苯并杂环化合物及其应用的制作方法

本发明涉及用于治疗或预防败血症或败血性休克及癌症的化合物。更具体而言，本发明涉及苯并杂环衍生物及其于抑制pd-l1表现及增加hla-dr表现的应用。

背景技术：

败血症是定义为由可出现在身体任何位置(诸如泌尿生殖道、肝脏或胆道、胃肠道、肺、手术伤口等)的微生物入侵产生的全身性发炎反应症候群(sirs)。感染一般通过血培养阳性确认，且可导致称为败血性休克的休克，其导致生命器官衰竭的败血症的结果。临床上，败血症是通过感染及sirs共同确定。当注意到高于正常的白血球(wbc)计数时，或胸放射照相与肺炎一致时怀疑为感染。sirs的证据包含生命征兆的紊乱。

目前，败血症代表的主要临床问题是治疗选择有限。仅有一种药物，重组人类活化蛋白c已获fda核准用于治疗严重败血症。然而，已于大量患者中报导显著副作用(例如，严重出血)。此外，对于急性生理学及慢性健康评估(apache)ii分数≤25(abrahame等人，nengljmed(2005)353,1332-1341.)的严重败血症患者没有效果。

最近，据报导败血症与被称为“免疫麻痹”的免疫抑制的形式有关，其特征为单核细胞内人白血球抗原((hla)dr(hla-dr))的表现减少及程序性死亡-配体1(pd-l1)的表现增加(hotchkissrs及opals,(2010)nengljmed363,87-89)。因此，假若药剂成功回复与败血症患者相关的hla-dr及pd-l1的独特表现，则此药剂可用于治疗或预防败血症或败血性休克。

另一方面，临床上，已于多种人类慢性感染性疾病(诸如hiv、病毒性肝炎、巨大细胞病毒感染及潜伏结核分枝杆菌)中记录到单核细胞/apc上的pd-l1的向上调节(saresellam,rainonev,al-daghrinm,clericim,trabattonid(2012)thepd-1/pd-l1pathwayinhumanpathology.currmolmed12:259-267)，其导致被认作为“t细胞衰竭”的t细胞效应器功能的抑制(watanabet,bertolettia,tanotota(2010)pd-1/pd-l1pathwayandt-cellexhaustioninchronichepatitisvirusinfection.jviralhepat17:453-458)。于有不同形式及阶段的癌症的患者中亦观察到pd-l1/pd-1相互作用增加的类似免疫受损(chenih,laiyl,wucl,changyf,chucc等人(2010)immuneimpairmentinpatientswithterminalcancers:influenceofcancertreatmentsandcytomegalovirusinfection.cancerimmunolimmunother59:323-334)。最近，有3种免疫治疗药物市售用于癌症治疗，两种抗pd-1mab(默沙东(keytruda)，mds；尼沃单抗(nivolumab)，bms)及一种抗ctla-4mab(伊匹单抗(yervoy)，bms)。所有3种生物制剂目前核准用于治疗黑色素瘤；然而正在对包括肺癌、肾脏-泌尿系癌、乳癌及其他实质固态瘤在内的多种癌症积极地开展试验。若干国际试验的早期结果获得不仅具有临床疗效而且显示持久效果的意外结果(topaliansl,hodifs,brahmerjr,gettingersn,smithdc等人(2012)safety,activity,andimmunecorrelatesofanti-pd-1antibodyincancer.nengljmed366:2443-2454.；brahmerjr,tykodiss,chowlq,hwuwj,topaliansl等人(2012)safetyandactivityofanti-pd-l1antibodyinpatientswithadvancedcancer.nengljmed366:2455-2465)。因此，预计癌症免疫疗法已在所有癌症治疗方案中60％的方案中起重要作用。

就前文而言，此项技术领域中存在可逆转与败血症患者相关的hla-dr及pd-l1的特征性表现的药剂的需要。此药剂可用作制造用于治疗患有或怀疑患有败血症或败血性休克及癌症的患者的药物的前驱化合物。

技术实现要素：

本发明提供一种式(i)的化合物：

其中

n为0或1，

r1选自卤素、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基，其中胺基烷基的胺基部分为未经取代或经一个或两个烷基基团取代，且所述环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可是经–so2nh2或-conh2取代；

r2选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；

r3选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；或

r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，其中所述苯环为未经取代或经一个或更多个独立地选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基的基团取代，限制条件为n为1；及

r4、r5及r6各者独立地选自氢、卤素、胺基、羟基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；其中r2至r6中的所述环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可为未经取代或经一个至四个选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基的基团取代；

限制条件为(1)n为1时，r1是及r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，r4、r5及r6不可同时代表氢；(2)n为0且r1选自环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基时，r3、r4、r5及r6不同时为氢；(3)n为0时，r1为且r3及r6同时代表氢，若r4及r5中一者为氢，则另一者不可为甲基、第三丁基或硝基；(4)n为0时，r1为且r3及r6同时表示氢，r4及r5不可同时表示氯；及(5)n为0且r1为时，r3、r4、r5及r6不可同时代表氯

或其互变异构物、立体异构物或对映异构物，或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于式(i)的一些实施例中，n为1；r1为(c1-10(二)烷胺基)c1-10烷基、羟基c1-10烷基或经–so2nh2或–co2nh2取代的c6-10芳基；r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，其中所述苯环为未经取代或经一个或更多个独立地选自卤素、胺基、氰基、硝基或c1-10烷基的基团取代；r4为h、卤素或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的未经取代或经取代的5-至10-元单环或二环杂芳基；且r5及r6各独立地为氢、卤素、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基或卤基c1-10烷基。于式(i)的一些实施例中，n为0，r1为经–so2nh2或–co2nh2取代的c6-10芳基；及r3、r4、r5及r6各者独立地选自氢、卤素、胺基、氰基、硝基或c1-10烷基。

本发明亦提供包括有效量的本发明的化合物及医药上可接受的载剂的医药组合物。本发明亦提供一种用于抑制个体内pd-l1表现的方法，其包括对所述个体投与有效量的本发明的化合物或医药组合物。本发明亦提供一种用于增加个体内hla-1表现的方法，其包括对所述个体投与有效量的本发明的化合物或医药组合物。本发明进一步提供一种用于治疗或预防个体内pd-l1相关癌症或败血症或败血性休克的方法，其包括对个体投与有效量的本发明的化合物或医药组合物。相应地，本发明提供一种本发明的化合物或医药化合物用于制造抑制个体内pd-l1含量的药物的用途。亦提供一种本发明的化合物或医药化合物于制造用于治疗或预防个体内pd-l1相关癌症或败血症或败血性休克的用途。

附图说明

图1显示败血性休克患者及正常健康个体内pd-l1及hla-dr的各别含量。

图2显示绘示lps预刺激单核细胞模型系统(lps-primedmonocytemodelsystem)内pd-l1的增加及hla-dr的降低的线图。

图3显示绘示ml-c19-a、ml-c19-b、ml-a1-b、或ml-a1-c对lps预刺激单核细胞模型系统内pd-l1及hla-dr的表现程度的影响的线图。

图4显示ml-c19-a、ml-c19-b、ml-a1-b、或ml-a1-c对lps预刺激单核细胞模型系统内pd-l1的含量的剂量依赖性。

图5显示pd-l1表现对ifn-γ刺激b16f10癌细胞系(ifn-γstimulatedb16f10cancerline)的影响。ifn-γ刺激单核细胞(ifn-γstimulated-monocytes)于dmso媒剂对照、ml-a1-b或ml-a1-c存在下培养1天。收集经处理的细胞及使用流式细胞亮度计分析pd-l1分子。表面分子表现是表示为相对于使用dmso媒剂对照培养基处理的细胞的各天的mfi。值是表示为平均数±sem(来自3个独立实验)。

图6显示对b16f10癌细胞系及人类pbmc的直接细胞毒性。b16f10及人类pbmc于不同浓度的ml-a1-b及ml-a1-c化合物的存在下培养1天。通过mts分析监测细胞毒性。dmso对照组的光学密度是取作100％细胞存活率。值是表示为平均数±sem(来自3个独立实验)。

图7显示经i.v.注射b16f10肿瘤细胞后的肺转移。用2×10⁵个b16f10肿瘤细胞i.v.注射c57bl/6(n＝11/组)小鼠。使用2mg/kg的ml-a1-b、ml-a1-c、或dmso媒剂对照。在第14天时将动物杀死及计算肺中肿瘤结节数目。数据是表示为各只小鼠的数目及各组的平均数。亦显示各组的肺的代表性相片(左)。

图8显示经i.v.注射b16f10肿瘤细胞后的肺转移。用2×10⁵个b16f10肿瘤细胞i.v.注射nod/scid(n＝5/组)小鼠。使用2mg/kg的ml-a1-b、ml-a1-c、或dmso媒剂对照。在第14天时将动物杀死及计算肺中肿瘤结节数目。数据是表示为各只小鼠的数目及各组的平均数。亦显示各组的肺的代表性相片(左)。

图9显示化合物ml-a1-b及ml-a1-c的毒性分析结果。

图10显示抗pd-1抗体与化合物ml-c19-a及ml-a1-c的组合疗法。

具体实施方式

本发明发现一系列苯并杂环衍生物及其于抑制pd-l1表现及增加hla-dr表现的应用。相应地，这些化合物可治疗及/或预防pd-l1相关疾病(诸如pd-l1相关癌症及败血症或败血性休克)。特定言之，通过这些化合物治疗癌症包含癌症免疫治疗而无细胞毒性。换言之，这些化合物可对癌症进行免疫治疗而不会杀死细胞。

以下结合附图所提供的详述意在描述本发明实例且无意代表构建或使用本发明实例的仅有形式。本发明阐述这些实例的功能及构建及操作这些实例的步骤的顺序。然而，相同或等效功能及顺序可通过不同实例完成。

定义

出于简便考虑，本发明语境中使用的某些术语已集中至此。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术领域的一般技艺者通常所理解相同的含义。

除非上下文另有明确表示，否则本文中所使用的单数形式“一”、“一个”及“所述”包含复数指代物。

如本文中所使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指实现所需药理学及/或生理学效应(例如，改善疾病相关症状)。就完全或部份地预防疾病或其症状而言，所述效应可为预防性；及/或就部份或完全地治愈疾病及/或归因于所述疾病的副作用而言，所述效应可为治疗性。本文中所使用的“治疗”包括哺乳动物(特定言之人类)的疾病的预防性(preventative)(例如，预防性(prophylactic))、治愈性或缓解性治疗；及包括：(1)对发生于易患所述疾病但尚未诊断为患有此疾病的个体的所述疾病或病状(例如，癌症或心脏衰竭)的预防性(例如，预防性(prophylactic))、治愈性或缓解性治疗；(2)抑制疾病(例如，通过阻止其发展)；或(3)缓解疾病(例如，减少与疾病相关的症状)。

于本文中可互换使用的术语“投与(administered、administering或administration)”是指递送模式，包括(但不限于)经静脉内、经肌肉内、经腹膜内、经动脉内、经皮下、或经皮投与本发明的药剂(例如，化合物或组合物)。

如本文中所使用，术语“预防(prevent、preventing及prevention)”是指预防疾病或病症、或其一个或更多个其症状的出现、复发、或扩散。于某些实施例中，这些术语是指于症状出现之前，尤其对具有本文中所提供的疾病或病症的风险的患者而言，用本文中所提供的化合物或抗体或剂型治疗或投与本文中所提供的化合物或抗体或剂型，使用或不使用一种或多种其他额外活性剂。这些术语包括抑制或减轻特定疾病的症状。就此而言，术语“预防(prevention)”可与术语“预防性治疗(prophylactictreatment)”互换使用。

如本文中所使用的术语“有效量”是指于一定剂量及时间段下就治疗而言有效达成所欲结果的量。例如，在治疗败血症时，减少、预防、延迟、抑制或阻止败血症的任何症状的药剂将是有效。药剂的有效量并不要求治愈疾病或病状但会治疗疾病或病状，从而延迟、阻碍、或预防所述疾病或病状的出现，或改善所述疾病或病状的症状。所述有效量可为单次剂量或以适宜形式分为两次或更多次剂量以于整个指定时间段内投与一次、两次或更多次。

术语“个体”或“患者”是指可用本发明的方法治疗的动物(包含人类)。除非明确表明一种性别，否则术语“个体”或“患者”是意指雄性及雌性。相应地，术语“个体”或“患者”包括可受益于本发明的治疗方法的任何哺乳动物。

如本文中所使用，术语“抗癌剂”或“癌症治疗剂”是意在包含抗增生药剂及化疗剂。

如本文中所使用，术语“共投与”及“与...组合”包含于非指定时间限制内(除非另外指出)同时(simultaneously/concurrently)、或依序投与两种或更多种治疗药剂。于一实施例中，这些治疗药剂是于相同组合物或单位剂型内。于其他实施例中，这些治疗药剂是于不同组合物或单位剂型内。

于本文中所使用的术语“医药上可接受”是指彼等在医药判断范围内适宜与人体及动物组织接触使用而无过度毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症，且符合合理效益/风险比的化合物、物质、组合物、及/或剂型。

如本文中所使用，“医药上可接受的盐”是指所揭示的化合物的衍生物，其中母体化合物是通过制造其酸性或碱性盐而修饰。医药上可接受的盐包括(但不限于)碱性残基(如胺、吡啶、嘧啶及喹唑啉)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(如羧酸类)的碱性盐或有机盐；及类似者。

如本文中所使用，术语“医药上可接受的载剂”是指任一标准药用载剂，例如磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、水、及乳液(如油/水或水/油乳液)、及多种湿润剂。这些组合物可包含安定剂及保存剂及任一以上提及的载剂，附加条件是其等可在活体内使用。对于载剂、安定剂及佐剂的实例而言，参见martinremington'spharm.sci.，第18版，mackpubl.co.,easton,pa.(1995)及“physician'sdeskreference,”第58版，medicaleconomics,montvale,n.j.(2004)。

如本文中所使用，术语“立体异构物”是仅为原子的空间取向不同的单个分子的所有异构物的一般术语。其包括对映异构物及具有一个以上手性中心且彼此不为镜像的化合物的异构物(非对映异构物)。

术语“手性中心”是指附有四个不同基团的碳原子。

术语“对映异构物”及“对映异构物的”是指不可与其镜像重合且因而具有光学活性的分子，其中所述对映异构物使偏振光平面于一个方向上旋转且其镜像化合物使偏振光平面于相反方向上旋转。

如本文中所使用，卤基或卤素是指氟、氯、溴或碘。当术语“卤基”是用作(例如)烃基的词头时，其意为所述烃基是经至少一种卤素取代。

如本文中所使用，术语“烃基”是指通过自烃移走一个氢原子形成的单价基团，如烷基、烯基、炔基等，如以下进一步说明。

如本文中所使用，术语“烷基”是指含有指定数目碳原子的直链或分支链烃链。例如，“c1-c6烷基”选自具有1至6个碳原子的直链及分支链非环状烃。代表性直链c1-c6烷基基团包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、及-正已基。代表性分支链c1-c6烷基包括-异丙基、-第二丁基、-异丁基、-第三丁基、-异戊基、-新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、及3,3-二甲基丁基。

如本文中所使用，术语“烯基”是指含有指定数目碳原子及一个或更多个双键的直链或分支链烃链。例如，“c2-c6烯基”选自具有2至6个碳原子且包含至少一个碳-碳双键的直链及分支链非环状烃。代表性直链及分支链c2-c6烯基基团包括-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己烯基、2-己烯基、及3-己烯基。

如本文中所使用，术语“炔基”是指含有指定数目碳原子及一个或更多个三键的直链或分支链烃链。例如，“c2-c6炔基”选自具有2至6个碳原子且包含至少一个碳-碳三键的直链及分支链非环状烃。代表性直链及分支链c2-c6炔基基团包含-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基、-4-戊炔基、-1-己炔基、-2-己炔基、及-5-己炔基。

如本文中所使用，“环烷基”是指选自c3-c12环烷基，且优选为c3-8环烷基的基团。典型环烷基基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、及环壬基。

如本文中所使用，术语“烷氧基”是指含有指定数目碳原子的直链或分支链烷氧基基团。例如，c1-6烷氧基意指含有至少1个且至多6个碳原子的直链或分支链烷氧基基团。如本文中所使用的“烷氧基”的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丙-2-氧基、丁氧基、丁-2-氧基、2-甲基丙-1-氧基、2-甲基丙-2-氧基、戊氧基及己氧基。

如本文中所使用，术语“烷硫基”(亦称为烷基硫基)是指直链或分支链烷基基团(优选具有1至6个碳原子，例如1至4个碳原子(c1-c6-烷硫基))，其经由位于烷基基团内任何键上的硫原子结合至分子剩余部分。c1-c4-烷硫基的实例包括甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、第二丁基硫基、异丁基硫基及第三丁基硫基。除彼等针对c1-c4-烷硫基所提及者以外，c1-c6-烷硫基的实例包括1-、2-及3-戊硫基、1-、2-及3-已硫基及其位置异构物。

如本文中所使用，术语“烷氧基烷基”是指基团–alk1-o-alk2，其中alk1为烷基或烯基，且alk2为烷基或烯基。

如本文中所使用，术语“(二)烷胺基”是指基团--nrr'，其中r为烷基，且r'为氢或烷基。

如本文中所使用，“芳基”是指选自c6-14芳基的基团，特别是c6-10芳基。典型c6-14芳基基团包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基及茀基基团

如本文中所使用，“杂芳基”是指具有5至14环原子；环状数组中共享6、10或14个π电子；且含有碳原子及1、2或3个氧、氮及/或硫杂原子的基团。杂芳基基团的实例包含吲唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、恶唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异恶唑基、异噻唑基、恶二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、嗒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、三嗪基、氮呯基、恶氮呯基、吗啉基、硫氮呯基、二氮呯基、噻唑啉基、苯并咪唑基、苯并恶唑基、咪唑并吡啶基、苯并恶嗪基、苯并噻嗪基、苯并噻吩基、恶唑并吡啶基、苯并呋喃基、喹啉基、喹唑啉基、喹恶啉基、苯并噻唑基、苯二酰亚胺基、苯并呋喃基、苯二氮呯基、吲哚基、二氢茚基、氮杂吲唑基、去氮嘌呤基及异吲哚基。

如本文中所使用，术语“胺基”或“胺基基团”是指--nh2。当术语“胺基”是用作(例如)烃基的词头时，其意指所述烃基是经至少一个胺基基团取代。

如本文中所使用，术语“氰基”是指-c≡n。当术语“氰基”是用作(例如)烃基的词头时，其意指所述烃基是经至少一个氰基基团取代。

如本文中所使用，术语“硝基”是指-no2。当术语“硝基”是用作(例如)烃基的词头时，其意指所述烃基是经至少一个硝基基团取代。

如本文中所使用，术语“羟基”是指–oh。当术语“羟基”是用作(例如)烃基的词头时，其意指所述烃基是经至少一个羟基基团取代。

如本文中所使用，术语“视情况经取代”是指未经取代或经一个或更多个取代基取代的基团。例如，当将基团c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、--o--c1-c6烷基、--o--c2-c6烯基及--o--c2-c5炔基称为视情况经取代时，其等可经取代或可不经取代。

本发明的化合物

于一态样中，本发明提供一种具有以下式(i)的化合物，

其中

n为0或1，

r1选自卤素、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3-至10-元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5-至10-元单环杂芳基或二环杂芳基，其中胺基烷基的胺基部分为未经取代或经一个或两个烷基基团取代，且环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可是经–so2nh2或-conh2取代；

r2选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；

r3选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；或

r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，其中所述苯环为未经取代或经一个或更多个独立地选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基的基团取代，限制条件为n为1；及

r4、r5及r6各独立地选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；其中r2至r6中的所述环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可为未经取代或经一个至四个选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基或c3-10环烷基的基团取代；

限制条件为(1)n为1时，r1是及r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，r4、r5及r6不可同时代表氢；(2)n为0且r1选自环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基时，r3、r4、r5及r6不同时为氢；(3)n为0时，r1为且r3及r6同时代表氢，若r4及r5中一者为氢，则另一者不可为甲基、第三丁基或硝基；(4)n为0时，r1为且r3及r6同时代表氢，r4及r5不可同时代表氯；及(5)n为0，且r1为时，r3、r4、r5及r6不可同时代表氯；

或其互变异构物、立体异构物或对映异构物，或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于式(i)的一些实施例中，n为1；r1为(c1-10(二)烷胺基)c1-10烷基、羟基c1-10烷基或经–so2nh2或–co2nh2取代的c6-10芳基；r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，其中所述苯环为未经取代或经一个或更多个独立地选自卤素、胺基、氰基、硝基或c1-10烷基的基团取代；r4为h、卤素或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的未经取代或经取代的5至10元单环或二环杂芳基；且r5及r6各独立地为氢、卤素、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基或卤基c1-10烷基。优选地，n为1，r1是(c1-6(二)烷胺基)c1-6烷基、羟基c1-6烷基或经–so2nh2取代的苯基；r2及r3连同其等所连接的碳原子形成未经取代的苯环；r4为h、卤素或具有两个选自n、s及o的杂原子的未经取代或经取代的9至10元双环杂芳基；及r5及r6各独立地为氢、卤素、硝基或c1-6烷基。更佳地，n为1，r1为-ch2ch2n(ch3)2、-ch2ch2oh、-(ch2)3ch3或经–so2nh2取代的苯基；r2及r3连同其等所连接的碳原子形成未经取代的苯环；r4为或及r5及r6各独立地为氢、卤素、硝基或c1-4烷基。

于式(i)的一些实施例中，n为0，r1为经–so2nh2或–co2nh2取代的c6-10芳基；r3、r4、r5及r6各者独立地选自氢、卤素、胺基、氰基、硝基或c1-10烷基。优选地，n为0，r1为经–so2nh2取代的苯基；r3及r6各者独立地为氢、卤素或c1-6烷基；及r4及r5各者独立地选自氢、卤素、硝基或c1-6烷基。更佳地，n为0，r1为经–so2nh2取代的苯基；r3及r6各者独立地选自氢、卤素或c1-4烷基；及r4及r5各者独立地选自氢、卤素、硝基或c1-4烷基。更佳地，n为0，r1为经–so2nh2取代的苯基；r3及r6各者独立地选自氢或卤素；及r5及r5各者独立地选自氢、卤素、硝基或c1-4烷基。

于式(i)的一些优选实施例中，这些化合物包括但不限于以下：

或其互变异构物、立体异构物或对映异构物，或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于一些优选实施例中，这些化合物包括但不限于以下：

其中x为br，即，4-(6-溴-1,3-二侧氧基-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)苯磺酰胺(化合物ml-c19-b)；或其互变异构物、立体异构物或对映异构物、或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于一些优选实施例中，这些化合物包括但不限于以下：

其中x为o或s或n；或其互变异构物、立体异构物或对映异构物，或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于一些更佳实施例中，这些化合物包括但不限于以下：

化合物ml-c19-b是于回流条件下通过与1,8-萘二甲酸酐及对胺基苯磺酰胺加热制备且可通过本发明的工作实例1.1中所述的方法制备。

化合物ml-a1-b及ml-a1-c均衍生自6-溴-2-(2-(二甲基胺基)乙基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3-(2h)-二酮(化合物a1)，且可通过本发明的工作实例1.2的所述的方法制备。

另外，根据本发明，已发现本发明的所有化合物具有降低pd-l1含量及视情况提高hla-dr含量的能力。

于本文中所揭示的本发明亦包括所揭示的化合物的前药。前药被视为可于活体内释放式(i)的活性化合物的任何共价键结载剂。前药的非限定性实例包括式(i)化合物的酯类，且其等可通过使此等化合物与酸酐(如丁二酸酐)反应制备。

于本文中所揭示的本发明亦包括所揭示化合物的医药上可接受的盐。于一实施例中，本发明包括所揭示化合物的任何及所有无毒医药上可接受的盐，包括无机及有机酸加成盐及碱式盐。可通过公知化学方法自含有碱性或酸性部分的母体化合物合成本发明的医药上可接受的盐。一般而言，此等盐可通过将其等化合物的游离酸性或碱性形式与足量适当碱或酸在水中或在有机稀释剂(如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈、或其混合物)中反应制备。例如，此等盐包含乙酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯甲酸盐、苯磺酸盐(besylate)、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物/氢溴酸盐、依地酸钙盐/依地酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物/盐酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙烷二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、麸胺酸盐、乙醇酸盐、乙内酰基胺苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺、羟基马来酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、杏仁酸盐、甲基磺酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、苯乙酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、磺酰胺、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物、铵、苄星盐、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺及普鲁卡因。其他医药上可接受的盐可用金属(铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌及其类似物)的阳离子形成。(参见pharmaceuticalsalts,birge,s.m.等人，j.pharm.sci.,(1977),66,1-19.)。

于本文中所揭示的本发明亦包括所揭示化合物的溶剂化物。溶剂化物的一种类型为水合物。通常地，溶剂化物对这些化合物的生理活性或毒性并无明显贡献，且因此可充当药理学等效物。

于本文中所揭示的本发明亦包括所揭示的化合物的互变异构物及异构物。给定化学式或名称应包括其互变异构物及所有立体、光学及几何异构物(例如对映异构物，非对映异构物，e/z异构物等)及外消旋物及单独对映异构物的不同比例混合物、非对映异构物的混合物，或存在此等异构物及对映异构物的任何前述形式的混合物、及盐(包括其医药上可接受的盐及其溶剂化物，诸如(例如)水合物，包括游离化合物的溶剂化物或所述化合物的盐的溶剂化物)。

本发明化合物的制备

基于本发明，本发明化合物可使用为熟悉此项技术者所知晓的方法制备。例如，合成本发明化合物的一般流程图如下所示：

合成本发明的优选化合物ml-a1-b、ml-a1-c、及其他衍生物的一般流程图如下所示：

合成本发明的优选化合物ml-c19-ph2、ml-c19-ph3、ml-c19-ph4及ml-c19-ph6的一般流程图如下所示：

医药组合物

已发现本发明化合物具有逆转败血症或癌症患者独有特性(亦即，提升pd-l1含量及视情况降低hla-dr含量)的能力，表示本发明化合物可用于癌症免疫疗法及治疗或预防败血症或败血性休克及癌症。

于一态样中，本发明提供一种包括有效量的本发明化合物及医药上可接受的载剂的医药组合物。于一些实施例中，所述化合物的量介于50μg至500μg的范围内，优选地，100μg至300μg或100μg至200μg。

优选地，本发明的化合物或组合物可调配成液体医药组合物，其为可通过(例如)静脉内、肌肉内、皮下、或腹膜内注射投与的无菌溶液或悬浮液。用于制造无菌注射溶液或悬浮液的适宜稀释剂或溶剂包括(但不限于)1,3-丁二醇、甘露醇、水、林根耳氏液、及等渗氯化钠溶液。脂肪酸(诸如油酸及其甘油酯衍生物)亦可用于制备注射液，天然医药上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻子油)亦可。这些油溶液或悬浮液亦可包含醇溶液或羰甲基纤维或相似分散剂。其他通常所用表面活性剂(诸如tweens或spans)或者通常用于制造医药上可接受的剂型的其他相似乳化剂或生物可用性增强剂亦可用于调配的目的。口服投与可为液体组合物形式或固体组合物形式。

于一些实施例中，本发明的医药组合物进一步包括第二活性剂。于一些优选实施例中，所述第二活性剂为抗癌剂或免疫检查点抑制剂。于一些实施例中，免疫检查点抑制剂为pd-l1抑制剂、pd-1抑制剂或ctla-1抑制剂。

于一些实施例中，所述第二抗癌剂包括(但不限于)抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶、胺甲喋呤(methotrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)(亦称为胞嘧啶阿拉伯糖苷或ara-c)、及高剂量阿糖胞苷)、微小管抑制剂(例如，长春花生物碱(vincaalkaloids)，诸如长春新碱(vincristine)及长春花碱(vinblastine)；及紫杉烷，诸如紫杉醇(paclitaxel)及多烯紫杉醇(docetaxel))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丙胺酸氮芥(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、阿札胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)、白消安(busulfan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、及亚硝基脲(诸如卡莫司汀、环己亚硝脲(lomustine)、双氯乙亚硝脲(bischloroethylnitrosurea)、及羟基脲)、铂剂(例如，顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、赛特铂(satraplatin)(jm-216)、及ci-973)、蒽环类抗生素(例如，阿霉素(doxorubicin)及柔红霉素(daunorubicin))、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素(mitomycin)、博莱霉素(bleomycin)、伊逹比星(idarubicin)、阿霉素(adriamycin)、道诺霉素(daunomycin)(亦称为柔红霉素(daunorubicin)、红比霉素(rubidomycin)、或柔红霉素(cerubidine))、及米托蒽醌(mitoxantrone))、拓朴异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)及喜树碱(camptothecin))、嘌呤拮抗剂或嘧啶拮抗剂(例如，6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氯苯吩嗪(clofarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、细胞成熟剂(例如，三氧化二砷及维甲酸(tretinoin))、dna修复酶抑制剂(例如，鬼臼素(podophyllotoxine)、依托泊苷、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、及替尼泊苷(teniposide))、抑制细胞存活的酶(例如，天冬酰胺酶及培加帕酶(pegaspargase))、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat))、任何其他细胞毒性剂(例如，磷酸雌二醇氮芥(estramustinephosphate)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼氮芥(prednimustine)、及甲基芐肼(procarbazine))、激素(例如，地塞米松、强的松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、它莫西芬(tamoxifen)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟利坦(flutamide)、及甲地孕酮(megestrol))、单株抗体(例如，吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin)、阿来组单抗(alemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、及钇-90-替伊莫单抗(yttrium-90-ibritumomabtiuxetan))、免疫调节剂(例如，撒利多胺(thalidomide)及来那度胺(lenalidomide))、bcr-abl激酶抑制剂(例如，ap23464、azd0530、cgp76030、pd180970、ski-606、伊马替尼(imatinib)、bms354825(达沙替尼(dasatinib))、amn107(尼勒替尼(nilotinib))、及vx-680)、激素激动剂或拮抗剂、部分激动剂或部分拮抗剂、激酶抑制剂、外科手术、放射治疗(例如、伽马辐射、中子束放射治疗、电子束放射治疗、质子治疗(protontherapy)、近距离放射疗法(brachytherapy)、及全身放射性同位素)、内分泌治疗、生物反应调节物(例如，干扰素、介白素、及肿瘤坏死因子)、高热及冷冻治疗、及可减弱任何副作用的药剂(例如，止吐药)。于一实施例中，所述抗癌剂或癌症治疗剂为细胞毒性剂、抗代谢物、抗叶酸剂、hdac抑制剂(诸如mgcd0103(亦称为n-(2-胺基苯基)-4-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基胺基)甲基)苯甲酰胺))、dna嵌入剂、dna交联剂、dna烷化剂、dna断裂剂、拓朴异构酶抑制剂、cdk抑制剂、jak抑制剂、抗血管生成剂、bcr-abl抑制剂、her2抑制剂、egfr抑制剂、vegfr抑制剂、pdgfr抑制剂、hgfr抑制剂、igfr抑制剂、c-kit抑制剂、ras路径抑制剂、pi3k抑制剂、多靶点激酶抑制剂、mtor抑制剂、抗雌激素、抗雄激素、芳香酶抑制剂、生长抑素类似物、er调节剂、抗微管蛋白剂、长春花生物碱、紫杉烷、hsp抑制剂、smoothened拮抗剂、端粒酶抑制剂、抗转移剂、免疫抑制剂、生物制剂(诸如抗体或激素疗法)。

于本发明的一些实施例中，所述pd-l1抑制剂为结合至pd-l1蛋白的pd-l1的小干扰rna(sirna)、pd-l1的小发夹(sh)rna或pd-l1的反义rna、抗pd-l1抗体(诸如兰勃利单抗(lambrolizumab)、mpdl3280a、medi4736及艾弗单抗(avelumab)或其抗原结合片段)。

于一些实施例中，所述pd-1抑制剂包括结合至pd-1蛋白的pd-1的小干扰rna(sirna)、pd-1的小发夹(sh)rna或pd-1的反义rna、抗pd-1抗体(诸如兰勃利单抗、尼沃单抗或其抗原结合片段)。

于一些实施例中，所述ctla-4抑制剂为结合至ctla-4蛋白的ctla-4的小干扰rna(sirna)、ctla-4的小发夹(sh)rna或ctla-4的反义rna、抗ctla-4抗体(诸如依匹里木马(ipilimumab)或其抗原结合片段)。

治疗方法

于另一态样中，本发明亦提供一种用于抑制个体的pd-l1含量的方法，其包括对所述个体投与有效量的下式化合物或本发明的医药组合物；

其中

n为0或1，

r1选自卤素、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基，其中胺基烷基的胺基部分为未经取代或经一个或两个烷基基团取代，且环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可是经–so2nh2或-conh2取代；

r2选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；

r3选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；或

r2及r3连同其等所连接的碳原子形成苯环，其中所述苯环为未经取代或经一个或更多个独立地选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基的基团取代，限制条件为n为1；及

r4、r5及r6各者独立选自氢、卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基、具有1至3个选自n、s及o的杂原子的3至10元环状杂环烷基、c6-10芳基或具有1至3个选自n、s及o的杂原子的5至10元单环杂芳基或二环杂芳基；其中r2至r6中的所述环烷基、杂环烷基、芳基及杂芳基可为未经取代或经一个至四个选自卤素、羟基、胺基、氰基、硝基、c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c1-10烷氧基、c1-10烷硫基、c1-10烷胺基、卤基c1-10烷基、羟基c1-10烷基、胺基c1-10烷基、c3-10环烷基的基团取代；

或其互变异构物、立体异构物或对映异构物，或其溶剂化物、前药或医药上可接受的盐。

于一些实施例中，本发明治疗方法中所使用的化合物如下：

于其他实施例中，本发明治疗方法中所使用的化合物如下。

优选地，所述方法可提高hla-dr含量。

于另一态样中，本发明提供一种用于治疗或预防个体的pd-l1相关癌症或败血症或败血性休克的方法，其包括对个体投与有效量的于本文所提及的化合物或本发明的医药组合物。优选地，所述pd-l1相关癌症为肾细胞癌、卵巢癌、肺癌、nsclc、结肠癌、肝细胞癌或黑色素瘤。

于一些实施例中，用于抑制pd-l1含量或治疗或预防pd-l1相关癌症或败血症或败血性休克的方法包括按依序、同时、单独或随后投与免疫检查点抑制剂的额外步骤。优选地，所述免疫检查点抑制剂包括(但不限于)抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体及抗ctla-4抗体。优选地，所述免疫检查点抑制剂是依匹里木马、兰勃利单抗、mpdl3280a、medi4736或艾弗单抗(avelumab)。

本发明的化合物或组合物可通过任何可有效地将本发明的化合物或组合物递送至适当或所欲的作用位点的途径(诸如经口、经鼻、经肺、经皮(诸如被动递送或离子电渗递送)、或非经肠(例如，直肠、储积(depot)、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、小脑内、眼用溶液或油膏))投与至哺乳动物(优选为人类)。另外，本发明化学式的化合物或组合物的投与可以是单次剂量或多次施用。

于一些实施例中，所述个体可为哺乳动物，优选为人类。于一些实施例中，本发明的化合物为ml-a1-b或ml-a1-c。任一化合物(即，ml-a1-b或ml-a1-c)可依约1至21,600μg/kg/天；优选地，100至20,000、100至15,000、100至10,000、100至5,000、100至2,500、100至1,000、100至500、500至20,000、500至10,000、500至5,000、500至2,500或500至1,000μg/kg/天的剂量投与所述个体。

应明白，本发明的化合物或组合物的剂量将不仅针对所选择的特定化合物、投与途径、及所述化合物在患者内引发所需反应的能力，而且针对诸如疾病状态或欲减轻病状的严重程度、患者年龄、性别、体重、患者状态、及所治疗病理状态的严重程度、并用药物或随后患者遵循的特殊饮食的因素、及其他熟悉此项技术者将认可的因素，而随患者不同而改变，适宜剂量最终是由主治医师自行决定。可调整剂量方案以提供所需反应。优选地，假定所述个体体重为大约60kg，本发明的化合物是以大约1μg/kg/天至大约500μg/kg/天的剂量投与。更佳地，本发明的化合物是以大约50μg/kg/天至大约400μg/kg/天的剂量投与；又更佳地，大约100μg/kg/天至大约300μg/kg/天；最佳地，大约160μg/kg/天，且持续一段时间(诸如1天)，以便可于所述个体内引发改善的治疗反应。于一些实施例中，本发明的化合物或组合物可依单次剂量方式投与。于其他实施例中，本发明的化合物或组合物可依多次独立剂量方式投药。

现将参考如下实施例更具体地描述本发明，提供这些实施例的目的在于示范而非限制。

实例

材料及方法

人类细胞分离及细胞培养

经书面知情同意获得包括自台湾血液基金会(taiwanbloodservicefoundation)(taipei,taiwan)招募的健康志愿者及败血病患者的受试个体的白血球。随后按照先前所述步骤(chenih等人，cancerimmunolimmunother(2010)59,323-334)分离人类单核细胞。简而言之，使用ficoll-paqueplus(gehealthcare)梯度离心分离外周血液单核细胞(pbmcs)。通过使用cd14macs微珠(miltenyibiotec)进行cd14选择进一步纯化这些单核细胞。使用流式细胞亮度计分析确认的单核细胞纯度为近似90％。用内毒素lps(100ng/ml)培养单核细胞72小时。于所示时间点，收集这些细胞及使用流式细胞亮度计分析pd-l1分子及hla-dr分子。将鼠科b16f10细胞系于37℃下5％co2的增湿氛围中维持于杜贝卡氏改良依格培养基(dmem)、10％热灭活胎牛血清、2mml-麸胺酰胺、盘尼西林(penicillin)(100u/ml)、及链霉素(100g/ml)中。

流式细胞亮度计分析

为分析这些单核细胞的表面表型，这些细胞于冰上在黑暗中用稀释于含有1％bsa的磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)的以下mabs中培养30分钟：pd-l1-fitc、hla-dr-pe、cd14-percp(bdbiosciences)。基于单核细胞的fsc/ssc性质对其进行门控。使用facscalibur检测荧光，及使用fcsexpress第3版(denovosoftware)进行数据分析。

患者纳入标准：

在所述研究中，于观察性研究中登记有来自各个体的书面知情同意的21位败血性休克患者及20位健康志愿者，且所述研究经由马偕纪念医院机构审查委员会(institutionalreviewboardofmackaymemorialhospital)(taipei,taiwan)核准。败血性休克是根据美国胸腔医师学会/重症医学会大会(americancollegeofchestphysicians/societyofcriticalcaremedicineconference)建立的标准判定。排除标准包括如下：年龄<20；白血病；及接受化学疗法或免疫抑制疗法。当患者送入加护病房时收集以下临床数据及生物学数据：年龄；性别；急性生理学及慢性健康评估(apache)ii分数(参见knauswa等人，critcaremed.(1985)13,818-829)；及败血症相关器官衰竭评估(sofa)分数(参见vincentjl等人，intensivecaremed.(1996)22,707-710)。

apacheii评分系统为经患者进入加护病房(icu)的最初24小时内生效的疾病严重程度分类系统。由住院后最初24小时的12个生理变量计算出分数，且分数范围为0至71分。

sofa评分系统(序贯脏器衰竭评分)为患者于icu停留期间的患者器官机能障碍及发病率严重性计分。由6个变量计算所述分数：1.呼吸系统；2.心血管系统；3.肝系统；4.凝血系统；5.肾系统；6.神经系统。赋予各变量自0至4(正常至高度器官机能障碍)的点值。总分介于0至24的范围内。

细胞存活率分析

将5x10³个b16f10细胞接种至96孔盘内及用以下处理2天：dmso对照、各种浓度的萘二甲酰亚胺衍生的化合物。对于mts分析(promega)，将40ul的mts试剂加入各孔内。于37℃下培养细胞4小时。于od490nm下检测吸光率。

b16f10肺转移模型内化合物疗法

c57bl/6小鼠(6至8周大)及nod/scid小鼠(6至8周大)购自国家实验动物中心(nationallaboratoryanimalcenter)(taipei,taiwan)。所有动物实验是于无特定病原体条件下并按照经马偕纪念医院动物照护及使用委员会(animalcareandusagecommitteeofmackaymemorialhospital)(taipei,taiwan)核准的指南进行。

为引起肺转移，向小鼠静脉内注射2x10⁵个b16f10细胞(于100％的动物内一贯地产生肺转移的剂量)。每日ip给予2mg/kg化合物及5％dmso媒剂对照，以测试化合物对瘤转移的效果。将肿瘤细胞接种量计为显微镜下存在于肺中的黑色结节的总数目。

活体内毒性研究

每日给c57bl/6小鼠ip注射20mg/kg的ml-a1-b、或ml-a1-c、或5％dmso媒剂对照，及于指定日期测量其等体重。

b16f10肺转移模型内化合物及抗pd-1抗体组合疗法

于第0天给c57bl/6小鼠iv注射2x10⁵个b16f10细胞。在第1天时，每3-4天以5mg/kg给小鼠ip注射对照仓鼠ig(ctrligg)或仓鼠抗小鼠pd-1(j43)。对于组合疗法，每天给小鼠注射2mg/kg的ml-c19-a或ml-a1-c，加上每3-4天注射抗小鼠pd-1(5mg/kg)。观察各实验组的经处理小鼠的长期存活。

统计学分析

所有数据使用prism6.0(graphpad)分析且表示为平均值±平均值标准误差(sem)，除非另外指明。使用学生t检验进行组别间比较。使用皮尔逊相关系数(pearson’scorrelationcoefficient)判定相关性。p<0.05的概率值视为具有统计显著性。

实例1本发明化合物的合成

1.1化合物ml-c19-b的合成

ml-c19-b化合物是按照以下流程图制备：

将4-溴-1,8,-萘二甲酸酐(1.0mmol)、对胺基苯磺酰胺(0.1894g，1.1mmol)、及5ml冰醋酸充分混合且于回流下加热8小时。在反应完成后，将混合物冷却且通过添加冷水使产物沈淀。过滤所得固体，并用冷水洗涤若干次。所述固体自95％乙醇重结晶，可获得目标分子ml-c19-b。

化合物ml-c19-b：4-(6-溴-1,3-二侧氧基-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)苯-磺酰胺。ms电喷雾(+离子)432.300(mh+)。¹hnmr(600mhz,dmso–d6)：δ8.54(d,j＝8.4hz,2h),8.32(d,j＝8.4hz,2h),8.22(d,j＝7.6hz,2h),8.01(t,j＝13.2hz,2h),7.73(d,j＝8.4hz,1h),7.62(d,j＝7.8hz,1h),7.50(s,nh)。¹³cnmr(150mhz,dmso–d6):δ168.77,162.9,160.5,143.9.142.1,138.7,133.2,132.6,131.5,130.9,129.1,129.3,128.7,127.3,126.4,119.8,112.4。

1.2化合物ml-a1-b及ml-a1-c的合成

ml-a1-b及ml-a1-c化合物是根据以下流程图制备：

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.000g，3.610mmol)及n,n-二甲基乙二胺(0.3819g，4.3320mmol)溶解在乙醇(20ml)中且在回流下加热8小时。随后将所述反应混合物冷却至室温，且通过过滤收集淡黄色沈淀物且于室温真空条件下干燥过夜，产生化合物a1(1.0250g，2.952mmol)。

将苯并唑(2.8816mmol)、化合物a1(0.500g，1.4408mmol)、pd(pph3)4(14.4mg，1.0莫耳％)、cu(oac)2·h2o(57.5mg，20莫耳％)、及na2co3(0.3050g，2.880mmol)溶解于甲苯(10ml)中，且在回流下加热10小时。随后将此混合物冷却至室温、过滤且于减压条件下蒸发滤液。通过管柱层析法(硅胶，己烷/etoac作为洗脱液)纯化残余物，得到芳基化苯并恶唑ml-a1-b及ml-a1-c。

化合物ml-a1-b：6-(苯并[d]恶唑基-2-基)-2-(2-(二甲基胺基)乙基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。ms电喷雾(+离子)386.500(mh+)。1hnmr(600mhz,dmso–d6):δ9.86(d,j＝8.4hz,1h),8.72(d,j＝7.8hz,1h),8.65(d,j＝8.4hz,1h),8.62(d,j＝7.2hz,1h),8.09(t,j＝16.2hz,1h),7.99(d,j＝7.8hz,7.91(d,j＝7.8hz,1h),7.56(t,j＝15.6hz,1h),7.51(t,j＝15.0hz,1h),4.17(t,j＝13.8hz,2h),2.57(t,j＝10.8hz,2h),2.23(s,6h)。13cnmr(150mhz,dmso–d6):δ163.2,162.8,160.4,149.7,141.5,132.4,131.2,130.0,129.5,128.9,128.3,128.1,127.7,126.8,125.3,124.6,122.7,120.5,111.2,59.4,45.4,37.8。hrms(esi)c23h20n3o3计算值([m+h]⁺)386.4153，实测值：386.1499。

化合物ml-a1-c：6-(苯并[d]噻唑-2-基)-2-(2-(二甲基胺基)乙基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。ms电喷雾(+离子)402.400(mh+)。1hnmr(600mhz,cd3od):δ9.41(d,j＝8.4hz,1h),8.64(t,j＝13.2hz,2h),8.25(d,j＝7.2hz,1h),8.15(d,j＝8.4hz,1h),8.08(d,j＝7.8hz,1h),7.91(t,j＝15.6hz,1h),7.61(t,j＝15.0hz,1h),7.53(t,j＝15.0hz,1h),4.55(t,j＝11.4hz,2h),3.57(t,j＝10.8hz,2h),3.05(s,6h)。13cnmr(150mhz,cd3od):δ167.1,166.0,165.6,155.5,137.8,136.9,134.8,133.1,131.8,131.2,130.4,130.3,129.6,128.3,127.7,125.1,124.9,123.8,123.11,57.7,44.5,36.9。hrms(esi)c23h19n3o2s计算值([m+h]+)402.4809，实测值：403.1404。

1.3化合物ml-c19-ph2、ml-c19-ph3、ml-c19-ph4及ml-c19-ph6的合成

在回流条件下对经取代的邻苯二甲酸酐及对胺基苯磺酰胺与过量acoh加热20小时。随后将所述固体过滤及用etoh洗涤。

ml-c19-ph2:¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ:8.20(d,j＝1.6hz,1h),8.10(dd,j＝8.0,6.4hz,1h),7.99-7.67(m,3h),7.66(d,j＝7.1hz,2h),7.47(s,2h)。hrmsc14h9brn2o4s计算值为379.9466。实测值：379.9465。

ml-c19-ph3：¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ:7.99(d,j＝8.6hz,2h),7.64(d,j＝8.6hz,2h),7.49(s,2h)。

ml-c19-ph4：¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ:7.96(dd,j＝6.6,1.5hz,2h),7.88(d,j＝7.6hz,1h),7.82(s,1h),7.70(d,j＝10.2hz,1h),7.65(dd,j＝7.0,1.7hz,2h),7.46(s,2h),2.53(s,3h)。hrmsc15h12n2o4s计算值为316.0518。实测值：316.0523。

ml-c19-ph6：hrmsc14h9n3o6s计算值为347.0212。实测值：347.0218。

实例2败血性休克患者中的pd-l1及hla-dr的含量分别向上及向下调节

为识别造成败血症或败血性休克的蛋白质标靶，本研究基于“材料及方法”部分中所列纳入标准自2013年4月至2014年4月招募一组败血性休克患者及健康志愿者，且于纳入后6小时内取血样，且经由流式细胞亮度计分析测量cd14+单核细胞内的细胞表面pd-l1及hla-dr表现。

这些败血性休克患者及健康志愿者各自的临床特性汇总在表1内；及在图1内描述单核细胞上pd-l1及hla-dr的表现程度。

表1败血性休克患者及健康志愿者的临床特性

根据表1中所总结的临床特性，本研究中的败血性休克患者具有11的sofa分数中值，表示多器官机能障碍，及25的apacheii分数中值，表示患者处于严重败血症的早期阶段。

根据图1所示的结果，登记的败血性休克患者的pd-l1含量显著升高(败血性休克：6.3±0.5相比正常：4.1±0.2，p<0.001)。相比之下，败血性休克患者的hla-dr含量与健康志愿者相比明显更低(败血性休克：22.4±5.9相比正常：171.3±14，p<0.0001)。此等发现得出pd-l1、hla-dr或两者均可充当造成败血性休克患者的免疫麻痹的蛋白质标靶的假设。

实例3化合物的治疗效果

3.1脂多醣(lps)刺激单核细胞模型系统

于此实例中，建立lps预刺激单核细胞模型及随后使用其评估实例1的化合物的功能。明确言之，将根据“材料及方法”部分所描述的步骤自健康个体分离的单核细胞与lps(100ng/ml)培养72小时，随后测定pd-l1及hla-dr各自的含量。结果示于图2。

如图2所描述，在lps处理后，单核细胞上pd-l1的含量随时间而增加，而同时观察到hla-dr含量降低；此观察结果与实例2的败血性休克患者中所见的现象相似。因此，lps预刺激单核细胞对筛选治疗败血症或败血性休克的潜在候选化合物而言为适宜细胞模型系统。

3.2实例1的化合物对部分3.1的lps预刺激单核细胞模型中pd-l1及hla-dr的含量的影响

在实例3.1的lps预刺激单核细胞模型内测试实例1的化合物的效应，其中将多种浓度的ml-c19-a、ml-c19-b、ml-a1-b、及ml-a1-c与实例3.1的lps预刺激单核细胞培养在一起；结果示于图3及图4中。

如图3中所示，化合物ml-c19-a、ml-a1-b、及ml-a1-c(各为10μm)可有效逆转lps诱导的pd-l1的增加；其中lps预刺激单核细胞内pd-l1的表现程度降至对照的大约37.5％、9.4％及50.8％(虚线)。至于ml-c19-b，其似乎不如ml-c19-a有效，相较于对照，观察到pd-l1含量仅减少20％。反之，ml-c19-b、ml-a1-b及ml-a1-c可改变hla-dr表现程度。图4中显示ml-c19-a、ml-c19-b、ml-a1-b、或ml-a1-c对pd-l1含量的剂量依赖性。

综合起来，此等结果表示化合物ml-c19-a、ml-c19-b、ml-a1-b、及ml-a1-c可作为用于制造治疗败血症或败血性休克的药剂的潜在前驱化合物，因为各化合物可逆转在败血性休克患者中所观察到的pd-l1的增加。

实例4对b16f10的pdl1表现的活体外效应

为评估ml-a1-b及ml-a1-c对b16f10黑色素瘤细胞上的pd-l1表现的影响，用多种浓度的ml-a1-b或ml-a1-c化合物处理受ifn-γ刺激的b16f10细胞1天。如图5中所示，投与ml-a1-b及ml-a1-c化合物可以阻断ifn-γ对pd-l1的向上调节作用。ml-a1-b及ml-a1-c显著抑制ifn-γ刺激鼠科b16f10黑色素瘤细胞系上的pd-l1。在浓度高于10μm时，所述抑制作用急剧提高，部分归因于这两种化合物的细胞毒性效应。总之，此等结果表示ml-a1-b及ml-a1-c在抑制ifn-γ刺激b16f10癌细胞及lps预刺激单核细胞上的pd-l1表现中发挥关键作用。

实例5活体外细胞毒性效应

通过mts分析法测定多种浓度的ml-a1-b及ml-a1-c对鼠科b16f10黑色素瘤细胞及人类pbmc的细胞毒性。如图6中所示，ml-a1-b及ml-a1-c可依剂量依赖性反应方式显著加剧对黑色素细胞系(b16f10)的细胞损伤(mts分析)(ml-a1-c的ic50：7.8±0.05um；ml-a1-c的ic50：4.5±0.06um)。反之，人类pmb相对耐受ml-a1-b及ml-a1-c处理(ml-a1-c的ic50：48.3±0.14um；ml-a1-c的ic50：25.3±0.08um)。通过mts分析所得治疗指数为约5.62。

实例6对b16f110肺转移模型的活体内效应

为测定ml-a1-b及ml-a1-c对预先建立的b16f10肺转移的治疗效果，给小鼠iv注射2x10⁵个b16f10肿瘤细胞，且每只小鼠使用2mg/kg的ml-a1-b、ml-a1-c、或用dmso媒剂对照处理。图7中显示各组中各个别小鼠中肺结节的数目。与接受dmso媒剂对照的小鼠(平均数60；范围37至94)相比，用ml-a1-b处理的小鼠的肺转移的数目减少(平均数41；范围2至90)。反之，2mg/kg的ml-a1-c在减少肺转移方面具有显著效果，平均具有30个肺结节(范围3至59)。

为解答在缺少适应性免疫反应时ml-a1-b及ml-a1-c是否仍可直接抑制肿瘤生长，吾人向nod/scid小鼠注射2x10⁵个b16f10肿瘤细胞，然后用2mg/kg的ml-a1-b、ml-a1-c、或用dmso媒剂对照处理每只小鼠。如图8中所示，用ml-a1-b或ml-a1-c治疗无法抑制免疫缺陷nod/scid小鼠内的肺转移，表明ml-a1-b及ml-a1-c的抗肿瘤活性是通过调节对抗肿瘤增加的免疫系统，而非通过直接杀死肿瘤而实现。

结论是ml-a1-b及ml-a1-c可提供新颖癌症治疗药以通过同时调节癌细胞上的pd-l1表现及抑制肿瘤生长而治疗pd-l1相关癌症。若ml-a1-b及ml-a1-c可在未来试验中成功，则其将成为用于癌症免疫治疗的首创小分子。吾人预期ml-a1-b及ml-a1-c不仅可抑制肿瘤生长，亦可对癌症患者内所观察到的免疫缺陷的改善有贡献。若此处所示的结果在临床上成立，则癌症患者的ml-a1-b及ml-a1-c治疗可有助于实现最佳结果及增加存活率。相较于临床上可获得的治疗抗体(抗pd-1、ctla-4)，治疗成本及制造要求必然低于抗体。

实例7活体内毒性分析

为研究ml-a1-b及ml-a1-c的毒性，每日给小鼠ip注射20mg/kg的ml-a1-b或ml-a1-c或5％dmso媒剂对照。如图9中所示，本发明化合物ml-a1-b及ml-a1-c未显著减少小鼠的体重且于经高剂量ml-a1-b及ml-a1-c处理的小鼠内未观察到明显毒性迹象。

实例8抗pd-1的组合物与化合物ml-c19-a及m-a1-c

为检查ml-c19-a或ml-a1-c与抗pd-l1抗体的组合在b16f10肺转移模型中是否会延长小鼠存活期，给小鼠ip注射化合物及抗pd-l1抗体。如图10中所示，接受化合物(2mg/kg)及抗pd-1(5mg/kg)的合并治疗的小鼠的总存活期增加。

当明了实施例的以上描述是仅通过实例给定及一般技术者可进行各种改良。以上说明、实例及数据提供结构的全部描述及本发明示例性实施例的使用。虽然本发明的多种实施例已于上文用特定程度的特性描述，或参考一个或更多个个别实施例，但熟悉此项技术者在不脱离本发明的及精神及范畴下可对所揭示的实施例进行诸多变动。