本发明涉及羟基红花黄色素A的提取方法，具体是一种从红花中提取羟基红花黄色素A的方法。
背景技术：
：红花为菊科植物红花属红花的干燥花，性味辛温。入心，肝经，具有祛瘀止痛功效，是多种活血化瘀方剂的良药。目前已知的从红花中分离鉴定出的化学成份有多种，这些化学成份中主要含有黄酮类、木脂素类、多炔类等，其中有药效的成份主要是黄酮类、脂肪酸以及红花多糖。黄酮类包括红花黄色素，羟基红花黄色素A等；研究红花黄酮类化合物，我们常常将查尔酮类化合物单独作为研究对象，红花中查尔酮类化合物占红花总量的20％-30％，红花中查尔酮类化合物多为色素类成份，而其中最重要的就是红花黄色素，由红花黄色素A和红花黄色素B及其衍生物组成，其中以羟基红花黄色素A的研究最为广泛，它是红花中含量最高的成份。羟基红花黄色素A是一种查尔酮葡萄糖苷，其稳定性差，易受温度、相对湿度、光照等条件的影响，温度越高，加热时间越长，就越不稳定；光照对羟基红花黄色素A的稳定性也有一定影响，最好避光保存。中国专利公开号为CN102127124A的申请中公开了采用温浸法提取，澄清剂除杂，上柱后，通过高速逆流色谱，进行柱层析后浓缩干燥制备高纯度羟基红花黄色素A的方法，由于该方法步骤繁琐且使用大量试剂和仪器，比较适用于小剂量羟基红花黄色素A的制备，不能工业化生产。中国专利公开号为CN102702150A的申请中公开了从红花中超声提取，大孔树脂和葡聚糖凝胶的分离，超滤和冷冻干燥等纯化制备羟基红花黄色素A的方法，该方法中使用的葡聚糖凝胶价格昂贵，提高了生产成本，同样不适合大规模生产。中国专利公开号为CN101195647A的申请公考了温浸法提取，浓缩，离心，上柱和反复柱层析， 除菌后喷雾干燥制备羟基红花黄色素A的方法，由于羟基红花黄色素A的热不稳定性，使用温浸法，热浓缩，喷雾干燥等工艺会降低羟基红花黄色素A的收率。因此，寻找一条合适的工艺方法才能保证最终所得到的羟基红花黄色素A既有较高的含量，又不会破坏活性。技术实现要素：本发明的目的就是针对目前从红花中提取羟基红花黄色素A的方法，普遍存在操作步骤繁琐，需要使用大量仪器和设备，成本高昂，难以实现工业化生产，并且制得的羟基红花黄色素A收率低，稳定性差等问题，提供一种从红花中提取羟基红花黄色素A的方法，本发明方法无有机溶剂残留，操作简单，纯度及提取率高，利用工业大规模生产。本发明的一种从红花中提取羟基红花黄色素A的方法，包括下述步骤：(1)羟基红花黄色素A的提取将红花原料打碎成20-100目的粉末，加入10-30倍水，超声提取20-60min，提取1-3次，合并提取液过滤，滤液60℃减压浓缩，加入壳聚糖凝胶，搅拌4-8h，低温静置20-24h后离心，得到羟基红花黄色素A粗提液；(2)吸附和解析调节上述粗提液的pH至4-6，经大孔树脂吸附，水洗至流出液无Molish反应，加入5-15％的低浓度酒精进行解析，收集解析液；(3)干燥将解析液减压浓缩至无酒精后，冷冻干燥，即得到羟基红花黄色素A含量达80.7％的成品。本发明中所述红花原料打碎成100目粉末时提取效果最好。本发明中所述步骤(1)中的离心转速为6600r/min。本发明中所述大孔树脂为D101型或D3020型或HPD400型中的任意一种，其中选用D3020 时吸附解析效果最好。本发明方法将红花原料打碎成粉末可以使得羟基红花黄色素A更好的溶出，而超声法更可以在短时间内有效的提高羟基红花黄色素A的溶出率，壳聚糖凝胶可以利用电荷和大分子的架桥作用，可以安全有效的沉淀红花浸提液中含有的大量蛋白质，多糖，鞣质等。采用大孔树脂吸附纯化羟基红花黄色素A，减压浓缩和冷冻干燥可以很好的减少羟基红花黄色素A的损失，这些工艺的组合达到了比较好的技术效果，是本发明提取效率高的关键技术。本发明中所采用的红花粒径、超声提取的料液比，超声时间及次数，上柱的料液pH值，流速，解析液浓度等工艺参数均是在大量实验的基础上获得的，具体实验过程如下：一、红花粉末粒径的确定在其他工艺条件相同的情况下，将红花原料打碎成20目，40目，60目，80目，100目的粉末，各称取50g，加入20倍的水量，超声提取30min，再加入20倍水量重复提取3次，过滤，得到浸提液，减压浓缩至100ml，用高效液相色谱法检测羟基红花黄色素A的含量，结果见表1。表1红花粉末粒径试验红花粉末粒径/目20406080100羟基红花黄色素A含量/mg/L15.7016.8116.9919.5523.90从表1中可看出，红花粉末粒径为100目时，所得到的羟基红花黄色素A的含量最高。二、最佳提取条件的确定超声提取作为一种提取方法，具有提取速度快，提取率高，提取温度适宜的优点，比较适合用于红花这种对热敏感材料的快速提取。通过对超声料液比，超声时间，次数等因素对羟基红花黄色素A含量的影响，确定了各因素的最佳条件。结果见表2、表3。试验方法：将100目红花粉末50g，加入一定比例的纯水，用超声提取一定时间，过滤， 重复超声浸提几次，合并滤液，减压浓缩至100ml，用高效液相色谱法检测羟基红花黄色素A的含量。表2因素水平表表3正交试验表从表2、表3可以得出，表2中的三因素对收得率的影响顺序为RA>RB>RC，即料液比>超声时间>超声次数。最优方案为：A2B3C3，即料液比1:20，超声时间60min，超声次数3次。三、除杂中壳聚糖凝胶的确定红花浸提液中，含有大量的杂质，为了得到更纯的羟基红花黄色素A，本发明利用壳聚糖凝胶与蛋白质等物质的架桥作用，絮凝沉淀除杂，且无毒无害，对羟基红花黄色素A的活性没有影响，因此使用壳聚糖凝胶可以很好的澄清溶液，保证了安全生产。通过对浸提液浓缩体积，壳聚糖凝胶添加量，搅拌时间等因素对羟基红花黄色素A含量的影响，确定了各因素的最佳条件。试验方法：将100目红花粉末50g，加入1:20的纯水，用超声提取60min，过滤，重复超声浸提3次，合并滤液，减压浓缩至一定体积，加入不同量的壳聚糖凝胶，50℃搅拌一定时间，低温静置24h，离心6600r/min，浓缩至100ml，检测羟基红花黄色素A的含量。用高效液相色谱法检测羟基红花黄色素A的含量。结果见表4、表5。表4因素水平表表5正交试验表从表4、表5可以得出，表4中的三因素对收得率的影响顺序为RB>RA>RC，即壳聚糖凝胶添加量>浓缩体积>搅拌时间。最优方案为：A2B3C1，即浓缩体积1/4，壳聚糖凝胶添加量15g，搅拌时间4h。四、纯化条件的确定首先对大孔树脂型号的确定：分别称取AB-8，D101，D3020，HPD100，HPD400这五种型号大孔树脂各5g(湿重)，放入100mL锥形瓶中，加入除杂后的提取液100mL，密塞，置于水浴振荡器中，振荡频率为50r/min，振荡24h，充分吸附后，过滤，取滤液分别测羟基红花黄色素A的含量。结果见表6。计算各种树脂在室温下的吸附量Y(mg/g湿树脂)。Y＝(C0-Cr)*V/W式中：C0—吸附前羟基红花黄色素A的含量(mg/mL)；Cr—吸附后羟基红花黄色素A的含量(mg/mL)；V—样品溶液体积(mL)；W—树脂质量(g)。表6不同型号树脂静态吸附结果树脂型号C0CrYAB-8408.57356.841034.6D101408.57201.224147D3020408.57197.454222.4HPD100408.57305.142068.6HPD400408.57205.384063.8从表6中可以看出：D101，D3020，HPD400三种型号的大孔树脂吸附羟基红花黄色素A能力明显高于其他2种，而D3020的吸附力是最好的，故选择D3020作为吸附用的大孔树脂。对大孔吸附树脂工艺的确定：通过以上的树脂筛选实验，使用大孔吸附树脂D3020上柱，使用低浓度酒精洗脱树脂，可以很好的保存羟基红花黄色素A的活性。通过上样溶液pH，流速，洗脱液浓度等因素对羟基红花黄色素A含量的影响，确定了各因素的最佳条件。试验方法：将100目红花粉末50g，加入1:20的纯水，用超声提取60min，过滤，重复超声浸提3次，合并滤液，减压浓缩至1/4，加入15g的壳聚糖凝胶，50℃搅拌一定时间，低温静置24h，离心6600r/min，取上清液，调节一定的pH，以一定的流速经过D3020大孔吸附树脂，用水冲洗至流出液无Molish反应，加入低浓度酒精进行解析至无颜色流出，减压浓缩解析液至无酒精，冷冻干燥，检测羟基红花黄色素A的含量。用高效液相色谱法检测羟 基红花黄色素A的含量。结果见表7、表8。表7因素水平表表8正交试验表从表8可以得出，以上三因素对收得率的影响顺序为RA>RC>RB，即pH>洗脱液浓度>流速。最优方案为：A3B1C3，即pH值为6，流速为1L/h，洗脱液浓度15°。本发明方法无有机溶剂残留，操作简单，纯度及提取率高，利用工业化生产。具体实施方式实施例1一种从红花中提取羟基红花黄色素A的方法，包括下述步骤：⑴羟基红花黄色素A的提取取100目的红花粉末100g，加入20倍的水，超声提取60min，反复提取3次，合并过滤，滤液60℃减压浓缩1/4，加入壳聚糖凝胶30g，搅拌4h，低温静置24h后离心6600r/min，得到羟基红花黄色素A粗提液；⑵吸附和解析将上述粗提液调节pH至6，以流速1L/h经过大孔吸附树脂D3020进行吸附，水洗至流出液无Molish反应，加入15％的低浓度酒精进行解析，收集解析液；⑶干燥将解析液减压浓缩至无酒精后，冷冻干燥，即得到羟基红花黄色素A的含量达80.7％的成品。实施例2一种从红花中提取羟基红花黄色素A的方法，包括下述步骤：⑴羟基红花黄色素A的提取取100目的红花粉末500g，加入30倍的水，超声提取60min，反复提取3次，合并过滤，滤液60℃减压浓缩1/2，加入壳聚糖凝胶150g，搅拌4h，低温静置24h后离心6600r/min，得到羟基红花黄色素A粗提液；⑵吸附和解析将上述粗提液调节pH5，以流速1L/h经过大孔吸附树脂D3020进行吸附，水洗至流出液无Molish反应，加入10％的低浓度酒精进行解析，收集解析液；⑶干燥将解析液减压浓缩至无酒精后，冷冻干燥，即得到羟基红花黄色素A的含量达78.7％的成品。当前第1页1 2 3