘧啶化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和/或溶剂合物以及上述药物组合物在制备用于治疗或预防由变异形态的EGFR所介导的疾病、障碍、紊乱或病况的药物中的用途，尤其是在制备用于治疗或预防一种或多种癌症的药物种的用途。
本发明的又一目的是提供一种治疗或预防由变异形态的EGFR所介导的疾病、障碍、紊乱或病况，尤其是一种或多种癌症的方法。
本发明的又一目的是提供一种癌症联合治疗方法，即将选自上述嘧啶化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和溶剂合物中的一种或多种或根据本发明的药物组合物与常规的手术、放射疗法、化学疗法或肿瘤免疫疗法联合使用。
在本发明的第一方面，提供了式(I)的化合物或者其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子或溶剂合物：
其中:
R1是C1-C6烷基、CD3、或由氟取代的C1-C6烷基；
R2是
其中，R3是氢、氟、氯或溴，n是1-3的整数；R4是卤素取代或未取代的C2-C6烷基、或卤素取代或未取代的C3-C6环烷基；
并且，当R1是甲基，R2不能为
当R1是CD3，R2不能为
在本申请的优选方案中，在式(I)中，
R1是C1-C3烷基、CD3、或者由1至3个氟取代的C1-C3烷基；
R2选自以下基团：
并且，当R1是甲基，R2不能为
当R1是CD3，R2不能为
在本申请的另一优选方案中，在式(I)中，R1甲基或CD3，R2是选自下列基团：
其中，R4是乙基、环丙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基。
在本申请的另一优选方案中，在式(I)中，R1是甲基或CD3，R2是选自下列基团：
在本申请的另一优选方案中，在式(I)中，R1是CD3，R2是选自下列基团：
在本申请的另一优选方案中，在式(I)中，R1是甲基，R2是选自下列基团：
在本申请的最优选的实施方案中，所述式(I)的化合物选自：
本申请的第二方面，提供了制备上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐的方法，例如，所述方法可以用下列通用反应式所示的方法，其中某两步或多步反应顺序可以互相交换，不一定要与下列反应式所示的顺序完全一样。下列通用反应式中的化合物A1、A2、A4、A6、A9等可以是市售的，或者可以根据本领域中已知的方法由从其他市售化合物制备。制备方法在实施例有详细的描述。
其中，n、R1、R3、R4如前定义和优选，
在上述通用反应序列中，2,4-二氯嘧啶化合物A1和吲哚化合物A2反应生成化合物A3。在有对甲苯磺酸的条件下，化合物A3和A4反应生成化合物A5。N,N,N’-三甲基乙二胺A6在有碳酸钾的条件下取代A5中的氟原子而得到产品A7。催化氢化还原将硝基苯转化成苯胺A8。在和丙烯酸酐A9反应后，生成最终产物A10。产品A10加甲磺酸处理后可以得到甲磺酸盐A11。酸与化合物A10的比例因分子而异，一个化合物A10可以和1-3个酸分子成盐，其中以二酸盐或三酸盐居多。
本申请的第三方面，提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的选自上述式(I)中的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和/或溶剂合物以及一种或多种药学辅料。上述药物组合物为用于治疗或预防由激活突变体或抗性突变体形式EGFR介导的疾病、障碍、紊乱或病况，尤其是用于治疗或预防一种或多种癌症的药物。
上述药物根据治疗目的可以选择多种药物制剂形式，一般包括：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬液、溶液、霜剂、软膏、粉剂、栓剂、气雾剂和注射剂等。
本申请的第四方面，提供了上述式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和/或溶剂合物在制备治疗或预防由激活或抗性突变体形式的EGFR介导的障碍或疾病的药物中的用途。所述障碍或疾病包括但不限于:卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌(例如，结肠腺癌)、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝细胞癌、胃肠道基质瘤(GIST)、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤或间皮瘤。
在本发明中，所述激活突变体或抗性突变体形式的EGFR可以为例如L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体和/或T790M抗性突变体。因此，由激活突变体或抗性突变体形式的EGFR介导的疾病、障碍、紊乱或病况可以为例如L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体和/或T790M抗性突变体所介导的疾病、障碍、紊乱或病况。
根据本发明的式(I)的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和溶剂合物或根据本发明的药物组合物尤其可以用于由激活突变体或抗性突变体形式的EGFR介导的疾病、障碍、紊乱或病况的预防或治疗，例如由L858R激活突变体、Exon19缺失激活突变体和/或T790M抗性突变体所介导的疾病、障碍、紊乱或病况的预防或治疗，比如可以用于对吉非替尼、厄洛替尼、或埃可替尼已经产生抗药性的癌症病人的预防或治疗。
在本发明的又一方面，提供了一种癌症联合治疗方法，其包括给需要治疗的个体施用治疗有效量的选自根据本发明的式(I)的嘧啶化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、前药分子和溶剂合物中的一种或多种或治疗有效量的根据本发明的药物组合物，同时联合使用常规的手术或放射疗法或化学疗法或免疫肿瘤疗法。
所述的化学疗法或免疫肿瘤疗法与本发明化合物可以并列、同时地、序贯地、或分别地给药，并且可包含但不限制于以下类型的抗肿瘤剂的一种或多种：烷化剂(例如卡钼、奥沙利钼、顺钼、环磷酰胺、亚硝基脲类、氮芥、美法仑)，抗代谢药(例如吉西他滨)，和抗叶酸剂(例如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨喋呤、阿糖胞苷、羟基脲)，拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷、托泊替康、喜树碱)，抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨,紫杉醇、泰索帝)，抗肿瘤抗生素(例如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、丝裂霉素C、放线菌素)，抗雌激素药(例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬)，抗雄激素药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林、和布舍瑞林)，芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑)，CYP17裂解酶抑制剂(例如阿比特龙)，抗erbB2抗体曲妥珠单抗[赫赛汀]，抗EGFR抗体西妥昔单抗[Erbitux]；酪氨酸激酶,丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如伊马替尼和尼洛替尼、索拉非尼、trametinib、克唑替尼)细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如CDK4抑制剂palbociclib)，抗人血管内皮细胞生长因子抗体贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)以及VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(阿帕替尼)，免疫肿瘤治疗方法，例如抗PD-1抗体(pembrolizumab，nivolumab)、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗4-1BB抗体、抗GITR抗体、抗ICOS抗体、白细胞介素2。
有益效果
本发明的式(I)的化合物展示了对EGFR激活突变体或抗性突变体形式(一种或多种)具有高抑制活性，但对野生型EGFR抑制相对较低的一类嘧啶化合物。本发明的化合物 具有较好的物理化学性质和安全毒性参数。此类化合物在由EGFR激活突变和/或抗药性突变介导的疾病(包括癌症)的治疗会有较好的临床效果。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步的描述，但下列实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例121
1.中间体121-3的合成
氮气保护下，向100毫升(mL)三口瓶中在室温下，将原料121-1(3.0克(g)，25.6毫摩尔(mmol))溶于50mL 1,2-二氯乙烷(DCE)中，将混合物降至0℃，在0℃下将甲基溴化镁(8.5mL，25.6mmol)逐滴加入到反应体系中，加完后恒温继续反应30分钟(min)，0℃下再将121-2(5.4g，36.3mmol)加入到反应体系中，升温至室温后反应过夜。反应完全后，向反应混合物中加入100毫升冰水淬灭反应，混合物用100mL二氯甲烷萃取3次，有机相合并后用100毫升饱和食盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥后浓缩，粗品用硅胶柱层析提纯(乙酸乙酯(EA)/石油醚(PE)＝1:10-1:5)，得到2.0g产品121-3(34％)，为黄色固体。
液相色谱质谱(LCMS)：229.0。
2.中间体121-5的合成
在氮气保护下，向250mL三口瓶中依次加入121-4(10g，63.7mmol)，100mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，K2CO3(1.3g，9.34mmol)，氘代碘甲烷(11g，75.9mmol)，然后在油浴中加热到50℃后反应2小时(h)。将反应降温到室温，用100mL冰水淬灭，100mL EA萃取三次，过滤，有机相用200mL饱和食盐水洗3次。无水硫酸钠干燥，浓缩干燥，得9.7g产品121-5(88％)，为黄色固体。
3.中间体121-6的合成
向500mL单口瓶中依次加入121-5(9.7g,55.7mol)，240mL甲醇，钯碳(12g，5％)，置换三次氢气，室温下过夜反应。过滤掉钯碳，滤液浓缩干燥，得7.2g产品121-6(90％)，为浅色液体。
LCMS：145.1。
4.中间体121-7的合成
在氮气保护下，向250mL三口瓶中依次加入121-6(7.2g，49.9mmol)，64mL浓硫酸，冷却到0-10℃后分批加入浓硝酸(HNO3)(5.05g，50.0mmol)，用15分钟加完。室温下反应过夜。将反应混合物加入到500mL冰水中淬灭反应，用氨水调pH为10，用100mL EA萃取三次，再用200mL饱和食盐水洗3次。无水硫酸钠干燥后，浓缩干燥，得到5.1g产品121-7(54％)，为黄色固体。
LCMS：190.1。
5.中间体121-9的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料121-3(3.0g，13.0mmol)溶于30毫升N,N-二甲基甲酰胺中，加料完毕后将反应体系降温到0℃，然后分批加入氢化钠 (NaH)(786mg，18.5mmol)，0℃下反应0.5小时后加入三氟甲磺酸三氟乙酯121-8(3.65g，15mmol)，加料完毕回至室温反应2小时，检测反应完全。将反应液倒入200mL冰水中淬灭，有红色固体析出，将所得混合物过滤，收集固体，烘干得4.2g产品121-9，为红色固体。LCMS：312.0。
6.中间体121-10的合成
氮气保护下，在250mL三口瓶中，室温下将原料121-9(1.8g，5.77mmol)溶于50mL异丙醇(i-PrOH)中，再依次将121-7(1.1g，5.82mmol)，对甲苯磺酸(1.3g，7.55mmol)加入到反应体系中，加料完毕后将反应体系升温至105℃反应6小时。检测反应完全后将反应体系降到室温，混合物过滤，收集滤饼，固体烘干得3g粗品121-10，为黄色固体。LCMS：465.1。
7.中间体121-11的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料121-10(3.0g，6.46mmol)溶于30mL N-甲基环己酰胺(NMP)中，再依次将N,N,N’-三甲基乙二胺(860mg，8.42mmol)，无水碳酸钾(2.7g，19.5mmol)加入到反应体系中，加料完毕后将反应体系升温到100℃。反应2小时后检测反应完全，将反应体系降至室温，将反应液倒入100mL冰水中淬灭，将混合物抽滤，收集滤饼并烘干，得到1.7g(48％)产品121-11，为红色固体。LCMS：547.2。
8.中间体121-12的合成
氮气保护下，在250mL单口瓶中，室温下，依次加入甲醇50mL，二氯甲烷(DCM)50mL，原料121-11(1.7g，3.11mmol)，含水钯碳(1.7g，10％)，甲酸铵(1.7g)，加料完毕后将体系室温反应3小时，检测反应完全。反应体系抽滤，收集滤液，浓缩至干。所得残余物用200mL二氯甲烷溶解，200mL NaHCO3水溶液反洗1次，再用200mL饱和食盐水洗1次，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩至干后得到0.8g(50％)产品121-12，为黄色固体。LCMS：517.3。
9.化合物121的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料121-12(800mg，1.55mmol)溶于50mL三氯甲烷中，将反应混合物降温到0℃，将丙烯酸酐(195mg，1.55mmol)滴加到反应体系中，加完后在0℃反应约1小时。检测反应完全后，直接将反应混合物浓缩至干，所得残余物用制备色谱柱层析(色谱柱：silica gel,流动相：CHCl3/EtOH,20-60％乙醇；20min；检测波长：254nm)纯化。将所得产品有机相浓缩至干，得到300mg化合物121。
将300mg化合物121于20mL乙腈中，将甲磺酸(297.7mg，2.00equiv，2.0eq)滴加到体系中，保温搅拌1小时后将反应混合物在低温下浓缩至干，将所得残余物加水重新溶解后冷冻干燥后得466mg(39％)121的甲磺酸盐，为黄色固体。
LRMS(母分子)C29H29D3F3N7O2:(ES,m/z):571.3[M+H]+。
1H-NMR(甲磺酸盐):1H-NMR:(300MHz,DMSO-D6,ppm)：δ9.50(s,1H),9.26(br s,1H),8.75(s,1H),8.47(m,1H),8.36-8.34(m,2H),7.76(d,J＝8.1Hz,1H),7.43(d,J＝6.0Hz,1H),7.36-7.31(m,1H),7.24-7.18(m,1H),7.07(s,1H),6.75-6.66(m,1H),6.33-6.27(m,1H),5.80(d,J＝11.7Hz,1H),5.41-5.32(m,2H),3.33(m,4H),2.84(d,J＝4.8Hz,6H),2.67(s,3H),2.35(s,5H).
实施例122
1.中间体122-1的合成
氮气保护下，向500mL三口瓶中加入5-氟吲哚(10g，74.0mmol)，100mL重蒸无水四氢呋喃，将温度降至0℃，滴加37.1mL甲基溴化镁乙醚溶液(3.0M),滴加完毕后，保持0℃反应约30min，0℃下分批加入2,4-二氯嘧啶(16.5g，111mmol)，加料完毕后将反应体系自然回到室温反应过夜。检测反应完全后，向反应体系中滴加100mL氯化铵水溶液将反应淬灭，向所得混合物用100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用100mL饱和食盐水反洗1次，无水硫酸钠干燥后浓缩至干，所得固体用100mL乙腈洗1次，抽滤，收集滤饼烘干得到6g(33％)产品122-1，为黄色固体。LCMS：248.0。
2.中间体122-2的合成
氮气保护下，向100mL三口瓶中室温下将原料122-1(2.0g，8.08mmol)溶于50mL无水DMF中，然后降温至0℃分批加入NaH(65％，445mg，12.1mmol)，加料完毕后将反应体系保持0℃反应30min。然后0℃下滴加三氟甲磺酸三氟乙酯(2.8g，12.1mmol)，滴加完毕后将体系保持0℃反应1小时，检测反应完全后，将反应混合物倒入100mL冰水中淬灭反应，析出固体，将混合物过滤，收集滤饼并烘干得3g粗产品122-2，为黄色固体。LCMS：330.0。
3.中间体122-4的合成
在氮气保护下，向2000mL三口瓶中依次加入122-3(100g，709mmol)和800mL浓硫酸(H2SO4)，降温至0℃，维持温度在0-10℃之间分批加入硝酸钾(KNO3)(71.6g，708mmol)，用时1小时，最后在室温下反应过夜。反应结束后，向三口瓶中加入2升(L)冰水以淬灭反应。低温下将反应混合物用氨水调到pH为10，用1L二氯甲烷(DCM)萃取3次。有机相合并后，用3L饱和食盐水反洗3次，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得粗产品经硅胶柱层析(洗脱剂乙酸乙酯(EA):石油醚(PE)＝1:4-1:1)，洗脱液旋干后得到79g 122-4(产率：60％)，为黄色固体。
LCMS：187.0。
4.中间体122-5的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料122-2(3g，9.10mmol)溶于30mL异丙醇中，再依次将122-4(1.7g，9.13mmol)，对甲苯磺酸(2g，11.6mmol)加入到 反应体系中，加料完毕后将反应体系升温至105℃反应6h。检测反应完全后将反应体系降到室温，混合物过滤，收集滤饼，固体烘干得2.4g(55％)产品122-5，为黄色固体。LCMS：480.1。
5.中间体122-6的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料122-5(2.4g，5.01mmol)溶于30mL NMP中，再依次将N,N-三甲基乙二胺(770mg，7.54mmol)，无水碳酸钾(2.1g，15.2mmol)加入到反应体系中，加料完毕后将反应体系升温到100℃。反应2h后检测反应完全，将反应体系降至室温，将反应液倒入100mL冰水中淬灭，将混合物抽滤，收集滤饼并烘干，得到1.5g(53％)产品122-6，为红色固体。LCMS：562.2。
6.中间体122-7的合成
氮气保护下，在250mL单口瓶中，室温下，依次加入甲醇50mL，二氯甲烷50mL，原料122-6(1.5g，2.67mmol)，含水钯碳(10％，1.5g)，甲酸铵(1.5g)，加料完毕后将体系室温反应3h，检测反应完全。反应体系抽滤，收集滤液，浓缩至干。所得残余物用200mL二氯甲烷溶解，200mL碳酸氢钠水溶液反洗1次，再用200mL饱和食盐水洗1次，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩至干后得到1.1g(77％)产品122-7，为黄色固体。LCMS：532.2。
7.化合物122的合成
氮气保护下，在100mL三口瓶中，室温下将原料122-7(1.1g，2.07mmol)溶于30mL三氯甲烷中，将反应混合物降温到0℃，将丙烯酸酐(260mg，2.06mmol)滴加到反应体系中，加完后在0℃反应约1小时。检测反应完全后，直接浓缩至干，所得残余物用硅胶柱层析(色谱柱：silica gel,流动相：CHCl3/EtOH)；20-60％乙醇；20min；检测波长：254nm)纯化。将所得产品有机相浓缩至干，得到590mg化合物122。
将960mg化合物122于10mL乙腈中，将甲磺酸(96mg，1.00mmol，1.0eq)滴加到体系中，保温搅拌1小时后将反应混合物在低温下浓缩至干，将所得残余物加水重新溶解后冷冻干燥后得629.4mg(45％)122的甲磺酸盐，为黄色固体。
LRMS(母分子)C29H31F4N7O2:(ES,m/z):586.2[M+H]+。
1H-NMR(甲磺酸盐):(300MHz,DMSO-D6,ppm):δ9.45(s,1H),9.39(br s,1H),8.60(s,2H),8.35-8.34(m,2H),8.11(d,J＝8.7Hz,1H),7.74-7.71(m,1H),7.25(d,J＝5.4Hz,1H),7.19-7.12(m,1H),7.03(s,1H),6.78-6.70(m,1H),6.27(dd,J＝1.8Hz,17.1Hz,1H),5.79-5.75(m,1H),5.37-5.28(m,2H),3.87(s,3H),3.30(s,4H),2.82(d,J＝4.5Hz,6H),2.68(s,3H),2.33(s,3H)。
实施例123
1.中间体123-1的合成
氮气保护下，向100mL三口瓶中室温下将原料122-1(2.5g，10.1mmol)溶于50mL无水DMF中，然后降温至0℃分批加入NaH(65％，560mg，15.2mmol)，加料完毕后将反应体系保持在0℃反应30分钟。然后0℃下滴加1,1-二氟-2-溴乙烷(2.9g，20.0mmol)，滴加完毕后将体系回到室温反应过夜。检测反应完全后，将反应混合物倒入200mL冰水中淬灭反应，析出固体，将混合物过滤，收集滤饼，用50mL乙腈洗1次，并烘干得1.6g(51％)产品123-1，为黄色固体。LCMS：312.0。
2.化合物123的合成
从中间体123-1合成化合物123及其甲磺酸盐的实验步骤及反应条件与上述实施例122中第四步至第七步的化学反应相同。不同的是这里用中间体123-1取代了实施例122中的中间体122-2。
化合物123的数据：
LRMS(母分子)C29H32F3N7O2:(ES,m/z):568.3[M+H]+。
1H-NMR(甲磺酸盐):(300MHz,DMSO-D6,ppm):δ9.43(br s,2H),8.79(s,1H),8.60(s,2H),8.35-8.26(m,2H),8.00(br s,1H),7.75-7.71(m,1H),7.19-7.13(m,1H),7.09(s,1H),7.03(s,1H),6.50-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),4.91-4.81(m,2H),3.84(s,3H),3.33(s,4H),2.82(d,J＝4.8Hz,6H),2.67(s,3H),2.34(s,6H)。
实施例124
1.中间体124-1的合成
氮气保护下，向250mL三口瓶中加入6-氟吲哚(5g，37.0mmol)，100mL无水四氢呋喃，将温度降至0℃，滴加18.5mL甲基溴化镁乙醚溶液(3.0M),滴加完毕后，保持0℃反应约30分钟，0℃下分批加入2,4-二氯嘧啶(8.28g，55.6mmol)，加料完毕后将反应体系自然回到室温反应过夜。检测反应完全后，向反应体系中滴加100mL氯化铵水溶液将反应淬灭，向所得混合物用100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用100mL饱和食盐水反洗1次，无水硫酸钠干燥后浓缩至干，所得固体用50mL乙腈洗1次，抽滤，收集滤饼烘干得到6.1g(67％)124-1，为黄色固体。LCMS：248.0。
2.中间体124-2的合成
氮气保护下，向250mL三口瓶中室温下将原料124-1(6.1g，24.6mmol)溶于100mL无水DMF中，然后降温至0℃分批加入NaH(65％，1.4g，37.9mmol)，加料完毕后将反应体系保持0℃反应30分钟。然后0℃下滴加三氟甲磺酸三氟乙酯(8.6g，37.1 mmol)，滴加完毕后将体系保持0℃反应2小时，检测反应完全后，将反应混合物倒入200mL冰水中淬灭反应，析出固体，将混合物过滤，收集滤饼并烘干得3g(37％)产品124-2，为黄色固体。LCMS：330.0。
3.化合物124的合成
从中间体124-2合成化合物124及其甲磺酸盐的实验步骤及反应条件与上述实施例122中第四步至第七步的化学反应相同。不同的是这里用中间体124-2取代了实施例122中的中间体122-2。
化合物124的数据：
LRMS(母分子)C29H31F4N7O2:(ES,m/z):586.2[M+H]+。
1H-NMR(甲磺酸盐):(300MHz,DMSO-D6,ppm)：δ9.70(br s,1H),8.67(br s,1H),8.55(s,1H),8.39-8.34(m,2H),8.11(s,1H),7.65(dd,J＝2.1Hz,9.9Hz,1H),7.26(d,J＝5.4Hz,1H),7.06-6.99(m,2H),6.72-6.63(m,1H),6.32-6.22(m,1H),5.78-5.77(m,1H),5.37-5.25(m,2H),3.89(s,3H),3.31-3.07(m,4H),2.65-2.56(m,8H),2.32(s,3H)。
实施例125
1.中间体125-1的合成
氮气保护下，向100mL三口瓶中室温下将原料124-1(2.5g，10.1mmol)溶于50mL无水DMF中，然后降温至0℃分批加入NaH(65％，560mg,15.2mmol)，加料完毕后将反应体系保持0℃反应30分钟。然后0℃下滴加1,1-二氟-2-溴乙烷(2.9g，20.0mmol)，滴加完毕后将体系回到室温反应过夜。检测反应完全后，将反应混合物倒入100mL冰水中淬灭反应，析出固体，将混合物过滤，收集滤饼，用50mL乙腈洗1次，烘干得1.5g(48％)产品125-1，为黄色固体。LCMS：312.0。
2.化合物125的合成
从中间体125-1合成化合物125及其甲磺酸盐的实验步骤及反应条件与上述实施例122中第四步至第七步的化学反应相同。不同的是这里用中间体125-1取代了实施例122中的中间体122-2。
化合物125的数据：
LRMS(母分子)C29H32F3N7O2:(ES,m/z):568.3[M+H]+。
1H-NMR(甲磺酸盐):(300MHz,DMSO-D6,ppm):δ9.55(s,2H),9.26(br s,1H),8.72(s,1H),8.32-8.30(m,3H),7.64(d,J＝9.9Hz,1H),7.42(d,J＝6.3Hz,1H),7.08(s,1H),7.05-6.99(m,1H),6.73-6.26(m,3H),5.82-5.78(m,1H),4.89-4.78(m,2H),3.87(s,3H),3.34(m,4H),2.84(d,J＝4.8Hz,6H),2.68(s,3H),2.34(s,7H).
实验实施例
细胞生长抑制实验：
用测定细胞的生长的方法来鉴定优先靶向针对某些变异形态的EGFR，而对野生型EGFR的活性相对较弱的化合物。NCI-H1975细胞株是含有T790M和L858R EGFR突变的人类非小细胞肺癌细胞，该细胞生长在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(GIBCO)中。LoVo细胞株是一个野生型EGFR的人结肠腺癌细胞，该细胞生长在含有10％FBS的F-12K培养基(GIBCO)中。NCI-H1975和LoVo细胞的生长快慢由Cell Titer-Glo发光活力测定法(Promega公司#G7572)来检测。
简要地说，用胰蛋白酶来消化在对数生长期的细胞，并以每孔5000个Lovo或3000个NCI-H1975细胞接种到96孔板中，并孵育在37℃，有5％CO2的湿润的培养箱内，同时设不接种细胞仅加入营养液的空白对照孔。24小时后，将不同化合物的DMSO溶液用细胞培养基液体从高到低稀释到不同浓度，每次用3.16倍稀释，共有8个不同浓度。NCI-H1975细胞中测试药物的浓度从0.03nM-100nM,LoVo细胞中测试药物的浓度从3nM-10μM。然后将不同化合物的细胞培养基液体加入到有细胞的96孔细胞板中，同时设一个仅含有DMSO的细胞培养基液体的细胞对照孔。在药物处理72小时后，将细胞板从培养箱中取出并放置在室温下30分钟。然后加Cell Titer-Glo试剂到孔中，并将96孔细胞板在室温下摇晃10分钟，以诱导细胞裂解。再将96孔细胞板放在实验台上2分钟，让发光信号稳定。最后将96孔细胞板放入EnVision多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)中，用0.5秒的积分时间来读取信号。
计算公式为：
细胞生长抑制百分比％＝(最大信号–化合物信号)/(最大信号-最小信号)*100％
最大信号由没有化合物的DMSO对照处理的细胞对照孔中获得；
化合物信号由加入化合物的药物处理的细胞孔中获得
最小信号由没有细胞的，只有营养液的空白对照孔中获得。
通过GraphPad Prism V5.0软件计算出细胞生长抑制曲线，并基于此数据计算出获得50％抑制效果所需的化合物浓度，即化合物IC50。
所得结果列在下表1中。
表1：化合物活性实验结果