使用紫苏醇衍生物治疗鼻咽癌的方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月27日提交的美国临时申请号62/069,000的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及使用紫苏醇衍生物用于治疗鼻咽癌的方法。

发明背景

鼻咽癌(npc)是由鼻咽的上皮细胞引起的肿瘤，所述肿瘤位于鼻后方并且咽喉后部上方。npc基于其病因、发病、临床行为以及治疗选择与头颈部的其他癌症显著不同。npc在美国并不普遍，但是在世界的其他国家发生得频繁地多，尤其在东南亚，包括中国南方的广东省和台湾。

npc的在鼻后方难以观察的位置给有效疗法产生两个主要障碍，在所述位置处，鼻道和耳咽管连接上呼吸道的其余部分。首先，由于其隐蔽的位置，npc通常在其发展过程中很晚才被诊断出，并且实际上，诊断通常通过淋巴结活组织检查进行，此时原发性癌症已经开始扩散到身体的其他部分。第二，原发性肿瘤的解剖位置不易于进行手术和局部控制，这是为何活组织检查在颈部淋巴结转移瘤上进行而很少在原发性肿瘤上进行的原因。

npc的治疗通常涉及放射疗法、化疗或两者的组合。可应用很少使用的手术来去除颈部区域中的癌性淋巴结。确切的治疗计划基于多种因素想出，所述因素包括癌症的阶段、患者的总体健康以及患者愿意承受的副作用的程度。然而，尽管最初治疗成功，但是许多患者在治疗之后病情复发，并且npc的管理仍然是最大的临床挑战之一。复发之后的总体存活率非常差，其中中位存活期的范围为7至22个月。b.brennan,nasopharyngealcarcinoma,orphanetjraredis1(2006)23；s.m.cao等,theprevalenceandpreventionofnasopharyngealcarcinomainchina,chinjcancer30(2011)114-119；w.i.wei等,nasopharyngealcarcinoma.lancet365(2005)2041-2054；j.tsang等,noveltherapyfornasopharyngealcarcinoma--wherearewe.oraloncol50(2014)798-801；l.jang-chun等,comparisonsofqualityoflifeforpatientswithnasopharyngealcarcinomaaftertreatmentwithdifferentrttechnologies,actaotorhinolaryngolital34(2014)241-246。因此，需要针对npc的更有效和耐受性更好的治疗选择。

发明概述

在一个方面，本发明提供用于在哺乳动物中治疗鼻咽癌的方法，所述方法包括向哺乳动物递送治疗有效量的紫苏醇氨基甲酸酯的步骤，其中紫苏醇氨基甲酸酯包括与替莫唑胺(tmz)缀合的紫苏醇。在一个实施方案中，紫苏醇氨基甲酸酯为3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)-氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。

紫苏醇氨基甲酸酯可通过吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内来施用。在实施方案中，紫苏醇氨基甲酸酯使用雾化器，例如通过鼻递送装置来鼻内施用。鼻递送装置可为鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、计量吸入器(mdi)、加压计量吸入器、吹入器、单位剂量容器、泵、滴管、鼻喷雾瓶、挤压瓶或双向装置。

在一个实施方案中，方法还包括使用放射治疗哺乳动物的步骤。在另一个实施方案中，方法还包括向哺乳动物递送一种或多种化疗剂的步骤。化疗剂选自但不限于利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(beuacizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、伊马替尼(imatinib)、来那度胺(lenalidomide)、培美曲塞(pemetrexed)、硼替佐米(bortezomib)、西妥昔单抗(cetuximab)、亮丙瑞林(leuprorelin)、阿比特龙(abiraterone)、5-氟尿嘧啶、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、吉西他滨(gemeitabine)、氨甲喋呤(methotrexate)、全反式视黄酸、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、博莱霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、卡培他滨(capecitabine)、顺铂(cisplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphoramide)、阿糖胞苷(cytarabine)、柔红霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、埃博霉素(epothilone)、依托泊苷(etoposide)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、伊立替康(irinotecan)、氮芥(mechlorethamine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、拓扑替康(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)以及长春瑞滨(vinorelbine)。

附图简述

图1示出了使用增加浓度的tmz-poh或tmz处理48小时的tw1和tw4npc细胞系的存活率和集落形成。

图2示出了tw1和tw4细胞在使用增加浓度的tmz-poh或tmz处理24小时之后，对tw1和tw4npc细胞系中的细胞毒性和凋亡的定量评估。

图3示出了tw1和tw4细胞在使用不同浓度的tmz-poh处理1天、2天和3天之后，对tw1和tw4细胞系中的细胞应激、dna损伤以及细胞死亡/凋亡的分子指示物的诱导。

图4示出了使用媒介物和不同剂量的tmz-poh处理的18只npc小鼠的肿瘤生长。

图5示出了使用媒介物和不同剂量的tmz-poh处理的npc小鼠的全身生物发光成像。

图6示出了在测试周期过程中在不同时间下使用媒介物处理的4只npc小鼠的生物发光成像。

图7示出了在测试周期过程中在不同时间下使用5mg/kg/天的tmz-poh处理的4只npc小鼠的生物发光成像。

图8示出了在测试周期过程中在不同时间下使用30mg/kg/天的tmz-poh处理的4只npc小鼠的生物发光成像。

图9示出了在使用媒介物和不同剂量的tmz-poh处理的12只npc小鼠的每个组中所检测到的时间过程荧光素酶活性。

发明详述

本发明提供通过向哺乳动物施用治疗有效量的紫苏醇(poh)氨基甲酸酯来在哺乳动物(例如，人)中治疗鼻咽癌的方法，所述紫苏醇氨基甲酸酯包括与tmz缀合的poh。所述化合物的化学式为3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)-氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲基酯，其在本文中又称为tmz-poh(或poh-tmz)。tmz-poh的结构如下：

tmz-poh可配制成药物组合物，其中tmz-poh存在的量的范围为约0.01％(w/w)至约100％(w/w)、约0.1％(w/w)至约80％(w/w)、约1％(w/w)至约70％(w/w)、约10％(w/w)至约60％(w/w)、或约0.1％(w/w)至约20％(w/w)。tmz-poh可单独施用或可与放射(包括近距离放射疗法)或一种或多种其他药剂(例如，化疗剂，诸如但不限于利妥昔单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗、伊马替尼、来那度胺、培美曲塞、硼替佐米、西妥昔单抗、亮丙瑞林、阿比特龙、5-氟尿嘧啶、多柔比星、表柔比星、吉西他滨、氨甲喋呤、全反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、脱氧氟尿苷、埃博霉素、依托泊苷、羟基脲、伊达比星、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春新碱、长春碱、长春地辛以及长春瑞滨)一起共同施用来治疗鼻咽癌。治疗可以是顺序的，其中poh-tmz在施用其他药剂之前或之后施用。可替代地，药剂可同时施用。施用途径可变化，并且可包括吸入、鼻内、口服、经皮、静脉内、皮下或肌内注射。

tmz-poh还可与抗病毒剂、抗炎剂或抗生素共同施用。药剂可同时或顺序施用。tmz-poh可在施用其他活性剂之前、过程中或之后施用。

tmz-poh可与放射疗法组合使用。在一个实施方案中，本发明提供使用放射治疗鼻咽癌的方法，其中细胞使用有效量的tmz-poh处理，并且然后暴露于放射中。tmz-poh处理可在放射之前、过程中和/或之后。例如，tmz-poh可在放射疗法开启一周前开始连续施用，并且在放射疗法完成之后持续两周。

tmz-poh可通过本领域中已知的任何方法施用，所述方法包括但不限于鼻内、口服、经皮、眼部、腹膜内、吸入、静脉内、icv、脑池内注射或输注、皮下、移植物、阴道、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)、皮下、肌内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼用、脊柱、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管以及淋巴施用。施用以及制备针对不同施用路径的组合物的细节在公开为wo2012027693的pct申请pct/us2011/049392中进行描述，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，术语“治疗有效量”为足以治疗特有的病症或疾病或可替代地获得治疗病症或疾病的药理反应的量。确定最有效的施用方式和剂量的方法可随着用于疗法的组合物或化合物、疗法的目的、所治疗的靶细胞以及所治疗的受试者而变化。通常可滴定治疗剂量以使安全性和功效最优化。单次或多次施用可根据由治疗医师选择的剂量水平和模式来进行。合适的配制剂量和施用药剂的方法可易于由本领域的技术人员确定。例如，组合物以约0.01mg/kg至约200mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg、或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用。当本文所述的化合物与另一种药剂或疗法共同施用时，有效量可少于当单独使用药剂时的量。

tmz-poh可通过包括使第一反应物紫苏氯甲酸酯与第二反应物替莫唑胺反应的方法来合成。反应可在四氢呋喃和碱(诸如正丁基锂)的存在下进行。poh氯甲酸酯可通过使poh与光气反应来制备。例如，通过氨基甲酸酯键与替莫唑胺缀合的poh可通过使替莫唑胺与草酰氯反应接着与紫苏醇反应来合成。反应可在1,2-二氯乙烷的存在下进行。所得的化合物为(3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。生成此化合物的化学反应的细节在公开为wo2012027693的pct申请pct/us2011/049392中进行描述。

以下实施例示出本发明的一些方面，并且不应解释为限制性的。在此实施例中讨论的附图中，tmz-poh又称为neo212。

实施例1：tmz-poh在npc细胞系中的体外研究

使用两个代表性npc细胞系tw1和tw4。tw1和tw4已经先前从患有鼻咽癌症的患者中建立。c.t.lin等,characterizationofsevennewlyestablishednasopharyngealcarcinomacelllines,labinvest68(1993)716-727；c.d.wu等,nucleolinantisenseoligodeoxynucleotidesinduceapoptosisandmaybeusedasapotentialdrugfornasopharyngealcarcinomatherapy,oncolrep27(2012)94-100。

在第一实验中，tw1和tw4细胞系保持在细胞培养物中并且使用增加浓度的tmz-poh或tmz处理48小时。在此之后确定细胞存活率以及继续增殖的能力。在48小时之后，去除药物并且细胞接受没有添加任何药物的新鲜培养基。将细胞静置12天，在12天之后确定新形成的集落数。将来自尚未接受任何药物或仅接受媒介物的那些培养物的集落数设定为100％。如图1所示，tmz-poh产生对细胞生长的明显抑制，并且此抑制性或细胞毒性作用比tmz的作用有效得多。60μm浓度的tmz-poh完全阻止两个细胞系中任何和所有的集落形成(0％存活率)。tmz-poh的ic50(即，抑制50％的细胞生长所需要的浓度)为约35μm；相比之下，约90μm浓度的tmz可仅杀死50％的tw1细胞，并且甚至在100μm下也不能杀死一半的tw4细胞。

在另一个实验中，对由使用tmz-poh或使用tmz处理npc细胞所产生的细胞死亡(凋亡)的程度进行定量。在tw1和tw4细胞使用增加浓度的tmz-poh或tmz处理24小时之后，使用细胞死亡elisa试剂盒测量细胞死亡/凋亡的程度。如图2所示，tmz-poh比tmz在两个npc细胞系tw1和tw4中产生大得多的细胞毒性。实际上，高达至100μm的tmz不能发挥出任何细胞毒性作用，而相同浓度的tmz-poh引起100％细胞杀死。所述作用在tw4细胞系中甚至更加明显，其中50μmtmz-poh足以产生100％细胞凋亡，从而有效地杀死整个细胞培养物。

在分子水平上进一步确认以上使用两种不同的细胞方法展示的tmz-poh的高度有效的癌细胞杀死。为此，使用60μm或80μmtmz-poh处理npc细胞1天、2天或3天，接着对细胞死亡、dna损伤以及细胞应激的蛋白质标记物进行分析。获得细胞蛋白并且针对parp(聚adp-核糖聚合酶1)裂解(即，出现更快的迁移带)和裂解的半胱天冬酶7(cl.c-7)进行分析，parp裂解和裂解的半胱天冬酶7两者均是进行中的细胞死亡过程的标记物或指示物。dna损伤标记物为p-h2ax(即，组蛋白2a家族成员x蛋白的磷酸化形式)。作为细胞应激的标记物，使用chop(c/ebp同源蛋白，又称为gadd153)。如图3所示，使用tmz-poh对npc细胞系的处理引起所有这些标记物的明显升高，从而指示对响应于使用tmz-poh的处理的细胞应激(具体地内质网应激)、dna损伤以及细胞凋亡的有效诱导。

实施例2：tmz-poh在npc动物模型中的体内研究

tmz-poh的有效抗癌作用也在npc的动物(小鼠)模型中进行检验。将tw4npc细胞移植到18只无胸腺裸鼠(harlanlaboratories，indianapolis，in)的侧腹中。为了能够更准确地监测并且记录肿瘤生长，这些细胞已被标记有萤火虫荧光素酶基因，这允许在药物处理之前、过程中以及之后对动物进行全身非侵入性生物发光成像，以便显示每只动物中的肿瘤大小。一旦肿瘤在每只动物中开始生长，就将动物分成三个组，每组6只动物。第一组动物为对照组，没有任何药物处理。在第二组中，每只动物每天一次接受5mg/kgtmz-poh。在第三组中，每只动物每天一次接受30mg/kgtmz-poh。药物通过皮下注射施用到颈部区域中。对第一(对照)组中的每只动物也进行每天注射，但是在此动物仅接受媒介物(包含甘油和乙醇，但是没有任何活性药物成分)。

图4呈现出这些动物的肿瘤生长结果，其中动物#1–6仅接受媒介物(没有tmz-poh)，动物#11–16接受5mg/kgtmz-poh，并且动物#21–26接受30mg/kgtmz-poh。所有动物接受每天一次注射持续28天。在开始处理之前(浅灰色柱，rx之前)并且在28天处理方案终止一天之后(深灰色柱，rx之后)，再次通过对所有动物的生物发光成像(也参见图5)测量肿瘤体积。在药物处理之前将每只动物的生物发光的程度(总光通量)转换为100％以便于比较。(n.d.：不可检测)。如图4所示，在仅媒介物的组中，存在一只动物在28天周期结束时肿瘤消退50％；两只动物表现出肿瘤体积没有改变，并且三只动物表现出肿瘤生长增加，其中一个肿瘤达到初始体积的约14倍。相比之下，在接受30mg/kgtmz-poh的那些动物中不存在肿瘤体积增加(底部图表)。在此，在药物处理28天之后，三个肿瘤消失(即，变得不可检测，n.d.)，并且三个肿瘤缩小。使用5mg/kgtmz-poh处理的动物也有肿瘤生长减少的反应，虽然没有接受更高剂量的那些动物明显。虽然没有示出，但是应注意，药物处理的动物没有表现出对tmz-poh处理的可辨别的副作用，从而指示这些动物良好地耐受tmz-poh。这是相关的，因为系统毒性和器官损伤在使用许多建立的化疗药物的治疗过程中是不合需要的。

图5示出了来自三个处理组中的每一个的动物的全身生物发光成像，其中顶部和底部照片来自同一动物(动物选自表示此组中的平均反应的每个处理组)。顶部照片在开始处理之前拍摄。底部照片在28天处理方案之后一天拍摄。右边的热(彩色)柱显示光通量的标度，其中红色表示比蓝色(较少肿瘤生长)更强的通量(较多肿瘤生长)。如靶形圆圈(其表示肿瘤质量)的颜色所指示，在没有接受药物处理的动物中存在增加的肿瘤生长(左照片)。中间的照片显示接受5mg/kgtmz-poh的一只动物，并且在此动物中，肿瘤变得更小(如由最强烈的红色光通量的消失所指示)。右边的动物接受30mg/kgtmz-poh，并且在此来自肿瘤的光发射变得不可检测，从而指示肿瘤质量的有效消退-这在此处理组的六只动物中的一半中观察到(参见图4)。

实施例3：tmz-poh在npc动物模型中的体内研究

在另一个实验中，将标记有萤火虫荧光素酶基因的tw4npc细胞移植到12只无胸腺裸鼠中(harlanlaboratories，indianapolis，in)，将所述12只无胸腺裸鼠分成三个组，每组4只动物。在肿瘤生长开始之后，所有动物接受每天一次注射持续28天。第一组动物为对照组，其接受每天注射包含甘油和乙醇但没有活性药物的媒介物。在第二组中，每只动物每天一次接受5mg/kgtmz-poh。在第三组中，每只动物每天一次接受30mg/kgtmz-poh。药物通过皮下注射施用到颈部区域中。

图6示出了在处理之后的所选日期下使用30μl/天的媒介物处理的4只npc小鼠的生物发光成像。如由靶形圆圈(其表示肿瘤质量)的颜色所指示，在媒介物处理进程的过程中以及在处理后的过程中，对于此组中的每只测试小鼠存在增加的肿瘤生长。

图7示出了在处理之后的所选日期下使用5mg/kg/天的tmz-poh处理的4只npc小鼠的生物发光成像。在两只小鼠(#597和#564)中，在测试中的第6天，肿瘤存在，但是在测试中的第27天以及此后，肿瘤消失。在其他两只小鼠(#596和#588)中，肿瘤在每次测试时持续存在，直至第42天。

图8示出了在处理之后的所选日期下使用30mg/kg/天的tmz-poh处理的4只npc小鼠的生物发光成像。在三只小鼠(#593、#565和#589)中，在测试中的第6天，肿瘤存在，但是在测试中的第27天以及此后，肿瘤消失。仅有一只小鼠(#623)在测试周期过程中具有持续存在的肿瘤。

图9示出了在测试周期过程中在12只npc小鼠的每个组中所检测到的时间过程萤光素酶活性(学生测试*p<0.05)。结果显示与在对照组中的那些小鼠相比，萤光素酶活性(其与肿瘤大小相关)在使用tmz-poh处理的小鼠中有所降低，并且tmz-poh的更高剂量施用引起更低的萤光素酶活性，从而展示tmz-poh在治疗人鼻咽癌异种移植物中的有效性。

概括地说，tmz-poh在临床前鼻咽癌(npc)模型中显示引人注目的抗癌活性。在体外，tmz-poh表现出比其单一组分(单独的poh或tmz)基本上更大的肿瘤细胞杀死效力。在体内小鼠模型中，使用tmz-poh的处理引起明确的治疗性结果，不存在明显的副作用。

本发明的范围不受上文已具体示出并且描述的事物所限制。本领域的技术人员将认识到，对所描绘的材料、配置、结构以及尺寸的实例存在合适的替代方案。多种参考(包括专利和各种出版物)在本发明的描述中引用并且讨论。此类参考的引用和讨论仅被提供来使本发明的描述清楚，并且不承认任何参考是本文所述的发明的现有技术。此说明书中所引用并且讨论的所有参考均以引用的方式整体并入本文。在不背离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员将想到对本文所述的事物的变型、修改以及其他实现方式。虽然已示出并且描述了本发明的某些实施方案，但是对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的精神和范围的情况下做出改变和修改。在前述描述和附图中列出的事项仅通过例示的方式提供并且不作为限制。