miR‑29模拟物及其用途的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月8日提交的，美国临时申请号62/047,562的优先权，其全部内容通过引用在此并入本申请。
发明领域
本发明涉及在体内增加mirna活性的合成的mirna模拟物或前mir。特别地，本发明涉及mir-29的模拟物及其在减少胶原沉积和相关状况(如纤维化)中的用途。
发明背景
基于在使用微rna(mirna)的遗传或药理调节的动物疾病模型中收集的功能获得或功能丧失的数据，mirna是疾病过程中的重要参与者现已被广泛接受。这些研究结合阳性的临床疗效数据(janssen等，2013)强调了mirna的相关性以及mirna成为下一类治疗的可行性。事实上，mirna作为治疗干预点具有若干优点，因为其很小并包括已知序列。此外，由于单个mirna能够调节生物学途径中的很多靶mrna，因而原则上调节mirna可以影响整个基因网络并且改善复杂的疾病表型(vanrooij&olson,2012)。
尽管很多研究已显示出使用称为抗mir的单链mirna抑制剂的治疗作用，但是恢复或增加mirna功能的努力一直滞后(vanrooijetal,2012)。目前，可以通过病毒过表达或通过使用合成的双链mirna增加mirna的功能。到目前为止，腺相关病毒(aav)驱动给定mirna的表达以恢复其在体内活性的用途在肝细胞癌和肺癌(kasinski&slack,2012；kota等，2009)以及脊髓和延髓肌肉萎缩(miyazaki等，2012)小鼠模型中显示出是有效的，但是一直未对使用基于未制剂的合成寡核苷酸的方法以增加mirna的水平进行很好的探索。
已对微rna-29(mir-29)家族调节细胞外基质蛋白的能力进行了很好的表征(he等，2013)。该家族由mir-29a、-29b和-29c组成，其以两个双顺反子簇的形式表达(mir-29a/-29b-1和mir-29b-2/-29c)，并且在序列上具有较高同源性，不同成员之间仅在成熟mirna的3’区内存在少量错配(vanrooij等，2008)。在不同类型的组织纤维化中所有三个成员均是减少的，并且针对心脏(vanrooij等，2008)、肾脏(qin等，2011；wang等，2012；xiao等，2012)、肝脏(roderburg等，2011；sekiya等，2011；zhang等，2012)、肺(cushing等，2011；xiao等，2012)和系统性硬化症(maurer等，2010)均已显示出增加mir-29水平的治疗益处。
在本领域中存在对能够在体内有效增加mir-29活性的mir-29合成寡核苷酸模拟物的需求。此类mir-29模拟物或mir-29promir对于治疗多种组织纤维化状况是有用的。
发明概述
本发明部分地基于可以将具有针对稳定性和细胞摄取的修饰的mirna模拟物用于复制mir-29的内源性功能的发现。例如，在肺纤维化的情况下，使用mir-29b模拟物的治疗性治疗使博来霉素诱导的mir-29减少恢复并且阻止和逆转肺纤维化，这与在疾病过程中被诱导的mir-29靶基因的抑制相吻合。类似地，使用mir-29b模拟物治疗皮肤切口下调细胞外基质基因和参与纤维化过程的其他基因的表达。因此，本发明提供了双链rnamir-29模拟化合物。
在一些实施方式中，mir-29模拟化合物含有(a)约23至约26个核糖核苷酸的第一链，所述第一链包含成熟的mir-29a、mir-29b或mir-29c序列；以及约22至约23个核糖核苷酸的第二链，所述第二链包含基本上与第一链互补的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出。在某些实施方式中，第一链和第二链含有一个或多个经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸可以是2’糖修饰，如2’-烷基(2’-o-甲基)或2’-氟修饰。在一个实施方式中，第一链具有一个或多个2’-氟修饰。在另一个实施方式中，第二链具有一个或多个2’-o-甲基修饰。在一些实施方式中，第二链相对于第一链具有一个、2个、3个或多个错配。在一个实施方式中，mir-29模拟化合物的第二链相对于第一链在从(第二链)3’末端数的位置4、13和/或16含有错配。
在一个实施方式中，mir-29模拟化合物的第二链在其3’末端连接至胆固醇分子。在某些实施方式中，胆固醇通过至少6碳接头连接至第二链。接头可以是可裂解的接头。
在一个实施方式中，在第一链中包含3’突出的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。
在一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:27所示序列的第一链和含有seqidno:5所示序列的第二链。
在另一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:19所示序列的第一链和含有seqidno:1所示序列的第二链。
在又一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:19所示序列的第一链和含有seqidno:15所示序列的第二链。
在又一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:33所示序列的第一链和含有seqidno:1所示序列的第二链。
在又一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:34所示序列的第一链和含有seqidno:1所示序列的第二链。
在又一个实施方式中，mir-29模拟化合物包含含有seqidno:35所示序列的第一链和含有seqidno:24所示序列的第二链。
本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本申请所述的mir-29模拟化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方式中，将药物组合物制剂以用于肺、鼻或眼部递送并且其可以是粉末、水溶液、水溶性气溶胶、滴鼻剂、气溶胶和/或滴眼液形式。在一些实施方式中，药物组合物使用吸入系统施用，如雾化器、计量吸入器、干粉吸入器或软雾吸入器。
本发明还包括调节细胞中的细胞外基质基因的方法，所述方法包括将细胞与本申请所述的mir-29模拟化合物接触。在一个实施方式中，在与mir-29模拟化合物或组合物接触后细胞外基质基因的表达或活性降低。在一些实施方式中，细胞外基质基因是胶原基因，如col1a1和col3a1。细胞可以在体外、体内或离体。
本发明提供了一种在需要其的对象中治疗或预防组织纤维化的方法。在一个实施方式中，该方法包括向对象施用本申请所述的mir-29模拟化合物。在某些实施方式中，组织纤维化是心脏纤维化、肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、眼纤维化、皮肤纤维化(包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，手、关节或肌腱纤维化)、佩罗尼(peyronie)氏病或硬皮病。在一个实施方式中，组织纤维化是特发性肺纤维化(ipf)。
在某些实施方式中，用于治疗或预防组织纤维化的方法包括通过肺、鼻或鼻内途径施用本申请所述的mir-29模拟化合物或组合物。在一个实施方式中，mir-29模拟化合物或组合物通过吸入递送。
本发明还包括调节细胞中的非细胞外基质基因的方法，所述方法包括将细胞与本申请所述的mir-29模拟化合物接触。在一个实施方式中，在与mir-29模拟化合物或组合物接触后非细胞外基质基因的表达或活性增加。在一些实施方式中，非细胞外基质基因是诸如itga3或numb的基因。细胞可以在体外、体内或离体。
本发明还提供了一种用于评估使用mir-29激动剂或mir-29拮抗剂的治疗效果的方法，该方法包括在使用mir-29激动剂或mir-29拮抗剂治疗前确定在对象的细胞或纤维组织中一个或多个基因的表达水平，其中一个或多个基因选自由mir-29调节的一组基因；在使用mir-29激动剂或mir-29拮抗剂治疗后确定在对象的细胞/纤维组织中相同的一个或多个基因的表达水平；以及基于治疗之前和之后的表达水平确定治疗是有效的、不太有效的或无效的。在一个实施方式中，由mir-29调节的一个或多个基因选自表5。
附图简述
图1a双链mir-29模拟物设计，其含有与mir-29b相同的“引导链”或“反义链”，在3’末端具有uu突出，修饰以增加稳定性，且在5’末端化学磷酸化，以及“过客链”或“有义链”，其含有2’-o-me修饰以防止加载至rna诱导的沉默复合物(risc)以及增加稳定性并且其连接至胆固醇以增加细胞摄取。在有义链中引入一些错配，以防止该链作为antimir发挥作用。
图1b在nih3t3中的转染实验表明与未经处理或假处理的细胞相比随着mir-29b模拟物的量的增加col1a1剂量依赖性地减少。使用直接靶向col1a1的sirna作为阳性对照。与假处理的细胞比较*p<0.05，与未经处理的细胞比较#p<0.05。
图1c在使用10、50、100或125mpkmir-29b模拟物静脉内注射4天后，在不同组织中对mir-29b进行的northern印迹分析表明与注射生理盐水的小鼠相比最高剂量递送至所有组织且最有效的递送出现在肺脏和脾脏。使用u6作为上样对照。
图1d对mir-29b模拟的实时定量表明在较高剂量水平下mir-29b的水平增加，且最有效递送至肺脏和脾脏(每组n＝4只)。与注射生理盐酸的动物比较*p<0.05。
图1e在使用125mpk模拟物静脉内注射1、2、4和7天后，在不同组织中对mir-29b进行的northern印迹分析表明在所有检测的组织中均存在mir-29b模拟物，且在肺脏和脾脏中具有更长的检测。使用u6作为上样对照。
图1f对mir-29b模拟的实时定量表明在所有检测的组织中均具有升高的mir-29b水平，且其在肺脏和脾脏中保持最长(每组n＝4只)。与注射生理盐酸的动物比较*p<0.05。
图2a实时pcr分析表明对博来霉素产生应答所有mir-29家族成员均减少，而给予mir-29模拟物导致与对照或注射生理盐水的动物相比检测到mir-29b的水平增加。与生理盐水/生理盐水组比较*p<0.05。
图2b实时pcr分析表明与正常对照相比在特发性肺纤维化(ipf)患者肺组织活检中具有相当的mir-29b水平降低。与正常组比较*p<0.05。
图2c通过三色染色的组织学检查显示出了对博来霉素产生应答的显著的纤维化和炎性应答，其被给予mir-29b模拟物所减轻。比例尺表示100μm。
图2d。对总胶原含量进行测定的羟脯氨酸检测结果表明给予博来霉素后生理盐水组和对照组均显著增加，但是其在mir-29模拟物处理组中在给予生理盐水和博来霉素的小鼠之间无统计学差异。
图2e-g支气管肺泡灌洗液(bal)液体的细胞因子检测结果表明在来自给予博来霉素小鼠肺的bal液体中可以检测到il-12、il-4和g-csf的浓度显著升高，使用mir-29b模拟物将其降低。(n＝4)，*p<0.05。
图2h给予博来霉素使在bal液体中检测到的免疫细胞增加，在存在mir-29b模拟物时其显著降低，但对照模拟物对其无影响。(n＝4)，与生理盐水/博来霉素组比较*p<0.05，与对照/博来霉素组比较^p<0.05。
图3a-b经实时pcr测得，给予博来霉素增加col1a1和col3a1的表达且存在mir-29b模拟物抑制col1a1和col3a1。在基线条件下，mir-29b对目标抑制没有影响。(n＝6-8)，*p<0.05。
图3c给予博来霉素后在bal液体中的igf1水平增加，与给予生理盐水和对照模拟物的小鼠相比在存在mir-29模拟物的条件下其显著降低。(n＝4)，*p<0.05。
图3d免疫组化结果表明给予博来霉素后检测到较强的igf1，与给予生理盐水或对照模拟物的小鼠相比其在mir-29b模拟物处理组中减弱。比例尺表示50μm。
图4a在生理盐水组和对照组中给予博来霉素后羟脯氨酸评估显示出显著增加，但是其在mir-29模拟物处理组中在给予生理盐水和博来霉素的小鼠之间无统计学差异。*p<0.05(n＝8)。
图4b-c对col1a1(b)和col3a1(c)的实时pcr分析表明给予博来霉素其显著增加。将mir-29b模拟物处理的col1a1和col3a1表达水平归一化至溶剂处理组。*p<0.05(n＝8)。
图4d通过三色染色的组织学检查显示出了对博来霉素产生应答的较强的纤维化，其被给予mir-29b模拟物的所减轻。
图4e-f使用溶剂或tgf-β处理以及使用对照模拟物或mir-29b模拟物转染来自ipf患者的原代肺成纤维细胞。针对col1a1(e)和col3a1(f)进行实时pcr。使用mir-29b模拟物处理显示出这两种胶原的剂量依赖性减少。
图4g-h使用溶剂或tgf-β处理以及使用对照模拟物或mir-29b模拟物转染a549细胞。针对col1a1(g)和col3a1(h)进行实时pcr。使用mir-29b模拟物处理显示对col1a1和col3a1两者表达的剂量依赖性降低。
图5mir-29b模拟物不会诱导一般的毒性症状。不存在天冬氨酸或丙氨酸(ast和alt)氨基转移酶的改变表明给予mir-29b模拟物不会诱导任何显著的肝脏或肾脏毒性症状。每组n＝4。
图6在基线条件下增加mir-29b模拟物的剂量不会诱导基因表达的显著改变。实时pcr分析表明，与注射生理盐水的小鼠相比，给予增加剂量的mir-29b模拟物4天后，在不同组织中的col1a1和col3a1表达没有显著变化。每组n＝4，与注射生理盐水的小鼠比较*p<0.05。
图7mir-29b模拟物专门增加。与注射生理盐水的小鼠相比，mir-29b模拟专门增加mir-29b的水平，同时不影响mir-29a和mir-29c的水平。在第1天时mir-29c的增加可能是由实时探针的一些交叉反应性导致。每组n＝4。
图8在基线条件下，mir-29b模拟物不会诱导任何目标改变。实时pcr分析表明与注射生理盐水的小鼠相比注射125mpkmir-29b模拟物后在所示时间点针对col1a1和col3a1均无显著的目标改变。每组n＝4。
图9mir-29b模拟物影响raw细胞中的基因表达。实时pcr分析表明与溶剂或对照模拟物相比给予mir-29b后csf3、igf1和kc的表达显著增加。与注射溶剂比较*p<0.05。
图10amir29b模拟物和antimir影响小鼠皮肤中的基因表达。给出了微阵列数据的热图，其中上调的基因用红色表达和下调的基因用蓝色表示，且颜色的强度表示与pbs对照相比的变化倍数。热图的上部(细虚线框)包含了给予mir-29b模拟物抑制和给予antimir-29上调的基因，以及热图的下部(粗虚线框)包含了给予mir-29b模拟物上调和给予antimir-29抑制的基因。所有的变化倍数和具有显著性的值见表5。
图10bmir29b模拟物和antimir对小鼠皮肤中基因表达的影响。给出了对从图10a中所示的两组中提取的功能项进行的david分析(ncbi)。细胞外基质的基因本体(go)项、(皮肤)功能、粘附/细胞信号传导和细胞分化/凋亡是给予mir’-29b模拟物后前几位的负向调节途径以及细胞(核)结构和rnc加工是给予mir-29b模拟物后前几位的正向调节途径。对c57bl/6小鼠的皮肤和急性皮肤伤口进行的微阵列分析表明皮内给予包含seqidno:2和seqidno:1的mir-29b模拟物和antimir-29(seqidno:36)对228个基因显示出相反的调节。
图11a对皮内给予mir-29b模拟物(seqidno:2/seqidno:1)或pbs对照的小鼠切口伤口进行的定量实时(rt)-pcr分析。数据以分组的柱状图表示，其中各治疗组的第一个柱子表示在右侧表中的第一个基因的表达水平，依此类推。rt-pcr确证了在急性皮肤伤口中给予mir-29b模拟物使胶原、其他细胞外基质基因以及其他此前显示出被给予mir-29b模拟物直接和间接抑制的目标基因(图10a，热图的上半部分)显示出剂量依赖性的表达减少。与给予pbs的切口比较****p<0.0001，使用2-因素anova，将治疗和基因作为评估的两个因素。
图11b此前已鉴定为给予mir-29b模拟物去抑制的基因(图10a，热图的下半部分)通过定量rt-pcr显示出给予mir-29b模拟物表达的剂量依赖性增加。与给予pbs的切口比较***p<0.001和****p<0.0001，使用2-因素anova，将治疗和基因作为评估的两个因素。mir-29b模拟物显著影响急性皮肤伤口中mir-29目标基因的表达。
图12mir-29模拟物的活性以及核苷酸修饰的影响。在imr-90人肺成纤维细胞中进行的转染实验表明根据胶原基因表达抑制的测定结果可知不同的mir-29模拟物具有不同的活性水平。与假转染组比较*p<0.05，***p<0.001和****p<0.0001，使用2-因素anova，将治疗和基因作为评估的两个因素。
图13具有接头修饰的mir-29b模拟物的体内活性。给予具有切口伤口的小鼠20nmol不同的mir-29b模拟物，其差别仅在于胆固醇部分和第二/有义链之间的连接。通过检测五个胶原合成基因的表达确定mir-29b模拟物的活性。
图145’磷酸化对mir-29b模拟物活性的影响。使用不同浓度的在反义链上具有(seqidno:2/seqidno:1)或不具有(seqidno:19/seqidno:1)5’磷酸化的mir-29模拟物转染rab-9皮肤成纤维细胞。通过检测三个胶原合成基因的表达确定mir-29b模拟物的活性。
具体实施方式
在过去十年中，对微rna(mirna)疗法显示出了巨大的热情。兴奋的部分原因在于mirna通常调节多种相关的mrna。正因为如此，单个mirna的调节能够平行调节参与特定疾病的多个基因。尽管很多研究已显示了使用mirna抑制剂的治疗效果，但是恢复或增加mirna功能的努力一直滞后。
mir-29家族引起在组织纤维化中的明确功能得到了很大的关注。这种成纤维细胞所富含的mirna家族在纤维化疾病中下调，其诱导多种细胞外基质基因协调地增加。本发明人已经发现，施用合成的rna双螺旋几天能够增加体内的mir-29水平。而且，在博来霉素诱导肺纤维化期间，这些mir-29模拟物的治疗性递送使内源性mir-29的功能恢复，从而减少胶原的表达并阻止和逆转肺纤维化。此外，向皮肤切口施用本发明的mir-29模拟物下调细胞外基质基因和纤维化过程中涉及的其他基因。这些数据支持了设计有效的mirna模拟物以治疗性增加mirna的可行性并且表明mir-29将是用于治疗涉及胶原产生增加的多种纤维化状况和病症的有效治疗性mirna。因此，本发明提供了mir-29模拟物及其组合物和用途。
根据本发明的微rna模拟化合物包含第一链和第二链，其中第一链包含成熟的mir-29a、mir-29b或mir-29c序列且第二链包含基本上与第一链互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的序列。在整个公开中，术语“微rna模拟化合物”可以与术语“promir-29”、“mir-29激动剂”、“微rna激动剂”、“微rna模拟物”、“mirna模拟物”或“mir-29模拟物”互换使用；术语“第一链”可以与术语“反义链”或“引导链”互换使用；术语“第二链”可以与术语“有义链”或“过客链”互换使用；以及术语“mir-29拮抗剂”可以与术语“寡核苷酸抑制剂”、“antimir-29”、“反义寡核苷酸”、“mir-29antagomir”或“抗-微rna寡核苷酸”互换使用。
在一个实施方式中，微rna模拟化合物的第一链包含从约23至约26个核苷酸，所述核苷酸包含成熟的mir-29a、mir-29b或mir-29c的序列，以及第二链包含从约22至约23个核苷酸，所述核苷酸包含与第一链部分、基本上或完全互补的序列。在不同的实施方式中，第一链可以包含约23、24、25或26个核苷酸和第二链可以包含约22或23个核苷酸。
形成微rna模拟化合物第一链和第二链的核苷酸可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。在某些实施方式中，微rna模拟化合物的第一链和第二链包括核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”指其中核碱基和/或糖部分相对于未修饰的核苷酸被修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，微rna模拟化合物具有第一链或反义链，其序列与成熟mir-29a、mir-29b或mir-29c的序列全部或部分相同，以及第二链或有义链，其序列与第一链的序列约70％至约100％互补。在一个实施方式中，mirna模拟化合物的第一链与成熟的、天然存在的mir-29a、mir-29b或mir-29c序列的整个序列是至少约75、80、85、90、95或100％相同的，包括其间的所有整数。在某些实施方式中，第一链与成熟的、天然存在的mirna的序列(如小鼠、人或大鼠的mir-29a、mir-29b或mir-29c序列)是约或至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的。或者，第一链可以包含通过序列比对算法和本领域熟知的方法比较得到的与成熟的、天然存在的mirna相同的20、21、22或23个核苷酸位置。
应当理解，即使第一链包含代替天然存在的核苷酸的经修饰的核苷酸，仍认为第一链的序列与成熟mir-29a、mir-29b或mir-29c的序列相同。例如，如果成熟的、天然存在的mirna序列在特定位置包含胞嘧啶核苷酸，则模拟化合物的第一链可以在相应位置包含经修饰的胞嘧啶核苷酸，如2’-氟-胞嘧啶，或者如果成熟的、天然存在的mirna序列在特定位置包含尿嘧啶核苷酸，则模拟化合物第一链的mirna区可以在相应位置包含经修饰的尿嘧啶核苷酸，如2’-氟-尿嘧啶、2’-o-甲基-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。因此，只要经修饰的核苷酸与在成熟的、天然存在的mirna序列中存在的核苷酸具有相同的碱基配对能力，则认为第一链的序列与成熟的、天然存在的mirna序列是相同的。在一些实施方式中，第一链可以包含5’-末端残基的修饰。例如，第一链可以具有5’-末端单磷酸。在一些其他实施方式中，第一链不含有5’-末端单磷酸。
在一些实施方式中，微rna模拟物的第二链与第一链的序列部分互补。例如，第二链的序列与第一链的序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补，包括其间的所有值。在一些其他实施方式中，第二链与第一链的序列基本上互补。例如，第二链与第一链的序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补，包括其间的所有值。在又一些其他实施方式中，第二链的序列可以与第一链完全互补。在某些实施方式中，第二链互补区约19、20、21、22或23个核苷酸可以与第一链互补。
应当理解，即使第二链包含代替天然存在的核苷酸的经修饰的核苷酸，仍认为第二链的序列与第一链互补。例如，如果第一链序列在特定位置包含鸟嘌呤核苷酸，则第二链可以在相应位置包含经修饰的胞嘧啶核苷酸，如2’-o-甲基-胞嘧啶。
在一些实施方式中，第二链相对于第一链包含约1、2、3、4、5或6个错配。也就是说，在第一链与第二链之间至多有1、2、3、4、5或6个核苷酸可能不是互补的。在一个实施方式中，错配不是连续的并且分布在整个第二链。在另一个实施方式中，错配是连续的并且可以形成膨凸。在一个实施方式中，第二链相对于第一链含有3个错配。在某些实施方式中，mir-29a模拟物或mir-29c模拟物的第二链相对于第一链从(第二链的)3’末端计在位置4、13和/或16含有错配。在一个实施方式中，mir-29b模拟物的第二链相对于第一链从(第二链的)3’末端计在位置4、13和/或16含有错配。在另一个实施方式中，mir-29b模拟物的第二链相对于第一链从(第二链的)3’末端计在位置4、9、11、13和/或16含有错配。
在一些实施方式中，模拟物的第一链和/或第二链在链的5’或3’末端可能含有突出。在某些实施方式中，第一链相对于第二链含有3’突出，即延伸出双螺旋区的单链区。第一链3’突出的范围可以从约1个核苷酸至约4个核苷酸。在某些实施方式中，第一链的3’突出可以含有1或2个核苷酸。在一些实施方式中，包含第一链中的3’突出的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。包含第一链中的3’突出的核苷酸可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸或其组合。在某些实施方式中，在第一链中的3’突出包含2个核糖核苷酸。在一个实施方式中，第一链的3’突出包含2个通过磷酸二酯键连接的尿嘧啶核苷酸。在一些实施方式中，第一链可以不含有突出。
在一个实施方式中，在本发明mir-29模拟物的第二链/有义链中的核苷酸通过磷酸二酯键连接且除了在3’末端的最后3个核苷酸彼此之间通过硫代磷酸酯键连接以外在第一链/反义链中的核苷酸通过磷酸二酯键连接。
在不同的实施方式中，本发明的mir-29模拟物包含经修饰的核苷酸。例如，在一个实施方式中，模拟物的第一链包含一个或多个2’-氟核苷酸。在另一个实施方式中，第一链可以不包含任何经修饰的核苷酸。在一个实施方式中，第二链包含一个或多个2’-o-甲基修饰的核苷酸。
在不同的实施方式中，根据本发明的mir-29模拟物包含下表中列出的第一链和第二链。对修饰的定义如表4中所示。这些mir-29模拟化合物用于调节细胞中细胞外基质基因的表达和治疗相关状况，如组织纤维化、皮肤纤维化，包括wo2009/018493中描述的用途和状况，其全部内容通过引用在此并入。
表1：mir-29a模拟物
表2：mir-29b模拟物
表3：mir-29c模拟物
表4：缩写的定义
在某些实施方式中，mir-29a模拟物包含含有seqidno:27的第一链和含有seqidno:5的第二链。在其他实施方式中，mir-29a模拟物包含含有seqidno:7的第一链和含有seqidno:5的第二链。
在一些实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:19的第一链和含有seqidno:1的第二链。在一些其他的实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:2的第一链和含有seqidno:1的第二链。在又一些其他的实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:19的第一链和含有seqidno:15的第二链。在又一些其他的实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:33的第一链和含有seqidno:1的第二链。在又一些其他的实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:34的第一链和含有seqidno:1的第二链。在又一些其他的实施方式中，mir-29b模拟物包含含有seqidno:19的第一链和含有seqidno:30的第二链。
在某些实施方式中，mir-29c模拟物包含含有seqidno:35的第一链和含有seqidno:24的第二链。在其他实施方式中，mir-29c模拟物包含含有seqidno:26的第一链和含有seqidno:24的第二链。
可以用于本发明微rna模拟化合物的经修饰的核苷酸可以包括具有碱基修饰或取代的核苷酸。在rna中的天然的或未经修饰的碱基是嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(c)和尿嘧啶(u)(dna为胸腺嘧啶(t))。相比之下，经修饰的碱基也称为杂环碱基部分，包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方式中，微rna模拟化合物可以具有带有经修饰的糖部分的核苷酸。典型的经修饰的糖包括碳环或非环糖，在其2’、3’或4’位置具有一个或多个取代的糖以及具有代替糖中的一个或多个氢原子的取代的糖。在某些实施方式中，通过在2’位置具有取代基团对糖进行修饰。在附加的实施方式中，通过在3’位置具有取代基团对糖进行修饰。在其他实施方式中，通过在4’位置具有取代基团对糖进行修饰。糖可以在一个以上这些位置具有取代，或者rna分子可以具有在一个位置带有糖修饰的一个或多个核苷酸，其还可以具有在不同位置带有糖修饰的一个或多个核苷酸也是可以预期的。
mirna模拟化合物中涉及的糖修饰包括但不限于选自下组的取代基：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未被取代的c1至c10烷基或c2指c10烯基和炔基。
在一些实施方式中，mirna模拟化合物具有选自下组的糖取代基：c1至c10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、cl、br、cn、ocn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基或类似取代基。在一个实施方式中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-o-ch2ch2och3，还将其称为2’-o-(2-甲氧基乙基)或2’-moe)，即烷氧基烷氧基基团。另一种修饰包括2’-二甲基氨氧基乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基团，也称为2’-dmaoe以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-dmaeoe)，即2’-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。
在2’位置上(2’-)的糖取代基可以在阿拉伯糖基(上)位置或核糖基(下)位置。一个2’-阿拉伯糖基修饰是2’-f。其他类似的修饰还可以在糖部分上的其他位置进行，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置或者在2’-5’连接寡核苷酸和5’末端核苷酸的5’位置中。
在某些实施方式中，糖修饰是2’-o-烷基(例如2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基)、2’-卤素(例如2’-氟、2’-氯、2’-溴)和4’硫代修饰。例如，在一些实施方式中，mir-29a、mir-29b或mir-29c模拟化合物的第一链包含一个或多个2’氟核苷酸。在另一个实施方式中，模拟化合物的第一链不具有经修饰的核苷酸。在又一个实施方式中，mir-29a、mir-29b或mir-29c模拟化合物的第二链包含一个或多个2’-o-甲基修饰的核苷酸。
本发明微rna模拟化合物的第一链和第二链还可以包含骨架修饰，如一个或多个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸酯键(参见例如美国专利号6,693,187和7,067,641，其全部内容通过引用并入本申请)。例如，在一些实施方式中，在第一链中包含3’突出的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。
在一些实施方式中，微rna模拟化合物与载体分子缀合，如类固醇(胆固醇)、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体，以利于体内递送和稳定性。优选地，载体分子在其3’或5’端通过接头或间隔基团连接至微rna模拟化合物的第二链。在不同实施方式中，载体分子是胆固醇、胆固醇衍生物、胆酸或胆酸衍生物。在美国专利号7,202,227(其全部内容通过引用并入本申请)中公开的载体分子的用途也是能够预期的。在某些实施方式中，载体分子是胆固醇并且其通过至少6个碳的接头连接至第二链的3’或5’端。在一个实施方式中，载体分子通过6个或9个碳的接头连接至第二链的3’端。在一些实施方式中，接头是可裂解的接头。在不同实施方式中，接头包含基本上为直链的烃部分。烃部分可以包含从约3至约15个碳原子并且其可以通过相对非极性的基团如醚或硫醚键与胆固醇缀合。在某些实施方式中，烃接头/间隔包含任选取代的c2至c15饱和的或非饱和的烃链(例如亚烷基或亚烯基)。可以将在美国授权前公开号2012/0128761(其全部内容通过引用并入本申请)中描述的多种接头/间隔基团用于本发明中。
在不同实施方式中，本发明提供了在需要其的对象中治疗、减轻或预防纤维化状况的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的至少一种本申请所述的mir-29a、mir-29b和/或mir-29c模拟物。可以使用本发明的mir-29模拟物治疗的纤维化状况包括但不限于组织纤维化如肺纤维化、心脏纤维化、肝纤维化、肾纤维化、糖尿病纤维化、骨骼肌纤维化和眼纤维化；以及真皮/皮肤纤维化如瘢痕疙瘩、皮肤硬化、系统性硬化(硬皮病)、增生性瘢痕、手/关节/肌腱纤维化和佩罗尼氏病。在一个实施方式中，使用本发明mir-29模拟物治疗的纤维化状况是特发性肺纤维化。在美国专利号8,440,636中描述了在治疗某些纤维化状况中mir-29激动剂的用途，其通过引用在此并入本申请。
在一个实施方式中，本发明mir-29模拟物的施用减少对象细胞中一个或多个细胞外基质基因的表达或活性。在另一个实施方式中，本发明mir-29模拟物的施用减少对象细胞中一个或多个胶原合成基因的表达或活性。在又一个实施方式中，mir-29模拟物的施用上调参与皮肤发育、表皮发育、外胚层发育和细胞体内稳态的一个或多个基因的表达或活性。其中多个基因的表达或活性被本发明的mir-29模拟物调节的对象的细胞包括成纤维细胞和上皮细胞。在一些实施方式中，mir-29模拟物的施用下调与纤维化相关的炎性应答。例如，mir-29模拟物的施用降低纤维化患者中促炎性细胞因子(如il-12、il-4、gcsf和tnf-α)的水平。mir-29模拟物的施用还可以减少纤维化组织或器官中免疫效应物细胞(如嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞)的浸润。
在某些实施方式中，本发明提供了调节细胞中的细胞外基质基因的方法，所述方法包括将细胞与本发明的mir-29模拟物接触。在一些实施方式中，本发明提供了调节细胞中的胶原合成基因的方法，所述方法包括将细胞与本发明的mir-29模拟物接触。在处理或接触后，mir-29模拟物减少细胞外基质基因或胶原合成基因的表达或活性。
如在本申请中所使用的，术语“对象”或“患者”指任意脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴类)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如狗和猫)、实验室动物(例如家兔、啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟(例如家禽、野生的或猎鸟，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在其他实施方式中，对象是人。
本发明还提供了用于评估使用mir-29激动剂(例如药物或mir-29模拟物)或mir-29拮抗剂(例如药物或antimir-29)治疗的疗效的方法。例如，在一个实施方式中，用于评估治疗疗效的方法包括在使用mir-29模拟物或mir-29拮抗剂治疗前确定对象的细胞或纤维化组织中一种或多种基因的表达水平，其中一种或多种基因选自由mir-29调节的一组基因，例如表5中列出的基因；在使用mir-29模拟物或mir-29拮抗剂治疗后确定对象的细胞/纤维化组织中相同的一种或多种基因的表达水平；以及基于治疗前后的表达水平确定治疗是有效的、不太有效的或无效的。也就是说，在一个实施方式中，将表5中列出的基因作为用于评价mir-29模拟物或mir-29拮抗剂治疗临床疗效的生物标记物。在一个实施方式中，治疗前后的基因表达存在具有统计学意义的显著差异表明治疗是有效的。在另一个实施方式中，治疗前后基因表达的差异至少为1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍表明治疗是有效的。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种根据本发明的mir-29a、mir-29b和/或mir-29c微rna模拟化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的mir-29a模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的mir-29a序列和第二链是与第一链基本上互补的。在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的mir-29b模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的mir-29b序列和第二链是与第一链基本上互补的。在又一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的mir-29c模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的mir-29c序列和第二链是与第一链基本上互补的。
在一些实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的至少两个本发明的微rna模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。例如，药物组合物可以包含mir-29a和mir-29b模拟物；mir-29a和mir-29c模拟物或mir-29b和mir-29c模拟物的组合。或者，组合物可以包含相同微rna的两个模拟物。在又一些其他的实施方式中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的三个本发明的微rna模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。例如，药物组合物可以包含mir-29a、mir-29b和mir-29c模拟物的组合。
优选地，在包含至少两个根据本发明的微rna模拟化合物的药物组合物中，第一个和第二个模拟化合物或者第一个、第二个和第三个模拟化合物以等摩尔浓度存在。其他混合比例如约1:2、1:3、1:4、1:5、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:2:3、1:2:4也预期可以用于制备包含mir-29a、mir-29b和mir-29c中至少两个模拟化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，一种或多种本发明的微rna模拟化合物可以在单独的组合物中同时施用，同时指在较短时间段内给予模拟化合物，例如彼此之间在约5、10、20或30分钟内。在一些其他的实施方式中，mir-29a、mir-29b和/或mir-29c模拟化合物可以在单独的组合物中在不同时间施用。
本发明还包括实施方式，其中可以将附加治疗剂与mir-29a、mir-29b和/或mir-29c模拟化合物一起施用。在一个实施方式中，附加治疗剂是第二种抗纤维化剂。附加治疗剂可以在单独的处方中同时或顺序施用。在其他实施方式中，附加治疗剂可以在mir-29a、mir-29b和/或mir-29c模拟化合物施用之前或之后的不同时间施用。在考虑临床应用的情况下，会将药物组合物制成适于意向应用的形式。在通常情况下，这需要制备基本上不含热源以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
可以将胶体分散系统(如大分子复合物、纳米囊、微球、小珠)和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体和外来体)作为mir-29a、mir-29b和/或mir-29c模拟化合物的递送囊泡。在一些实施方式中，可以将本发明的mir-29模拟物制成脂质体颗粒，然后可以将其雾化用于吸入递送。
适于向靶组织递送本发明核酸的适宜市售脂肪乳剂包括
在某些实施方式中，用于递送的脂质体是两亲性脂质体如
人们通常希望使用适宜的盐和缓冲剂以稳定递送载体并使得其被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的递送载体，所述递送载体包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性基质中的mir-29模拟物(例如脂质体或其他复合物)。短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指当向动物或人施用时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。如在本申请中所使用的，“药学上可接受的载体”包括适于在配制药物(如适于向人施用的药物)中使用的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除了任意常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容以外，其在治疗组合物中的用途是能够预期的。也可以将补充活性成分加入组合物中，条件是其不会使组合物的多核苷酸失活。
在一个实施方式中，将本发明的药物组合物制剂以用于肺、鼻、鼻内或眼部递送并且其可以是粉末、水溶液、水溶性气溶胶、滴鼻剂、气溶胶和/或滴眼液形式。在一些实施方式中，用于鼻/鼻内施用的固体制剂可以含有赋形剂如乳糖或葡聚糖。用于鼻/鼻内施用的液体制剂可以是以气雾剂、滴鼻剂或计量喷雾剂形式使用的水性或油性溶液。用于肺/鼻/鼻内施用的制剂还可以包含表面活性剂如甘氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、糖脱氧胆酸，这些酸的盐以及环糊精。
在一些实施方式中，通过吸入用于肺/鼻/鼻内施用的制剂包括但不限于干粉制剂、脂质体制剂、纳米混悬液制剂或微米混悬液制剂。
在一些实施方式中，使用吸入装置施用用于肺/鼻/鼻内递送的药物组合物。术语“吸入装置”指能够向对象的呼吸道施用mir-29模拟组合物的任意装置。吸入装置包括装置如计量吸入器(mdi)、干粉吸入器(dpi)、喷射式雾化器、超声波雾化器、热蒸发器、软雾吸入器、热气溶胶吸入器、基于电动流体力学的溶液雾化吸入器。吸入装置还包括高效雾化器。在一些实施方式中，雾化器是喷射式雾化器、超声波雾化器、脉冲膜雾化器、包含具有多个孔的振动筛或板的雾化器、包含振动发生器和水室的雾化器或者使用受控装置特征以辅助气溶胶水溶液的吸气流量进入对象肺的雾化器。喷雾器、计量吸入器和软雾吸入器通过形成气溶胶递送药物，气溶胶中包括能够容易地吸入的液滴尺寸。
在一些实施方式中，使用高效雾化器施用的组合物包含一种或多种mir-29模拟物以及药学上可接受的赋形剂或载体，如纯化水、甘露醇、表面活性剂和盐如氯化钠edta钠等。
本发明的活性组合物可以包括经典的药物配制品。可以通过任意常规途径施用根据本发明的这些组合物，只要靶组织通过该途径可以获得即可。这包括口服、鼻(例如吸入)、眼或口腔内。或者，可以通过静脉内、皮内、皮下、眼内、肌内注射或者直接注射进入肺或心脏组织施用。还可以通过用于向心脏递送治疗剂的导管系统或分离冠状动脉循环的系统施用包含mirna模拟物的药物组合物。用于向心脏和冠状动脉脉管系统递送治疗剂的不同导管系统是本领域公知的。在美国专利号6,416,510；美国专利号6,716,196；美国专利号6,953,466，wo2005/082440，wo2006/089340，美国专利公开号2007/0203445，美国专利公开号2006/0148742以及美国专利公开号2007/0060907中公开了适于在本发明中使用的基于导管的递送方法或冠状动脉分离方法的一些非限制性实例，其全部内容通过引用均并入本申请。此类组合物通常作为如本申请所述的药学上可接受的组合物施用。
在本发明的另一个实施方式中，可以将本申请所述的包含mir-29模拟物的组合物制成用于医疗装置(如支架、球囊或导管)的涂层。其在治疗对象心脏纤维化的方法中特别有用，可以使用mir-29模拟物涂覆金属支架以生产药物洗脱支架。药物洗脱支架是支撑开狭窄或病变动脉并释放化合物以阻止细胞增殖和/或炎症的支架。可以将模拟化合物用于埋入薄聚合物中的金属支架，以使得激动剂或抑制剂经时释放。像药物洗脱支架和其他可植入装置一样，基于装置递送的方法和涂覆装置的方法是本领域熟知的。参见例如美国专利号7,294,329、7,273,493、7,247,313、7,236,821、7,232,573、7,156,869、7,144,422、7,105,018、7,087,263、7,083,642、7,055,237、7,041,127、6,716,242和6,589,286以及wo2004/004602，其全部内容通过引用并入本申请。因此，本发明包括使用mir-29模拟物涂覆的医疗装置，如球囊、导管或支架。
可以通过将适量活性化合物与所需要的任意其他成分(例如如上面所列举的)一起加入溶剂中，随后过滤灭菌制备无菌可注射溶液。在通常情况下，通过将各种灭菌的活性成分加入含有碱性分散介质和所需的其他成分(例如如上面所列举的)的无菌载体中制备分散剂。
通常可以将本发明的组合物以中性或盐形式制剂。药学上可接受的盐包括例如，来自无机酸(例如盐酸或磷酸)或来自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(与蛋白的游离氨基基团形成)。与蛋白游离羧基基团形成的盐还可以来自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)或来自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸普鲁卡因等)。
配制后，溶液优选以剂型相容的方式和以其量是治疗有效的施用。可以以多种剂型容易地施用制剂，如可注射溶液、药物释放胶囊、药物洗脱支架或其他涂覆的血管装置等。对于在水溶液中的胃肠外施用而言，例如，溶液通常适宜地缓冲并且首先使液体稀释剂等张，例如使用足量的盐水或葡萄糖。此类水溶液可以用于例如静脉内、肌内、皮下、皮内、眼内和腹腔内施用。
通过下述附加的实施例对本发明进行进一步说明，其不应被解释为限制。根据本公开，本领域技术人员应当意识到，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以对所公开的特定实施方式进行很多改变，并且仍能获得相同或相似的结果。
针对所有目的的，本申请通篇引用的所有专利和非专利文档其全部内容通过引用并入本申请。
实施例
实施例1：mir-29模拟物的体外活性
为了测试功能性效果，将含有seqidno:2作为第一链和seqidno:1作为第二链的amir-29b模拟物转染进入小鼠成纤维细胞系(nih3t3)并且使用qpcr检测其对胶原1a1(col1a1)表达的影响，其是mir-29已知的直接靶基因(vanrooij等，2008)。与未经处理的、假转染的(无任何寡核苷酸)或使用非靶向对照(ntc)寡核苷酸处理的细胞相比，增加mir-29b模拟物的量显示出col1a1的剂量依赖性减少，表明mir-29b模拟物是功能性的。使用直接靶向col1a1的sirna作为阳性对照(图1b)。
实施例2：mir-29模拟物的体内分布、稳定性和清除
为了探索mir-29模拟物的体内适用性和分布，静脉注射给予小鼠10、50、100或125mg每kg的mir-29b模拟物，其含有seqidno:2作为第一链和seqidno:1作为第二链并且在4天后处死动物。
使用
对于实时pcr分析而言，使用trizol(invitrogen)从心脏组织提取rna，随后根据生产厂商的说明书(invitrogen)使用superscriptii逆转录酶利用1至2μg来自各组织样品的rna产生cdna。根据生产厂商的推荐使用10-100ng总rna，通过taqman微rna测定(appliedbiosystems,abi)检测mirna或基因中的改变。将u6作为mirna分析的对照并且将gapdh作为基因分析的对照。
对多个组织的northern印迹分析表明与生理盐水对照相比在肾脏或肝脏样品中的mir-29b较少或无增加。检测到了心脏分布；但是其变异性似乎非常大并且仅在最高剂量下能够观察到脾脏递送。然而，在注射4天后在全部3个最高剂量下均能够观察到向肺的递送(图1c)。在血浆中未观察到对肝功能(转氨酶，alt)的影响，表明在这些剂量下这些mirna模拟物具有良好的耐受性(图5)。实时pcr显示出了类似的结果，与注射生理盐水的动物相比，mir-29b模拟物向肺具有明显的剂量依赖性分布(图1d)。此外，除了最高剂量下在脾脏中的col3a1以外，对mir-29靶点的实时pcr分析在给药动物中在mrna水平未显示出调控(图6)。这表明在非应激动物中靶基因处于稳态和当其升高时模拟物降低靶基因，或者表明功能性递送不适宜或不足。
为了更深入了解mirna模拟物的体内稳定性，注射给予小鼠125mpkmir-29b模拟物并且在1、2、4或7天后将其处死。注射后1天在所有检测的组织中通过northern印迹和实时pcr分析均能检测到mir-29b模拟物显著的存在，但是随后其组织清除存在较大差异(图1e和f)。肝脏和肾脏迅速清除mir-29b模拟物，在第1天后检测到最少。随着时间的推移肺和脾脏显示出了mir-29b模拟物最显著的检测，其在给药后持续至少4天(图1e和1f)。根据实时pcr的检测结果，增加对mir-29b是特异性的，其对mir-29a和mir-29c的水平没有任何影响(图7)。这里对mir-29靶点的实时pcr分析也表明在非应激动物中mrna的水平无下调(图8)。
这些数据一起表明未制剂的mir-29b模拟物能够增加mirna水平，其清除和递送效能均具有组织依赖性，其对基线条件下的基因表达无任何明确的影响。
实施例3：mir-29b减轻博来霉素诱导的肺纤维化
目前对于组织纤维化的治疗主要依赖于靶向炎症应答；然而这些治疗在阻止疾病进展中最终是无效的，这强调了对新机制的思考和治疗方法的需求(friedman等，2013)。最新研究表明mirna参与了肺纤维化(pandit等，2011)。
由于mir-29b模拟物偏好在肺中分布，因而探讨了是否应激和随后对靶基因表达的诱导能够使得mrna靶基因和下游的治疗作用产生响应于使用mir-29b模拟物治疗的可检测改变的问题。为了测试这一点，根据此前的描述(pandit等，2010)使用博来霉素诱导的肺纤维化模型。特别地，将小鼠放置在具有用40％异氟烷溶液浸泡的纸巾的小室中进行麻醉。在50μl0.9％的生理盐水中气管内施用0.0375u博来霉素(hospira,il)。为了确定mir-29b模拟物对早期纤维化的作用，在两个时间点(给予博来霉素后3天和10天)以100mg每kg注射给予对照(给予生理盐水)和给予博来霉素的小鼠mir-29b模拟物(含有seqidno:2作为第一链和seqidno:1作为第二链)、对照模拟物或等体积生理盐水；在第14天处死动物并收集肺。为了确定mir-29b模拟物对已建的纤维化的作用，在给予博来霉素或生理盐水后第10、14和17天给予mir-29b模拟物并且在第21天处死小鼠。在这两个方案中，收集肺用于组织学分析、羟脯氨酸测定和rna提取。
与预期一致，根据实时pcr的检测结果，给予博来霉素后14天，mir-29b水平降低，而与对照或注射生理盐水的动物相比，给予mir-29b使得检测到mir-29b水平增加，但是其具有较高水平的变异性(图2a)。为了确定在人中是否能够观察到相似的mir-29水平降低，从进行肺移植的特发性肺纤维化(ipf)患者的组织活检手术切除物或肺移植块获得16份肺组织样品。样品来自匹兹堡大学健康科学组织库。与正常对照相比，在特发性肺纤维化(ipf)患者的肺组织活检中观察到相当的mir-29水平降低(图2b)。
对于组织学检查而言，使用masson三色染色(胶原/结缔组织)对肺组织切片(4□μm)染色，每只动物两张玻片，每组两只动物。在脱腊、水化和封闭后根据生产厂商(abcdetectionsystemformvector’slab,usa)的推荐进行免疫染色。使用一抗(igf1，在pbs中1:100稀释)在4℃下将切片孵育过夜和使用二抗(invitrogen,usa)在室温下孵育1小时。使用苏木精对切片进行复染。使用非免疫血清代替一抗作为阴性对照。最后，使用封片剂(dako,usa)将切片封片并使用nikon显微镜进行分析。组织学分析显示出响应于博来霉素处理的清楚和显著的纤维化和炎症应答，其被给予mir-29b模拟物减轻(图2c)。
此外，针对总胶原含量，根据生产厂商的说明书使用来自biovision(milpitas,ca)的羟脯氨酸比色测定试剂盒对肺羟脯氨酸进行分析。简言之，将来自对照和实验小鼠的肺干燥直至重量恒定并且在120℃下在12nhcl中水解3小时。与氯胺t试剂进行消化反应并且在dmab试剂中显色。在酶标仪中于560nm处测定吸光度。在酶标仪中于560nm处测定吸光度。数据以羟脯氨酸/右肺的μg数表示。
羟脯氨酸分析表明在生理盐水和对照组中给予博来霉素后其显著增加，但在mir-29模拟物给药组中在给予生理盐水和博来霉素的小鼠之间无具有统计学意义的差异，这表明给予mir-29b减轻博来霉素诱导的肺纤维化(图2d)。
先天性免疫效应信号通路对驱动引起纤维化的肌成纤维细胞转分化具有重要作用。为了进一步表征mir-29b模拟物在博来霉素诱导的肺纤维化背景下的治疗作用，在这些小鼠上进行支气管肺泡灌洗(bal)并使用来自bio-rad的人细胞因子/趋化因子嵌板评估细胞因子水平。根据生产厂商的说明书进行整个程序。简言之，将bal稀释五倍并且在96孔过滤板中进行测定。对于检测步骤而言，使用与r-藻红蛋白缀合的抗生物素蛋白链菌素孵育样品30min并且在bio-plex混悬液阵列系统(bio-rad)中进行分析。使用bioplexmanager软件6.0(bio-rad)分析原始数据。使用由生产厂商提供的细胞因子标准品计算样品的浓度。在数据解释中不包括低于检测范围的分析物。而且，在计算中位值时将具有低于检测范围的特定分析物的样品排除。
在来自给予博来霉素小鼠肺的bal液中检测到il-12、il-4和g-csf的浓度显著升高，使用mir-29b模拟物将其降低(图2e至2g)。此外，在存在mir-29b模拟物时在bal液中博来霉素诱导的可检测的免疫细胞升高显著降低(图2h)，这表明mir-29b对免疫应答具有抑制作用，其可能继发于抗纤维化作用。为了确定mir-29b模拟物是否对巨噬细胞具有直接作用，将mir-29b模拟物或对照转染进入巨噬细胞raw264.7并且在转染后24和48小时收集细胞上清液。对ifn-r、il-1b、il-2、il-4、il-5、il-6、kc、il-10、il-12p70和tnf-α进行了评估，在mir-29b模拟物与对照之间未观察到显著差异(数据未显示)。通过实时pcr分析发现，tgfb1、ctgf、fgf1或pdgf的表达无显著性差异；然而，观察到csf3、igf1和kc的表达存在显著差异(图9和数据未显示)。
由于已经对mir-29在调节多种不同的细胞外基质相关基因中的功能进行了很好的验证(vanrooij&olson,2012)，因而对这些靶基因子集的调节进行确证。在生理盐水和对照组中给予博来霉素观察到col1a1的表达显著增加和col3a1的表达具有增加的趋势，在给予博来霉素的小鼠中当存在mir-29b模拟物时检测到col1a1和col3a1显著减少(图3a和3b)。有趣的是，与给予生理盐水和对照的小鼠相比，在存在mir-29模拟物时给予博来霉素后在bal液中的igf1水平升高显著降低(图3c)。而且，对igf1的免疫组化表明与生理盐水或对照相比在mir-29b模拟物治疗组中给予博来霉素后igf1显著减少(图3d)。
在确定了早期(第3天和第10天)给予mir-29模拟物后足以阻止博来霉素诱导的纤维化后，对mir-29b模拟物影响已建立的纤维化的能力进行了研究。针对这一目的，mir-29b模拟物的施用从给予博来霉素后第10天开始，并且在第14天和第17天重复给药，随后在第21天收集肺脏。对右肺的羟脯氨酸评估表明在给予生理盐水和对照的肺中使用博来霉素导致羟脯氨酸显著增加；然而给予mir-29b减轻了这种作用(图4a)。而且，给予博来霉素导致col1a1和col3a1表达的显著增加，给予mir-29b模拟物也将其标准化(图4b和4c)。通过三色染色的组织学评估证实了这种作用，其中给予生理盐水或对照时博来霉素诱导显著的纤维化，其被mir-29b模拟物所减轻(图4d)。
尽管认为这些观察到的作用是由肺成纤维细胞对胶原产生的调节所介导的，但是不能排除来自其他胶原产生细胞的作用。为了解决这个问题，在体外使用不同的肺细胞对mir-29b模拟物的作用进行评估，包括来自ipf患者的原代成纤维细胞和a549细胞(一种肺上皮细胞系)。与预期一致，来自ipf患者的原代肺成纤维细胞显示出对tgf-α产生应答的col1a1和col3a1增加(图4e和4f)。在24和48小时给予mir-29b模拟物后剂量依赖性的减弱这种作用(图4e、4f和数据未显示)。类似地，a549细胞对tgf-α产生应答，其col1a1和col3a1的表达显著增加(图4g和4h)。而且，在给予tgf-α和基线条件下给予mir-29b模拟物均能阻止胶原的诱导(图4g和4h)。与原代ipf细胞相比，在a549细胞中对胶原诱导的影响更加显著。然而，这可能是由于在来自ifp患者的原代成纤维细胞中其已经是高表达的了。此外，还考察了mir-29在巨噬细胞系thp-1中的作用，但是无论是否进行刺激，在该细胞中均未能观察到胶原的表达(数据未显示)。这些数据表明mir-29b模拟物能够在成纤维细胞和上皮细胞中减弱诱导胶原的表达。这些数据与xiao等的论文一致，在该论文中作者发现使用睡美人转座系统对mir-29的基因转移能够预防和治疗博来霉素诱导的肺纤维化(xiao等，2012)，其进一步强调了增加mir-29的治疗潜力。
本申请所述的数据显示了使用微rna模拟物恢复丧失或下调的mirna功能的可行性。然而，重要的是要注意，由于risc的掺入是适宜的mirna功能所需要的，因而需要仔细设计合成寡核苷酸模拟物的结构特征。此外，本申请中的数据表明向适宜的细胞类型或组织递送提供了有效的mirna模拟物。例如，在肺纤维化的情况下，通过吸入途径的直接递送与传统的施用途径相比具有更好的治疗效果。
实施例4：mir-29b模拟物减少皮肤中细胞外基质的产生
除了器官纤维化以外，很多研究已经发现了mir-29在皮肤纤维化(如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，以及在皮肤和其他形式的系统性硬化症(硬皮病))中的作用。例如，来自系统性硬化症患者的成纤维细胞和皮肤切片与健康对照相比显示出mir-29a水平的显著降低(maurer等，2010)。当在系统性硬化症的成纤维细胞中过表达时，mir-29a在rna和蛋白水平均能显著降低i型和iii型胶原的表达。而相反的是，在正常成纤维细胞中抑制mir-29导致这些胶原增加。而且，将博来霉素给予皮肤也显示出mir-29的显著减少，这表明mir-29的下调广泛适用于纤维化的多种适应症(maurer等，2010)。在另一项研究中对这些结果进行了进一步验证，在该研究中在健康对照皮肤成纤维细胞中转染mir-29a显著下调胶原表达。此外，mir-29a在皮肤成纤维细胞中过表达减少timp-1的分泌和增加胶原凝胶降解。在来自系统性硬化症患者的成纤维细胞中也对这些结果进行了验证(ciechomska等，2014)。总的来说，这些研究指出了mir-29模拟物在局部形式的纤维化(包括皮肤纤维化和系统性硬化症)中的治疗潜能。
为了确定mir-29在皮肤中的激动或拮抗作用，使用了小鼠切口伤口模型。特别地，使用吸入室通过吸入2-5％的异氟烷对雄性c57bl/6小鼠进行麻醉并且在整个程序中在鼻锥部保持1％的异氟烷。使用丁丙诺啡(0.1mg/kg)作为所有手术程序的镇痛剂。将动物麻醉，剃毛和使用nair脱毛膏，以及使用betadine(聚维酮碘)和酒精手术擦洗准备用于制备切口的皮肤部位。在小鼠背部造成1至2个1cm长的皮肤切口。使用2-5个间断缝合闭合切口，并用tegaderm透明半封闭敷料(3m)覆盖切口。皮内注射给予具有或不具有切口皮肤伤口的小鼠溶剂(pbs)、100nmolmir-29b模拟物(包含作为第一链的seqidno:2和作为第二链的seqidno:1)或100nmolantimir-29，切口伤口形成后3天，在切口中线两侧部位皮内注射给予两个50μl体积的寡核苷酸化合物或溶剂(pbs)，或者在无伤口皮肤附近注射一个100μl体积。antimir-29具有序列5’-lgs.das.dts.dts.lts.lcs.das.las.das.lts.lgs.dgs.lts.dgs.lcs.lts-3’(seqidno:36)，其中“l”表示锁定核酸，“d”表示脱氧核糖核苷酸和“s”表示硫代磷酸二酯键。在寡核苷酸化合物施用后24小时处死小鼠并收集处理部位的皮肤，将其在液氮中速冻以用于进行mrna表达的分析。
使用trizol(invitrogen)从皮肤中提取总rna并根据上文所述进行实施pcr分析，除了使用gapdh、b2m、hprt1和ppib作为对皮肤样品进行基因分析的对照以外
对于微阵列分析而言，将每个样品1μg总rna送至mogene进行微阵列分析，在agilent阵列上(小鼠ge(v2),4x44k–026655)将其与小鼠通用对照rna(agilent)进行比较。使用arraystudio进行分析并且使用r软件程序生成热图。
使用微阵列分析，相对于pbs对照对阳性或阴性调控基因进行鉴定。在mir-29b模拟物和antimir-29之间对228个基因相反地调节(p<0.05或变化倍数>1.5)(图10和表5)。可以将这些mir-29的调节基因及其在其他物种中的直系同源物作为翻译生物标记物以指示对使用mir-29激动剂或mir-29拮抗剂治疗的应答。
表5
对在两组中富集的功能术语的david分析(ncbi)如图10b所示。不足为奇的是，给予mir-29b模拟物后，细胞外基质、(皮肤)功能、粘附/小包信号传导和细胞分化/凋亡是基因本体(go)术语最高的负向调节通路。给予mir-29b模拟物后细胞(核)结构和rna加工是最高的正向调节通路。
为了进一步确证mir-29b模拟物在皮肤中的治疗作用，通过皮内注射将pbs，20、50或100nmolmir-29b模拟物(包含seqidno:2作为第一链和seqidno:1作为第二链)给予具有急性切口伤口的小鼠。对已鉴定为在皮肤中mir-29调节的直接或间接靶点的24个基因(19个被mir-29b模拟物抑制和被antimir-29上调，5个被mir-29b模拟物上调和被antimir-29抑制)进行定量逆转录pcr分析。细胞外基质基因(胶原、eln等)和参与纤维化过程的其他基因(例如mmp2、tgfb2)显示出被在皮肤中给予的mir-29b模拟物抑制(图11a)，而选择的细胞表面受体(itga3、lbr、numb、sdc4)和与受体内吞作用相关的因子(snx27)显示出被在皮肤中给予的mir-29b增加(图11b)。这些研究表明当在皮肤中局部给予时mir-29b是有活性的，并且提示除了对器官纤维化的作用以外，mir-29模拟物能够有效治疗各种病因引起的皮肤纤维化。这些研究还将上述基因鉴定为翻译生物标记物，其表达与mir-29b模拟物在皮肤中活性相关。可以将这些翻译生物标记物用于临床试验，测试mir-29b模拟物在正常健康志愿者和皮肤硬皮病患者中的安全性和有效性。
实施例5：mir-29模拟物的活性和核苷酸修饰的作用
为了确定mir-29a、b和c模拟物在调节靶基因表达中的效能，以10nm的浓度将不同的mir-29a、b和c模拟物转染进入imr-90人肺成纤维细胞中，并使用定量rt-pct检测胶原的表达。这些研究表明包含seqidno:27作为第一链和seqidno:5作为第二链的mir-29a模拟物以及包含seqidno:19作为第一链和seqidno:1作为第二链的mir-29b模拟物在对多种胶原基因表达的抑制中是最有效的，而包含seqidno:35作为第一链和seqidno:24作为第二链的mir-29c模拟物不太有效(图12)。这些作用可能是细胞类型或靶基因特异性的，但是表明这三种模拟物在抑制细胞外基质基因表达的能力方面确实存在差异。
在同一实验中，还测试了核苷酸修饰对mir-29b模拟物效能的影响。这些研究表明包含seqidno:19作为第一链和seqidno:1作为第二链的mir-29b模拟物的表现与包含seqidno:19作为第一链和seqidno:30作为第二链的mir-29b模拟物相似，这两个模拟物具有相同的第一和第二序列以及类型，但是在有义链(过客链)与胆固醇之间具有不同的化学接头。棋盘样的2’o-甲基修饰使得mir-29模拟物(包含seqidno:31作为第一链和seqidno:28作为第二链的模拟物以及包含seqidno:32作为第一链和seqidno:29作为第二链的模拟物)完全失效。对反义链(第一链/引导链)上所有c和u残基的修饰(包含seqidno:33作为第一链和seqidno:1作为第二链的模拟物)部分降低模拟物的活性。类似地，除去反义链上的3’突出(包含seqidno:24作为第一链和seqidno:1作为第二链的模拟物)部分降低模拟物的活性。见图12。
这些研究能够基于在特定细胞系(imr-90)中的体外活性和使用特定靶基因(col1a1、col3a1、col4a5)作为效能指标对mir-29模拟化合物进行分层，其不依赖于化合物的摄取，并且可以作为选择化合物通过体外被动递送进行测试或在体内进行测试的基础。
实施例6：具有接头修饰的mir-29b模拟物的体内活性
给予具有切口伤口的小鼠20nmol不同的mir-29b模拟物，模拟物之间的差别仅为胆固醇部分与第二链/有义链之间的键不同。在胆固醇与有义链之间含有6碳接头的模拟化合物(包含seqidno:19作为第一链和seqidno:1作为第二链的模拟物)与在胆固醇与有义链之间含有相同的6碳接头但是通过可裂解部分连接(dt.dt)的化合物(seqidno:19/seqidno:15)在对靶基因的抑制中显示出相似的活性(图13)。图13中的n/s表示在包含seqidno:19作为第一链和seqidno:1作为第二链的mir-29b模拟物与包含seqidno:19作为第一链和seqidno:15作为第二链的模拟物的活性中未观察到显著差异。含有9碳接头(seqidno:19/seqidno:17)和在5’端的接头(seqidno:19/seqidno:16)的mir-29b模拟物在对靶基因的抑制中无效(图13)。
实施例7：5’磷酸化对mir-29b模拟物活性的影响
使用不同浓度的在反义链上具有(包含seqidno:2作为第一链和seqidno:1作为第二链的模拟物)和不具有(包含seqidno:19作为第一链和seqidno:1作为第二链的模拟物)5’磷酸化的mir-29b模拟物对rab-9皮肤成纤维细胞(atcccrl-1414)进行转染。在通过对col1a1、col1a2或col3a1的表达进行检测的靶基因抑制中未观察到这两种模拟物的活性存在显著差异(在图14中表示为n/s)。与溶剂、假转染或对照模拟物处理相比，这两种mir-29b模拟物均显著抑制靶基因的表达(p<0.0001)。见图14。
参考文献
bouchiea(2013)firstmicrornamimicentersclinic.naturebiotechnology31:577
cushingl,kuangpp,qianj,shaof,wuj,littlef,thannickalvj,cardosowv,luj(2011)mir-29isamajorregulatorofgenesassociatedwithpulmonaryfibrosis.americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology45:287-294
friedmansl,sheppardd,duffieldjs,violettes(2013)therapyforfibroticdiseases:nearingthestartingline.scitranslmed5:167sr161
hey,huangc,linx,lij(2013)microrna-29family,acrucialtherapeutictargetforfibrosisdiseases.biochimie95:1355-1359
janssenhl,reesinkhw,lawitzej,zeuzems,rodriguez-torresm,patelk,vandermeeraj,patickak,chena,zhouy,perssonr,kingbd,kauppinens,levinaa,hodgesmr(2013)treatmentofhcvinfectionbytargetingmicrorna.thenewenglandjournalofmedicine368:1685-1694
kasinskial,slackfj(2012)mirna-34preventscancerinitiationandprogressioninatherapeuticallyresistantk-rasandp53-inducedmousemodeloflungadenocarcinoma.cancerres72:5576-5587
kotaj,chivukularr,o'donnellka,wentzelea,montgomerycl,hwanghw,changtc,vivekanandanp,torbensonm,clarkkr,mendelljr,mendelljt(2009)therapeuticmicrornadeliverysuppressestumorigenesisinamurinelivercancermodel.cell137:1005-1017
maurerb,stanczykj,jungela,akhmetshinaa,trenkmannm,brockm,kowal-bieleckao,gayre,michelba,distlerjh,gays,distlero(2010)microrna-29,akeyregulatorofcollagenexpressioninsystemicsclerosis.arthritisandrheumatism62:1733-1743
miyazakiy,adachih,katsunom,minamiyamam,jiangym,huangz,doih,matsumotos,kondon,iidam,tohnaig,tanakaf,muramatsusi,sobueg(2012)viraldeliveryofmir-196aamelioratesthesbmaphenotypeviathesilencingofcelf2.naturemedicine
panditkv,corcorand,yousefh,yarlagaddam,tzouvelekisa,gibsonkf,konishik,yousemsa,singhm,handleyd,richardst,selmanm,watkinssc,pardoa,ben-yehudaha,bourosd,eickelbergo,rayp,benospv,kaminskin(2010)inhibitionandroleoflet-7dinidiopathicpulmonaryfibrosis.amjrespircritcaremed182:220-229
panditkv,milosevicj,kaminskin(2011)micrornasinidiopathicpulmonaryfibrosis.translres157:191-199
peacockh,kannana,bealpa,burrowscj(2011)chemicalmodificationofsirnabasestoprobeandenhancernainterference.thejournaloforganicchemistry76:7295-7300
qinw,chungac,huangxr,mengxm,huids,yucm,sungjj,lanhy(2011)tgf-beta/smad3signalingpromotesrenalfibrosisbyinhibitingmir-29.journaloftheamericansocietyofnephrology:jasn22:1462-1474
roderburgc,urbangw,bettermannk,vucurm,zimmermannh,schmidts,janssenj,koppec,knollep,castoldim,tackef,trautweinc,lueddet(2011)micro-rnaprofilingrevealsaroleformir-29inhumanandmurineliverfibrosis.hepatology53:209-218
sekiyay,ogawat,yoshizatok,ikedak,kawadan(2011)suppressionofhepaticstellatecellactivationbymicrorna-29b.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications412:74-79
vanrooije,olsonen(2012)micrornatherapeuticsforcardiovasculardisease:opportunitiesandobstacles.naturereviewsdrugdiscovery11:860-872
vanrooije,purcellal,levinaa(2012)developingmicrornatherapeutics.circres110:496-507
vanrooije,sutherlandlb,thatcherje,dimaiojm,naseemrh,marshallws,hillja,olsonen(2008)dysregulationofmicrornasaftermyocardialinfarctionrevealsaroleofmir-29incardiacfibrosis.procnatlacadsciusa105:13027-13032
wangb,komersr,carewr,winbanksce,xub,herman-edelsteinm,kohp,thomasm,jandeleit-dahmk,gregorevicp,cooperme,kantharidisp(2012)suppressionofmicrorna-29expressionbytgf-beta1promotescollagenexpressionandrenalfibrosis.journaloftheamericansocietyofnephrology:jasn23:252-265
xiaoj,mengxm,huangxr,chungac,fengyl,huids,yucm,sungjj,lanhy(2012)mir-29inhibitsbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisinmice.moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy20:1251-1260
zhangy,wul,wangy,zhangm,lil,zhud,lix,guh,zhangcy,zenk(2012)protectiveroleofestrogen-inducedmirna-29expressionincarbontetrachloride-inducedmouseliverinjury.thejournalofbiologicalchemistry287:14851-14862
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