一种脂多糖结合蛋白多肽及其制药用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种包含15个氨基酸的脂多糖结合蛋白多肽及其在制备用于预防和/或治疗由革兰氏阴性细菌引起的败血症的药物中的用途。

背景技术：

败血症是致病菌或条件致病菌侵入血液循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可有感染性休克和迁徙性病灶。引起败血症的原因有二：一、人体因素：当皮肤粘膜有破损或发生化脓性炎症时，细菌则容易侵入体内；人体的免疫反应可分为非特异性免疫反应及特异性免疫反应两种，后者又可分为细胞免疫与体液免疫两方面，当机体免疫功能下降时，不能充分发挥其吞噬杀灭细菌的作用，就会引起败血症；条件致病菌所引起的医源性感染也逐渐增多。二、细菌因素：主要与病原菌的毒力和数量有关。毒力强或数量多的致病菌进入机体，引起败血症的可能性较大。

革兰氏阴性细菌感染是导致败血症的重要原因，其胞壁成分脂多糖（lps）诱导产生的系统性炎症和微循环障碍对败血症发生的多器官功能障碍和败血性休克起关键作用。脂多糖（lps）是革兰氏阴性杆菌细胞壁的组成成分之一，一般位于细胞壁的最外层，厚度约为8~10nm，具有很强的致炎作用。

尽管目前败血症的治疗已采取抗感染、免疫调控和支持治疗等综合措施，但是败血症的发病率和死亡率仍然居高不下。究其原因，主要是对败血症发病机理的认识远远不足。血液中lps不存在游离形式。已知生物体具有lps清除机制，包括lbp、scd14、ctbp及其它脂蛋白，它们与lps的结合将其递呈给肝脏的三种细胞（包括枯否细胞、肝细胞及星状细胞），通过细胞内的降解排入胆汁，而被解毒。然而，在发生败血症时，血液中的lps浓度居高不下，说明lps借助于与宿主蛋白的结合而逃逸了清除机制，但迄今为止，仍不清楚lps到底劫持了哪些宿主蛋白。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明首次发现：血浆高分子量激肽原（highmolecularweightkininogen，hk）可以通过其与lps中的糖链的相互作用来保持其与lps的高亲和力结合，可以作为一种新型的脂多糖结合蛋白。本发明进一步发现：hk中的一段高度保守的氨基酸序列（dhghkhkhghghgkh）是其与lps发生特异性结合的位点。合成该多肽序列，并经腹腔注射注入小鼠体内，可以显著改善由lps导致的内毒素血症的死亡率，并且抑制炎症因子的产生。

一方面，本发明提供了一种脂多糖结合蛋白多肽，将其命名为dhg15，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述脂多糖结合蛋白多肽和一种或多种药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料包括（但不限于）ph调节剂、渗透压调节剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、矫嗅剂和润滑剂。所述药物组合物可以通过注射给药、鼻腔给药、肺部给药、透皮给药、口服给药等多种方式施用于患者。

最后一方面，本发明提供了上述脂多糖结合蛋白多肽在制备用于预防和/或治疗由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的药物中的用途。在上述药物中，本发明的脂多糖结合蛋白多肽既可以作为单独的药效活性物质，又可以与其他抗败血症药物联用。所述抗败血症药物包括（但不限于）头孢类抗生素和喹诺酮类抗生素；其中：所述头孢类抗生素选自头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮中的任意一种；所述喹诺酮类抗生素选自氧氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星中的任意一种。

与现有技术相比，采用上述技术方案的本发明具有如下有益效果：

（1）本发明的脂多糖结合蛋白多肽dhg15具有很好的可溶性，并且序列源自人体自身hk蛋白，无细胞毒性；

（2）经腹腔注射dhg15后，可以降低小鼠由lps导致的内毒素血症的死亡率，并且抑制炎症因子的产生；

（3）dhg15与lps的多糖链结合后，阻断了lps与hk蛋白的结合（使其解离或释放）；于此同时，lps中的脂质a部分仍然暴露在外，lbp、scd14、ctbp及其它脂蛋白仍然可以与之结合，并将其递呈至肝脏解毒，因此具有双重保护作用。

附图说明

图1为血浆hk蛋白中重链（hc）和轻链（lc）蛋白片段的westernblotting鉴定结果图。

图2为研究血浆hk蛋白与lps结合的实验结果图。

图3为hk和lc与lps结合的亲和力结果图。

图4为lc中的d4、d5和d6蛋白片段的westernblotting鉴定结果图以及与lps结合的实验结果图。

图5为8个多肽片段在d5上的分布情况以及与lps结合的实验结果图。

图6为dhg15多肽与突变多肽在抑制hk轻链与lps结合方面的比较结果图。

图7为研究lps与血浆hk蛋白结合的实验结果图。

图8为dhg15多肽改善小鼠由lps导致的死亡率的结果示意图。

图9为dhg15单体对血浆中主要炎症因子水平的影响结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做出进一步的描述。需要说明的是，下列实施例仅用于解释本发明的技术方案，而并不旨在限制其保护范围。另外，除非特殊说明，下列实施例中使用各种试剂、药品和仪器均可通过商业手段获得。

实施例一：从血浆hk蛋白中筛选功能性多肽dhg15并检测其结合性能。

血浆中的hk蛋白共有6个结构域，其中第一至第三结构域（d1~d3）组成hk的重链（heavychain，hc），第四至第六结构域（d4~d6）组成hk的轻链（lightchain，lc）。运用bac-to-bac昆虫细胞表达系统制备了hk的重链与轻链蛋白，并使用westernblotting鉴定所纯化的hc（55kd）与lc（35kd）蛋白，其结果如图1所示。

为了研究hk蛋白与lps的结合位点，分别将200nghk、hc、lc蛋白与lps或pbs孵育（4℃，30min）。吸取30μl混匀的polymyxin-b（sigma）至1.5ml离心管中，离心去上清，1mlpbs洗两次（7000rpm，2min）。将各种蛋白样品与处理后的polymyxin-b孵育（4℃，5min），离心去上清，pbs洗两遍。采用60μl蛋白上样缓冲液重悬polymyxin-b沉淀，100℃煮10min，吸取10μl进行westernblotting鉴定，并孵育hk抗体（百奇生物）。

如图2所示，hk和lc能够与lps结合，从而被polymyxin-b微珠共沉淀，提示hk可能通过lc与lps结合。

为了进一步验证上述结论，使用biacore分析方法，分别检测hk和lc与lps结合的亲和力。采用ph=7.4的runningbuffer稀释hk样品，稀释一系列浓度至0nm、6.4nm、19.3nm、57.7nm、173nm、520nm。按照biacorex100controlsoft的protocol，将hk蛋白偶联到hpa芯片上，偶联水平为3000ru。设置进样时间为180s，解离时间为500s，再生液为0.1mhcl，再生时间为120s。按照biacorex100controlsoft的protocol，进行上机测试。

如图3所示，hk、lc与lps均有物理性的直接结合，kd值分别为1.713*10^-7m和1.524*10^-9m。上述结果说明，与hk相比，lc与lps的结合力更强，进一步提示lc含有hk与lps直接结合的位点。

为了进一步研究究竟是lc中的哪一个结构域与lps发生了结合，使用bac-to-bac昆虫细胞表达系统制备了lc中的第四结构域（d4）、第五结构域（d5）和第六结构域（d6）蛋白，并经过westernblotting鉴定。使用polymyxin-b微珠与d4、d5或d6蛋白孵育后，检测其与lps的结合情况，只有d5可以被polymyxin-b共沉淀下来，提示d5是hk与lps的结合位点，其结果如图4所示。

随后，合成了d5上的8个多肽片段（南京金斯瑞生物科技公司），每个多肽片段包含含30个氨基酸。将8个多肽片段分别和lps共孵育后，再和lc相互作用，然后使用同上的实验方法检测结合情况，只有多肽6和多肽7可以抑制lps与lc的结合，其结果如图5所示。比对多肽片段6和7的氨基酸序列可知，其共有的序列为dhghkhkhghghgkh（将其命名为dhg15）。

据文献报道，富含组氨酸的多肽可以中和由lps导致的宿主炎症反应，而本发明的dhg15多肽中恰恰含有大量组氨酸，因此推测组氨酸是hk与lps结合的主要氨基酸。随后，将dhg15多肽中的组氨酸（h）突变为同样带正电荷的赖氨酸（k），即为dkgkkkkkgkgkgkk。将dhg15多肽以及突变多肽分别与lps预孵育后，使用polymyxin-b微珠与上述混合物孵育，经westernblotting检测其与lps的结合情况。

如图6所示，dhg15多肽可以抑制hk轻链与lps的结合，而将组氨酸（h）突变为赖氨酸（k）后，该突变多肽不能抑制hk轻链与lps的结合。同时，采用d5中其它片段的无关多肽作为阴性对照，提示组氨酸是hk与lps结合的关键。

实施例二：lps通过糖链与hk结合。

lps主要由糖链和脂质a两部分组成，为了检测lps通过其结构上的哪一部分与hk结合，向96孔板的每孔中加入2μg脂质a、脱脂lps、lps或bsa（内含0.1mna2co3，ph=9.6），4℃包被，过夜。pbs清洗孔板后，加入1%明胶，37℃封闭1h。pbs清洗孔板后，各孔加入fitc标记的hk蛋白（100nm），37℃孵育1h。吸走液体后，采用酶标仪检测各孔中的荧光强度（激发光：494nm，发射光：518nm）。

如图7所示，脱脂lps与hk的结合能力最强，相比于脂质a与hk的结合能力，具有显著性差异，提示lps上的糖链是lps与hk结合的主要位点。

实施例三：dhg15多肽的活性考察。

为了研究dhg15多肽能否改善由lps导致的小鼠死亡，将小鼠随机分为两组，通过腹腔注射方式进行给药，一组注射与无关多肽（200g/只）共孵育的lps（对照组），另一组注射与dhg15多肽（200g/只）共孵育的lps（治疗组），观察两组小鼠的生存率。结果发现，经过dhg15多肽处理，可以显著改善小鼠由lps导致的死亡率。

为了研究dhg15是否会影响血浆中主要炎症因子的水平，比较对照组小鼠和dhg15治疗组小鼠血浆中主要炎症因子的含量。如图9所示，与对照组小鼠相比，dhg15治疗组小鼠血浆中tnf-a、il-1b和il-6的水平明显降低，说明在由lps导致的炎症反应中，dhg15可以显著抑制血浆中主要炎症因子的水平。

以上结果说明，应用dhg15多肽可以阻断血浆hk蛋白与lps的结合，有利于预防由革兰氏阴性杆菌引起的败血症的发病，同时有利于缓解发病后的症状，起到兼顾预防和治疗的双重效果。