一种药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种药物组合物及其用途，具体来说涉及含有叶绿素提取物和去铁胺的药物组合物及其用于预防和/或治疗铁过载的用途，属于医药领域。

背景技术：

铁过载，又称铁负荷过多，是指机体铁供给超过铁需求。铁过载形成的原因有很多，例如，机体因为口服铁剂、注射铁剂、输血等导致铁摄入过多；又如，基因突变、饮酒、病毒感染等导致肝脏调节铁平衡紊乱；再如，遗传性或获得性铁代谢异常等；另外，某些疾病亦能影响铁在微环境中的代谢从而导致铁选择性地沉积在特定细胞，如病毒性肝炎导致铁沉积在肝细胞中从而导致铁过载等等。

铁过载会导致铁在某些组织器官贮存增加，例如心脏、肝脏、胰腺、脑等，从而影响心、肝、胰腺、脑等脏器的功能和结构，而且铁过载与血液系统造血紊乱密切相关，对机体造成十分严重的危害。

目前一般通过祛铁治疗，延缓铁过载的发生，减轻铁过载的危害，并改善预后。一种有效的祛铁治疗方法是放血治疗，但其明显不适合于贫血患者，尤其是输血依赖性铁过载患者。另一种祛铁治疗方法是铁螯合剂，铁螯合剂是目前治疗铁过载的唯一有效药物，通过与体内铁离子定向结合有效地提高铁的排泄，降低体内铁的含量及其在各器官的病理性沉积。

目前临床上应用的铁螯合剂主要有三种：去铁胺(DFO)、去铁酮(DFP)和地拉罗司(DFX)。其中，去铁胺是一种三价铁离子螯合剂，能与三价铁离子结合成铁胺复合物，其药物代谢半衰期为20-30min，代谢后主要通过尿液排出，主要不良反应为局部皮肤反应、感染或过敏等，大剂量可引起听力、视力障碍，生长发育障碍，骨骼变形等。

技术实现要素：

本发明人发现叶绿素提取物，特别是蚕砂提取物，能够预防和/或治疗铁过载，在降低体内铁含量的同时，还能够改善和修复铁过载所致肝、肾损伤，并且没有明显的副作用。将其与去铁胺联合用药能够提高去铁胺的疗效，从而可以缩短单独使用去铁胺的治疗周期，避免祛铁治疗过度，提高患者的顺应性，减少其因长期用药产生不良反应的风险，并大幅减轻了患者的经济负担。

本发明人发现，叶绿素提取物，特别是蚕砂提取物，对人体内的铁有双向调节作用，既可改善缺铁性贫血，也能降低体内铁含量，从而完成了本发明。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗铁过载的药物组合物，其含有叶绿素提取物、去铁胺或其可药用盐和可药用载体。优选，所述叶绿素提取物为蚕砂提取物。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗铁过载的药物组合，其含有彼此分开的第一药物组合物和第二药物组合物，其中，第一药物组合物含有叶绿素提取物和可药用载体；第二药物组合物中含有去铁胺或其可药用盐和可药用载体。优选，所述叶绿素提取物为蚕砂提取物。

根据本发明，在药物组合物和药物组合中，叶绿素提取物和去铁胺或其可药用盐的重量比为3:1-20，更优选为3:5-15，最优选为3:10。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物、第一药物组合物和第二药物组合物，均可以制成本领域各种常规剂型。在优选的技术方案中，本发明的药物组合物、第一药物组合物和第二药物组合物为口服剂型或注射剂型。在进一步优选的技术方案中，本发明的药物组合物、第一药物组合物为口服剂型；本发明的第二药物组合物为注射剂型。在本发明中，口服剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、滴丸剂、口服液、糖浆剂、混悬剂等等；注射剂型包括但不限于注射液、注射用粉针剂等等。第一药物组合物和第二药物组合物的剂型可以相同或不同。

根据本发明的另一个方面，本发明还涉及上述药物组合物或药物组合在制备用于预防和/或治疗铁过载的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，本发明还涉及叶绿素提取物在制备用于和去铁胺或其可药用盐联合预防和/或治疗铁过载的药物中的用途。优选，所述叶绿素提取物为蚕砂提取物。

根据本发明的另一个方面，本发明还涉及去铁胺或其可药用盐在制备用于和叶绿素提取物联合预防和/或治疗铁过载的药物中的用途。优选，所述叶绿素提取物为蚕砂提取物。

根据本发明，铁过载可以是各种原因引起的铁过载。在一个方面，所述铁过载由铁摄入过多、铁平衡紊乱、和/或铁代谢异常导致。所述铁摄入过多由口服铁剂、注射铁剂、和/或输血导致。所述铁平衡紊乱由基因突变、饮酒、和/或病毒感染导致；优选，所述病毒感染选自乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染和/或幽门螺杆菌感染。所述铁代谢异常为遗传性铁代谢异常和/或获得性铁代谢异常；优选，所述遗传性铁代谢异常选自遗传性血色病、遗传性血色素沉着病、遗传性高铁血红蛋白血症、和/或地中海贫血；优选，所述获得性铁代谢异常由环境因素、膳食因素和/或疾病导致，进一步优选，所述疾病为动脉粥样硬化。在另一个方面，所述铁过载为疾病导致铁在细胞内沉积。优选，所述疾病选自病毒性肝炎、动脉粥样硬化、遗传性血色病、遗传性血色素沉着病、遗传性高铁血红蛋白血症和/或地中海贫血；进一步优选，所述病毒性肝炎为乙型肝炎和/或丙型肝炎。

根据本发明，叶绿素提取物可以商购获得或者提取自含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料，包括但不限于蚕砂、竹叶、杜仲、雏菊、大麦苗、菠菜、空心菜、芹菜、莴笋、甘蓝、油菜、豆芽菜苗、西兰花叶、三叶草、雪松、绿藻、青草、仙人掌、芦荟、甘蔗叶、猕猴桃叶、桃叶、大叶黄杨、绞股蓝叶、牡丹叶、紫丁香叶、乔木叶片(女贞)、海桐叶片、石楠、冬青叶片、宁箭荷花叶片、桑叶等，优选蚕砂。叶绿素提取物(优选蚕砂提取物)的主要成分为铁叶绿酸钠和叶绿素衍生物。

根据本发明，叶绿素提取物(优选蚕砂提取物)中铁叶绿酸钠不少于5％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)(C₃₄H₃₀O₆N₄Fe)计不少于15％；优选，铁叶绿酸钠不少于10％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于30％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于15％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于50％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于22.5％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于60％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于25％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于63％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于28％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于65％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于30％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于68％；进一步优选，铁叶绿酸钠不少于35％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于63％；最优选，铁叶绿酸钠不少于40.5％，叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于58％。其中，在本发明中叶绿素衍生物不包含铁叶绿酸钠，其包括但不限于叶绿酸钠、铁叶绿酸b、脱镁叶绿素酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e6、二氢卟吩e4、二氢卟吩p6、二氢卟吩f、紫红素-18、叶绿卟啉等。

本领域技术人员可以理解，可以通过本领域已知的各种方法提取得到本发明的叶绿素提取物，优选蚕砂提取物。

例如，叶绿素提取物(优选蚕砂提取物)的提取方法包括如下步骤：

(1)提取叶绿素；优选，进一步对提取得到的提取物进行精制；

(2)皂化；优选，进一步用有机溶剂洗涤皂化液；

(3)铁化；

(4)碱化。

在上述步骤(1)中，优选取含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料(优选蚕砂)，用有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，回收有机溶剂后得叶绿素；其中，有机溶剂优选为丙酮、乙醇、石油醚、正己烷、汽油、甲苯或其中两种或多种的混合物，汽油优选为120号汽油，进一步优选，有机溶剂为丙酮、乙醇或其混合物。进一步优选，提取方法为回流、萃取、渗滤、微波或使用超微震动磨等。

在优选的实施方案中，通过用去离子水洗涤或者通过用大孔吸附树脂吸附进行精制。精制用于去除非叶绿素类物质。

在上述步骤(2)中，优选将叶绿素用有机溶剂溶解，加入碱溶液使其皂化；其中，有机溶剂优选为汽油、丙酮或其混合物，汽油优选为120号汽油；碱溶液优选为NaOH水溶液或KOH水溶液，进一步优选，碱溶液的浓度为25-35％。皂化是为了去除类胡萝卜素。

在上述步骤(3)中，优选调节皂化液的pH值至2-4，析出沉淀，加入有机溶剂或有机溶剂与水的混合物使其溶解，再加入亚铁盐，加热至溶液呈深绿色为止，回收有机溶剂后得铁代产物；其中，有机溶剂优选为丙酮、乙醇或其混合物；亚铁盐优选为硫酸亚铁、氯化亚铁或其混合物；优选加热使溶液保持微沸。铁化是为了获得铁叶绿酸。

在上述步骤(4)中，优选取铁代产物用去离子水洗至无游离铁离子，加入有机溶剂使其溶解，再加入NaOH水溶液或NaOH乙醇溶液至不再有沉淀产生为止，得叶绿素提取物(优选蚕砂提取物)；其中，有机溶剂优选为丙酮、乙醇或其混合物；NaOH水溶液或NaOH乙醇溶液的浓度为25-35％。碱化是为了获得铁叶绿酸钠。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物、第一药物组合物、第二药物组合物、以及口服剂型、注射剂型均可以使用本领域已知的方法制备得到。本发明的药物组合物、第一药物组合物、第二药物组合物、口服剂型或注射剂型中含有的可药用载体，包括但不限于常规的各种有机或无机药物载体，例如润滑剂、粘合剂、崩解剂、水溶性聚合物、无机盐、溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、起泡剂、芳香剂、稳定剂、包衣材料和调味剂等等。

本发明具有以下优点：①对祛铁治疗有显著的疗效；②可避免祛铁治疗过度，叶绿素提取物对人体内的铁有双向调节作用，既可改善缺铁性贫血，也能降低体内铁含量，是一种铁稳态剂；③能同时改善和修复铁过载所致肝、肾组织损伤，改善预后；④可制作成口服制剂，患者的顺应性强；⑤为天然中药提取物，无明显毒副作用，可较长时间服用；⑥能够提高去铁胺的疗效，从而可以缩短单独使用去铁胺的治疗周期，减少其因长期用药产生不良反应的风险；⑦大幅减轻了患者的经济负担。

附图说明

图1为铁过载小鼠肝脏病理切片，其中：

A为正常对照组，B为阳性对照组，C为蚕砂提取物高剂量组，D为蚕砂提取物低剂量组；

图2为铁过载小鼠肾脏病理切片，其中：

A为正常对照组，B为阳性对照组，C为蚕砂提取物高剂量组，D为蚕砂提取物低剂量组；

图3为铁过载小鼠肾脏HO-1蛋白表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

在下述实施例中，如无特别说明，蚕砂提取物商购自武汉联合药业有限责任公司，其中含铁叶绿酸钠不少于22.5％，含叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于60.0％。蚕砂提取物片剂即瑞克牌生血宁片剂，0.25g/片，其中含50mg蚕砂提取物，其他为医用常规辅料，每片含铁叶绿酸钠不少于11.00mg，含叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计不少于30.0mg，商购自武汉联合药业有限责任公司。去铁胺为得斯芬牌注射用甲磺酸去铁胺，0.5g*10瓶。

实施例1.蚕砂提取物的祛铁作用

取昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为正常对照组、阳性对照组、蚕砂提取物高剂量组和蚕砂提取物低剂量组，每组20只，雌雄各半。除正常组外，其他各组小鼠均按100mg/kg每周腹腔注射1次右旋糖酐铁造模，连续注射10周，建立铁过载小鼠模型。自造模之日起，各组均每天给予1次灌胃，其中：正常对照组给予1ml生理盐水，阳性对照组给予1ml生理盐水，蚕砂提取物高剂量组按80mg/kg给予蚕砂提取物水溶液1ml，蚕砂提取物低剂量组按40mg/kg给予蚕砂提取物水溶液1ml，治疗结束后尾静脉取血用动物血常规检测仪检测小鼠血清铁(SI)和血清铁蛋白(SF)水平，结果见下表1。

表1.蚕砂提取物对铁过载小鼠SI和SF水平的影响

注：与阳性对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

表1显示，与正常对照组小鼠比较，铁过载阳性对照组小鼠SI和SF水平明显升高。蚕砂提取物低剂量组和高剂量组与阳性对照组相比，SI和SF水平具有显著性差异(P＜0.01)，说明蚕砂提取物低剂量组和高剂量组均能显著降低铁过载小鼠SI和SF水平，并具有剂量相关性。

实施例2.蚕砂提取物的临床祛铁作用

为证明蚕砂提取物的治疗效果，给铁过载患者服用蚕砂提取物进行观察。

⑴一般资料

选取因各类贫血需要长期输血而导致铁过载的患者30例，其中男19例，女11例，年龄18～69岁，其中重型再生障碍性贫血(SAA)16例，重型地中海贫血9例，骨质增生异常综合征(MDS)5例，治疗前肝及肾功能均正常。当患者SF水平超过1000μg/L时开始给予蚕砂提取物进行祛铁治疗。

⑵治疗方法

每次口服蚕砂提取物片剂4片，餐后1h服药，忌茶，3次/天，4周为一个疗程，治疗3个疗程。

⑶观察指标

整个研究期间，患者需要进行常规输血治疗以维持血红蛋白(Hb)水平≥70g/L。每4周检测1次SF、SI、血常规、血生化、尿蛋白等；定期观察心电图、超声心电图、桡骨X线等；密切观察患者用药情况，了解有无不良反应。

⑷统计学方法

数据分析使用SPSS17.0统计软件。计量资料结果以均数±标准差表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

⑸治疗结果

所有患者在治疗过程中均未发现过敏反应，均无恶心、呕吐等胃肠道反应，无关节疼痛、肿胀，未出现视力及听力异常，用药期间肝肾功能、电解质未见明显改变，未发现与治疗相关性血象异常，表明蚕砂提取物具有良好的安全性、耐用性和依从性。患者治疗前后SF和SI的平均水平见下表2。

表2.患者治疗前后SF和SI的平均水平

注：与治疗前相比，*P<0.05，**P<0.01。

表2显示，与治疗前相比，患者在接受蚕砂提取物治疗后4周SF和SI平均值均有下降趋势，8周和12周的SF和SI平均值均明显下降，与治疗前相比具有显著性差异(P＜0.01)，表明蚕砂提取物对铁过载具有显著的临床治疗效果，并具有剂量相关性。

实施例3.蚕砂提取物保护铁过载所致肝、肾损伤

取昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为正常对照组、阳性对照组、蚕砂提取物高剂量组和蚕砂提取物低剂量组，每组20只，雌雄各半。除正常组外，其他各组小鼠均按100mg/kg每周腹腔注射1次右旋糖酐铁造模，连续注射10周，建立铁过载小鼠模型。自造模之日起，各组均每天给予1次灌胃，其中：正常对照组给予1ml生理盐水，阳性对照组给予1ml生理盐水，蚕砂提取物高剂量组按80mg/kg给予蚕砂提取物水溶液1ml，蚕砂提取物低剂量组按40mg/kg给予蚕砂提取物水溶液1ml，治疗结束后尾静脉取血检测小鼠血液生化指标，包括：用动物生化分析仪检测谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、用动物血常规检测仪检测SI、用试剂盒检测总胆红素、总抗氧化能力(T-AOC)、脂质过氧化物(MDA)、活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素6(IL-6)、超敏C反应蛋白；并进行尿常规检测；取小鼠肝脏和肾脏组织进行病理切片；取小鼠肾脏组织，检测其中8-OHdG含量并利用Western检测其中HO-1蛋白表达水平。

检测结果：

⑴血液生化指标检测结果和肾组织8-OHdG含量检测结果

铁过载肝损伤指标，包括GOT和GPT的检测结果见下表3。

表3.蚕砂提取物对铁过载小鼠肝损伤指标

注：与阳性对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

表3显示，与正常对照组小鼠比较，铁过载阳性对照组小鼠GOT和GPT升高。蚕砂提取物低剂量组和高剂量组与阳性对照组相比，GOT和GPT均明显降低，具有显著性差异(P＜0.01)，说明蚕砂提取物低剂量组和高剂量组均能明显阻止铁过载所致肝损伤，并具有剂量相关性。

铁过载肾损伤指标，包括SI、总胆红素、T-AOC、MDA、ROS的检测结果见下表4。

表4.蚕砂提取物对铁过载小鼠肾损伤指标

注：与阳性对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

铁过载肾损伤指标，包括TNFα、IL-6、超敏C反应蛋白、8-OHdG含量的检测结果见下表5。

表5.蚕砂提取物对铁过载小鼠肾损伤指标

注：与阳性对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

表4和表5显示，与正常对照组小鼠比较，铁过载阳性对照组小鼠SI、总胆红素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反应蛋白、肾组织8-OHdG含量明显升高，而T-AOC降低。蚕砂提取物低剂量组和高剂量组与阳性对照组相比，SI、总胆红素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反应蛋白、肾组织8-OHdG含量明显降低，T-AOC明显升高，具有显著性差异(P＜0.01或p＜0.05)，说明蚕砂提取物低剂量组和高剂量组均能明显阻止铁过载所致肾损伤，并具有剂量相关性。

⑵病理检测结果

图1显示，与正常小鼠比较，阳性对照组小鼠肝脏出现明显炎症渗出和坏死，而蚕砂提取物高剂量组和低剂量组均有明显的阻止铁过载所致肝损伤作用。

图2显示，与正常小鼠比较，阳性对照组小鼠肾脏出现明显炎症渗出和坏死，而蚕砂提取物高剂量组和低剂量组均有明显的阻止铁过载所致肾损伤作用。

⑶尿液指标检测结果

尿常规检测的检测结果见下表6。

表6.小鼠尿常规检测结果

表6显示，与正常对照组小鼠比较，铁过载阳性对照组小鼠尿液中蛋白质含量和潜血升高。蚕砂提取物低剂量组和高剂量组与阳性对照组相比，尿液中蛋白质含量和潜血明显降低，均为阴性，说明蚕砂提取物低剂量组和高剂量组均能明显阻止铁过载所致肾损伤。

⑷Western检测肾组织HO-1蛋白表达结果

Western检测肾组织HO-1蛋白表达结果见图3，其中，β-Actin为对照。

图3显示，与正常对照组小鼠比较，铁过载阳性对照组小鼠应激性肾脏HO-1蛋白表达水平升高。蚕砂提取物低剂量组和高剂量组与阳性对照组相比，肾脏HO-1蛋白表达水平均进一步提高作用，并具有剂量相关性。

试验结论：

蚕砂提取物能降低铁过载小鼠GOT、GPT、SI、总胆红素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反应蛋白和肾组织8-OHdG含量，提高总抗氧化能力，降低尿蛋白含量和潜血，能够阻止铁过载所致肝、肾损伤。肝脏和肾脏病理切片进一步证明蚕砂提取物有明显阻止铁过载所致肝、肾损伤作用。Western检测HO-1蛋白表达表明，蚕砂提取物明显上调肾组织HO-1蛋白表达水平，从而能够保护肾脏，促进肾功能恢复。

实施例4.蚕砂提取物和去铁胺联用的临床祛铁作用

为证明蚕砂提取物和去铁胺联用的治疗效果，给予铁过载的患者蚕砂提取物和去铁胺进行观察。

⑴一般资料

选取因各类贫血需要长期输血而导致铁过载的患者29例，其中男16例，女13例，年龄19～65岁，其中重型再生障碍性贫血(SAA)18例，重型地中海贫血8例，骨质增生异常综合征(MDS)3例，治疗前肝及肾功能均正常。随机分为对照组(14例)和治疗组(15例)当患者SF水平超过1000μg/L时开始给予祛铁治疗，其中对照组给予去铁胺，治疗组给予蚕砂提取物和去铁胺。

⑵治疗方法

每次口服蚕砂提取物片剂4片，餐后1h服药，忌茶，3次/天，1周7天；注射用去铁胺，输液泵皮下输注，40mg/kg·d，1次/d，1周5天，两组注射用去铁胺方法相同。4周为一个疗程，治疗4个疗程。

⑶观察指标

整个研究期间，患者需要进行常规输血治疗以维持血红蛋白(Hb)水平≥70g/L。每4周检测1次SF、SI、血常规、血生化、尿蛋白等；定期观察心电图、超声心电图、桡骨X线等；密切观察患者用药情况，了解有无不良反应。

⑷统计学方法

数据分析使用SPSS17.0统计软件。计量资料结果以均数±标准差表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

⑸治疗结果

所有患者在治疗过程中均未发现过敏反应，均无恶心、呕吐等胃肠道反应，无关节疼痛、肿胀，未出现视力及听力异常，用药期间肝肾功能、电解质未见明显改变，未发现与治疗相关性血象异常，表明蚕砂提取物和去铁胺联合用药是安全的。患者治疗前后SF和SI平均水平见下表7。

表7.两组患者治疗前后SF和SI平均水平

注：与治疗前相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比，^#P<0.05。

表7显示，对照组和治疗组患者治疗前SF和SI大致相同，治疗4周后两组SF和SI平均值有下降趋势，治疗8周、12周和16周后的SF和SI平均值均下降明显，与治疗前相比具有显著性差异(与治疗前相比P＜0.01)，表明蚕砂提取物以及蚕砂提取物和去铁胺联合对铁过载具有显著的临床治疗效果，并具有剂量相关性。并且，治疗组与对照组相比，SF和SI下降幅度更大，治疗16周后与对照组相比具有显著性差异(与对照组相比P＜0.05)，表明蚕砂提取物和去铁胺联合的治疗效果优于单用去铁胺的治疗效果。

实施例5.制剂的制备

称取蚕砂提取物原料药60g、去铁胺原料药200g、淀粉30g、糊精100g、羟丙纤维素30g，微晶纤维素30g、硬脂酸镁2.5g，混匀，过100目筛。称取羧甲基纤维素钠1.5g和适量纯化水，配制浓度为3％的溶液，称取蔗糖100g和适量纯化水配制成糖浆。将上述原料混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包薄膜衣，即得。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。