本发明涉及生物
技术领域：
：，特别是涉及改造的转铁蛋白dna结合域、重组dna聚合酶及制备方法。
背景技术：
：：脱氧核糖核酸(dna)是生命遗传信息保存和传递的载体，细胞内参与脱氧核糖核酸合成的dna聚合酶(dnapolymerase)是实现dna分子自体复制和遗传信息传递功能的关键分子。生物技术的发展提供了dna分子的体外复制方法，并由此发展起来的核酸分子检测技术已日益成为各种生物检测的关键技术，广泛应用于药物开发、食品安全性检测、病原微生物鉴定、疾病机理和药物靶向治疗等理论研究与检验之中。体外酶法合成dna分子的关键是得到满足不同需要的耐热dna聚合酶(thermostablednapolymerase)。例如：进行pcr扩增的耐热dna聚合酶、抗酶抑制剂(inhibitors)的耐热dna聚合酶、能在超低模板浓度下扩增dna的耐热dna聚合酶等。临床体外诊断中经常需要对体液中的核酸进行扩增检测，而在体液中存在多种pcr反应抑制剂，如：氯化血红素、钙离子、血红蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等。这些pcr抑制剂的存在限制了直接采用体液进行pcr扩增，通常需进行核酸纯化去除pcr反应抑制剂后，采用纯化后的核酸进行pcr扩增。国外的研究发现，利用古细菌(archaebacteria)核酸结合蛋白的dna结合结构域(dnabindingmotif)与耐热dna聚合酶(thermostablednapolymerase)重组(chimericrecombination)，可构建出对模板dna亲和力(infinitytodnatemplate)提高、且保留原dna聚合酶各种功能的新型耐热dna聚合酶。这种重组耐热dna聚合酶具有以下特点：(1)与模板dna分子的亲和力大大提高，能在模板dna分子浓度很低的情况下与之结合，开启dna合成；(2)与模板dna分子亲和力提高的重组耐热dna聚合酶，能在更加复杂的反应环境中，例如：含有污染物或干扰分子的dna初级制品或原始材料溶液中，启动dna合成；(3)与特异病原物基因组dna的某些区段具有显著提高的亲和力，能在更低的模板dna浓度或更加复杂的干扰分子存在时，开启dna合成。这些特点，可改善核酸分子检测的过程(使之更简化和可规模化操作)和提高检测灵敏度及稳定性。而目前具有上述优点的重组dna聚合酶数量较少，因此，急需加强这方面研发工作。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于获得不易受生物大分子(多糖、蛋白质)、有机和无机污染分子(为释放dna和变性生物大分子加入化合物)等抑制的新型重组dna聚合酶，实现直接pcr；获得与模板分子亲和力提高的新型重组dna聚合酶，实现对更低浓度模板的扩增，提高检测的灵敏度和稳定性。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种改造的转铁蛋白dna结合域，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白ltf、血清铁传递蛋白tf、黑素转铁蛋白mtf或卵转铁蛋白otf，所述各转铁蛋白的n端具有一段同源的dna结合域，其中，dna结合域的第10位、第20位分别为c；所述改造的转铁蛋白dna结合域的氨基酸序列为：将所述dna结合域中第10位与第20位的c换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。进一步地，所述第10位的c换为r，第20位的c换为a或者g。进一步地，将所述dna结合域第1-5位的氨基酸换为kfkyk和/或第28-31位换为kkvk。进一步地，所述乳转铁蛋白ltf的dna结合域采用人源，如seqidno.1所示，或采用鼠源，如seqidno.2所示；所述血清铁传递蛋白tf的dna结合域采用人源，如seqidno.3所示，或采用鼠源，如seqidno.4所示；所述黑素转铁蛋白mtf的dna结合域采用人源，如seqidno.5所示，或采用鼠源，如seqidno.6所示；所述卵转铁蛋白otf的dna结合域采用鸡源，如seqidno.7所示。本发明还提供了一种重组dna聚合酶的制备方法，采用上述改造的转铁蛋白dna结合域与dna聚合酶进行偶联，构建重组dna聚合酶；或采用上述改造的转铁蛋白dna结合域中相同的dna结合域或不同的dna结合域串联在一起后再与dna聚合酶偶联，构建重组dna聚合酶；或将上述构建的重组dna酶与其他重组dna聚合酶或未改造的dna聚合酶混合后获得复合的重组dna聚合酶。进一步地，所述dna聚合酶为耐热dna聚合酶或逆转录酶。进一步地，所述耐热dna聚合酶为taqdna聚合酶。本发明还提供一种采用上述制备方法制备的新型的重组dna聚合酶。本发明还提供了一种包含上述重组dna聚合酶的pcr检测试剂盒。通过采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：本发明获得了一种新型的dna结合域—转铁蛋白dna结合域，可用于与dna聚合酶偶联构建重组dna聚合酶，构建成的重组dna聚合酶，不受生物大分子(多糖、蛋白质)、有机和无机污染分子(为释放dna和变性生物大分子加入化合物)等抑制，可以实现直接pcr；进而可以简化检测程序，提高效率，便于操作；同时可以降低费用、减少成本、缩短检测时间，增加效益。另外，构建成的重组dna聚合酶，与模板分子亲和力提高，可实现对更低浓度模板的扩增，提高检测的灵敏度和稳定性。附图说明上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。图1是实施例3中的重组耐热dna聚合酶与taqdna聚合酶扩增效率比较结果图；图2是实施例3中的重组耐热dna聚合酶与taqdna聚合酶扩增速度比较结果图；图3是实施例3中的重组耐热dna聚合酶与taqdna聚合酶血清耐受性比较结果图。具体实施方式为了获得不易受抑制、对模板浓度要求低的新型的dna聚合酶，本发明选择了通过重组的方式构建重组dna聚合酶，通过大量研究发现，转铁蛋白的dna结合域经过部分氨基酸替换改造后可用于构建具有上述效果的重组dna聚合酶。转铁蛋白共有4种同源蛋白：乳转铁蛋白(lactotransferrin，ltf)、血清铁传递蛋白(serotransferrin，tf)、黑素转铁蛋白(melanotransferrin，mtf)、卵转铁蛋白(ovotransferrin，otf)。这4种蛋白的n端具有一段同源的dna结合域。其中，dna结合域的第10位、第20位分别为c。实施例1本实施例检测了3种人源、3种鼠源、1种鸡源的转铁蛋白的dna结合域，氨基酸序列分别如下：人ltf(hltf)：grrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvr(seqidno.1)人tf(htf)：avpdktvrwcavseheatkcqsfrdhmksvi(seqidno.3)人mtf(hmtf)：vlggmevrwcatsdpeqhkcgnmseafreag(seqidno.5)鼠ltf(mltf):lakattvqwcavsnseeekclrwqnemrkvg(seqidno.2)鼠tf(mtf)：avpdktvkwcavsehentkcisfrdhmktvl(seqidno.4)鼠mtf(mmtf)：vvcvmevqwctisdaeqqkckdmseafqgag(seqidno.6)鸡otf(gotf)：appksvirwctisspeekkcnnlrdltqqer(seqidno.7)上述dna结合域的改造方法为：由于转铁蛋白的dna结合域中有2个c氨基酸可形成二硫键，二硫键在高温下不稳定，可将第10位与第20位的c换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。例如，优选地，可将片段中第10位的c换成r,第20位的c换为a，或者g这2种较小的氨基酸。这段改造后的dna结合域可直接与耐热dna聚合酶偶联形成重组耐热dna聚合酶。改造后的转铁蛋白dna结合域氨基酸序列如下：人ltf’(hltf’)：grrrrsvqwravsqpeatkafqwqrnmrkvr(seqidno.8)人tf’(htf’)：avpdktvrwravseheatkaqsfrdhmksvi(seqidno.9)人mtf’(hmtf’)：vlggmevrwratsdpeqhkagnmseafreag(seqidno.10)鼠ltf’(mltf’):lakattvqwravsnseeekalrwqnemrkvg(seqidno.11)鼠tf’(mtf’)：avpdktvkwravsehentkaisfrdhmktvl(seqidno.12)鼠mtf’(mmtf’)：vvcvmevqwrtisdaeqqkakdmseafqgag(seqidno.13)鸡otf’(gotf’)：appksvirwrtisspeekkannlrdltqqer(seqidno.14)实施例2可将实施例1中的获得的转铁蛋白dna结合域进行进一步改造，将转铁蛋白dna结合域第1-5位的氨基酸换为kfkyk，第28-31位换为kkvk，其中1-5位的氨基酸改造相对重要。dna聚合酶的性能可得到进一步提升。第二步改造后的转铁蛋白dna结合域氨基酸序列如下：人ltf”(hltf”)：kfkyksvqwravsqpeatkafqwqrnmkkvk(seqidno.15)人tf”(htf”)：kfkyktvrwravseheatkaqsfrdhmkkvk(seqidno.16)人mtf”(hmtf”)：kfkykevrwratsdpeqhkagnmseafkkvk(seqidno.17)鼠ltf”(mltf”):kfkyktvqwravsnseeekalrwqnemkkvk(seqidno.18)鼠tf”(mtf”)：kfkyktvkwravsehentkaisfrdhmkkvk(seqidno.19)鼠mtf”(mmtf”)：kfkykevqwrtisdaeqqkakdmseafkkvk(seqidno.20)鸡otf”(gotf”)：kfkykvirwrtisspeekkannlrdltkkvk(seqidno.21)实施例3将实施例1、2中改造后的转铁蛋白dna结合域与taqdna聚合酶进行偶联，形成重组耐热dna聚合酶。(一)扩增效率对比实验：纯化的taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq连续对半稀释,取各稀释度1μl于20μl反应体积中扩增1.5kbdna片段(25cycles)。如图1所示，琼脂糖凝胶电泳(loading5μl/lane)1-6道分别为相等酶蛋白浓度的taq或重组耐热dna聚合酶连续对半稀释(1,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32)的扩增结果。(二)扩增速度对比实验：如图2所示，taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq在20秒延伸条件下扩增1.5kb、2.5kb、3.5kb和4.5kbdna片段。实验结果证明，重组耐热dna聚合酶相对taqdna聚合酶扩增效率更高(如图1所示)、扩增速度更快(如图2所示)。(三)血清耐受性对比实验以taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq配制定量pcr反应体系(sybrgreen),加入pcv2dna病毒粒子(103pcv2particles/reaction),pcv2引物,和不同量的猪血清(each0，1，2，3，4μlofpigserumintotal20μlofqpcrsolution),进行pcr扩增。加入血清的样品(1-4μl)比未加入(0μl)的样品扩增效率明显下降,但使用重组耐热dna聚合酶和taq扩增的样品具有极显著的下降速率差异。(如图3所示)，实验结果证明，重组耐热dna聚合酶相对taqdna聚合酶血清耐受性更高。实施例4将实施例1、2中改造后的转铁蛋白dna结合域与逆转录酶进行偶联，形成重组逆转录酶。进行rt-pcr实验分析，经与实施例3类似的扩增效率对比实验、扩增速度对比实验、血清耐受性对比实验，基本得到相似的结果，扩增效率更高、扩增速度更快、血清耐受性更高。实施例5将实施例1、2中改造后的转铁蛋白dna结合域中相同的dna结合域联在一起后再与dna聚合酶偶联，构建重组dna聚合酶；或将实施例1、2中改造后的转铁蛋白dna结合域中不同的dna结合域串联在一起后再与dna聚合酶偶联，构建重组dna聚合酶；均可得到类似的实验结果，扩增效率更高、扩增速度更快、血清耐受性更高。另外，将实施例1、2中构建的重组dna酶、或本实施例中构建的上述重组dna酶与其他现有技术中的重组dna聚合酶或未改造的dna聚合酶混合后可获得复合的重组dna聚合酶，其相对于普通的dna聚合酶也具有扩增效率更高、扩增速度更快、血清耐受性更高的优点。最后需要说明的是，本发明中所述的第10位、第20位并非为固定位置，其表明的是该两个位置对应的氨基酸均为c，两个c相差10个氨基酸，其它第1-5位、第28-31位均是相对于第10位而言的位置。即对于一个40个氨基酸的dna结合域，其中有两个氨基酸均为c，且两者之间相差10个氨基酸，则将这两个氨基酸对应的位置定为第10、第20位。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12