一种左旋多巴转化液的膜过滤分离纯化方法与流程

本发明涉及生物化工及分离纯化领域，具体地说涉及一种左旋多巴转化液的膜过滤分离纯化方法。
背景技术：
：左旋多巴(3，4-dihydroxylphenylalanine，Levodopa)，又称L-多巴，化学名称为3，4-二羟基苯基丙氨酸，CAS：59-92-7；白色结晶性粉末，无臭无味；是生物体内一种重要的生物活性物质，是L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。其结构式如下：左旋多巴及复方左旋多巴(如美多芭)治疗常见老年病帕金森氏病已有40多年的历史，至今仍是治疗帕金森病最有效的药物，且耐受性好，不但能改善运动迟缓，缓解主要症状，而且能延长帕金森病患者的寿命。左旋多巴2007年在世界畅销药中排名100，2009年实现全球产量达到250吨，2010年销售金额已超过15亿美元。2015年全球产量接近1000吨，销售额超过30多亿美金。国内外科学家正在不断努力提高左旋多巴的生产产量。据报道，左旋多巴的生产方法有天然植物提取法、化学合成法和微生物酶转化法。传统的制取方法是从植物猫豆中经科学提取的，中国专利CN103641730A公布了一种左旋多巴的制备方法，通过机械压扁猫豆，用醋酸水浸提，浸提液用三氯醋酸去除蛋白，浓缩成膏，用水溶解，调节pH至等电点析出粗结晶，用热酸水溶解，活性炭脱色，室温重结晶。中国专利CN103664669A公布了一种制备高纯度左旋多巴的工艺方法，以猫豆为原料，用酸水提取，提取液通过电渗析，对左旋多巴进行富集和分离。植物提取法由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足当前市场需求。左旋多巴的化学合成较多。目前，工业化生产左旋多巴原料药的化学方法源于1987年，vanillin(香草醛)以及hydantoin(乙内酰脲)，需要经过8步的反应制得。但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开的过程控制难度大，同时存在生产成本高、环境污染严重等问题。利用微生物生产左旋多巴，就是利用了代谢途径中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶、转移酶将不同的底物转变成左旋多巴，可获得大量的左旋多巴，许多国家对其生产进行了大量的研究，采取了许多不同的合成方法。上世纪60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成左旋多巴进行了深入的研究，通过菌种选育和发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。中国专利CN103122361A公布了通过构建重组工程菌株，提供一种以L-酪氨酸为底物合成左旋多巴的方法。中国专利CN104726513A公布了一种酶法制备左旋多巴的方法，以嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)生产酪氨酸酶，以L-酪氨酸为原料转化制备左旋多巴。然而，目前利用生物法制备左旋多巴实现工业化的报道并不多见。现有的生物法制备左旋多巴存在反应时间长，副产物较多，转化率低，底物残留浓度高，成品色泽较差，结晶度较低，杂质含量高等一系列问题。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是提供一种基于陶瓷膜系统过滤、适用于工业化生产的左旋多巴结晶粉的膜过滤分离纯化方法，用于获得高收率、高纯度、高结晶度、高透光率的左旋多巴无水结晶粉末。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种左旋多巴转化液的膜过滤分离纯化方法，通过酪氨酸酚裂解酶生物转化获得含有左旋多巴、酪氨酸酚裂解酶、残留底物、蛋白、色素、盐类的左旋多巴转化液，转化液中左旋多巴含量不低于100～120g/L，用酸液将转化液的pH调至强酸性，适当升温后利用陶瓷膜过滤体系收集清液，至截留液中左旋多巴浓度降至5～8g/L时，收集得到的陶瓷膜过滤清液加入活性炭后搅拌升温脱色，过滤清液后调碱结晶，再过滤得到结晶后进行干燥，获得左旋多巴无水结晶粉末。本发明是基于酪氨酸酚裂解酶酶法反应获得的转化液进行左旋多巴无水结晶粉末的分离和纯化。所述酪氨酸酚裂解酶酶法是采用酪氨酸酚裂解酶在辅酶(5-磷酸吡哆醛)存在的条件下，与基础底物搅拌混合，反应产生左旋多巴。基础底物为邻苯二酚/丙酮酸铵或邻苯二酚/丙酮酸/浓氨水。如式(I)所示，酪氨酸酚裂解酶在NH4+过量存在的条件下，可将一分子的邻苯二酚和一分子的丙酮酸经一步反应生物合成左旋多巴。该反应的残留物包括：多余的丙酮酸、邻苯二酚、铵盐、酶蛋白等杂质，以及邻苯二酚氧化物、残余酶蛋白溶液等色素。本发明所述陶瓷膜为常规陶瓷膜材料制成的微滤膜，陶瓷膜元件孔径为50-200nm，优选为50nm，陶瓷膜材质优选为二氧化锆，单根膜为19通道，耐受压力为0-0.6Mpa。须要说明的是，陶瓷膜材料包括但不限于氧化铝、氧化钛、氧化锆等材质，优选膜元件材质为二氧化锆，其化学性质稳定，耐酸、耐碱、耐有机溶剂，机械强度大，可反复冲洗；抗微生物能力强；耐高温；过滤精度高，分离效率好，使用寿命长。本发明所采用的陶瓷膜均为现有产品，但其对左旋多巴含量不低于100～120g/L的转化液的过滤效果非常出色。所述转化液调酸pH调至强酸性，即0.95～1.05，调酸时转化液温度升至30～40℃；所用酸液包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、醋酸中的任意一种或多种的组合。调酸目的是将转化液里的左旋多巴晶体全部溶解，同时酶蛋白在此条件下可加速变性絮凝。所述转化液调碱结晶温度控制在30～40℃之间，pH调至3.9～4.3，缓慢搅拌1～2小时待大量晶体生成后，降温至5～10℃，静置后过滤收集晶体；调碱结晶所用碱液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水溶液中的任意一种或多种的组合。作为本发明的进一步优化，为了提高成品的一次结晶品质和收率，节省成本，调碱结晶过滤时，用少量纯水均匀喷淋2～3次，最后用纯水泡洗一次，甩干后即可收集晶体。陶瓷膜过滤清液按质量体积百分比加入1.0～2.0％的活性炭，升温至50～55℃，保温2小时并缓慢搅拌。清液中的色素被活性炭吸附，其中含有极少量的酶蛋白在酸性条件下已经变性絮凝，进一步提高了分离效率。作为本发明的进一步优化，调碱结晶前还加入抗氧化剂，其在总料液中的浓度为0.5～1.0g/L，，所述抗氧化剂包括NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5或其钾盐、维生素C或其钠盐或钾盐中的任意一种或多种的组合。调碱结晶后的干燥步骤，是将物料堆积5±0.5cm厚，温度45℃下，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥20～30min。这里需要说明的是，本发明酪氨酸酚裂解酶生物催化方法为公知技术，所使用的酪氨酸酚裂解酶可直接购买获得，也可利用含有酪氨酸酚裂解酶的已知重组E.coli发酵表达获得含酶的菌体发酵液，再经膜浓缩、机械破壁、离心除菌渣获得浓缩酶液。本发明所述方法获得的左旋多巴无水结晶粉末收率不低于85％。所获得的左旋多巴无水结晶粉末，其总杂质按HPLC出峰面积百分比计不大于0.1％，无水结晶的结晶度为90％以上、结晶粉末颗粒粒径大小为120μm～250μm。有益效果：本发明的方法在实现工业化的基础上，采用陶瓷膜过滤系统，不仅提高了产品的收率，同时大大提高了生产效率，缩短了生产周期，降低的生产成本，使得商业化生产更具规模化。采用真空微波干燥技术，减少受传统干燥的鼓热风、翻料等外力作用而造成的产品损耗，避免左旋多巴经高温氧化破坏或分解后引起的产品外观褐变，提高产品干燥后的水分均一性；该方法获得的结晶粉末品质明显优于EP和USP要求，总杂质按HPLC出峰面积百分比计不大于0.1％(EP为1.0％，USP为1.1％)，单个杂质按HPLC出峰面积百分比计不大于0.1％(EP和USP最高均为0.5％)，结晶粉末的结晶度在90％以上。附图说明图1是本发明实施例2的高效液相色谱分析结果；图2是本发明实施例3的高效液相色谱分析结果；图3为本发明实施例1转化过程中左旋多巴和邻苯二酚变化情况的HPLC图谱(转化进行至1小时40分钟)；图4为本发明实施例1转化过程中左旋多巴和邻苯二酚变化情况的HPLC图谱(转化进行至3小时)；图5为本发明实施例1转化过程中左旋多巴和邻苯二酚变化情况的HPLC图谱(转化进行至4.5小时)。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。实施例1酪氨酸酚裂解酶生物催化工艺向水中投放初始丙酮酸，用浓氨水控制pH在7.0～9.0；再依次投加抗氧化剂、螯合剂、铵盐、5-磷酸吡哆醛，再次用浓氨水将pH控制在7.0～9.0，加入浓度为80～200g/L的重组酪氨酸酚裂解酶的酶液，通入氮气，调整温度至反应温度，氨水调节pH至7.0～9.0，加入邻苯二酚开始反应；初始基础底物邻苯二酚与丙酮酸及其钠盐投放摩尔比为1∶1～1.5。之后，每10min分别投加底物邻苯二酚和丙酮酸(或丙酮酸铵，下文除特别说明外均只丙酮酸)为2g/L，邻苯二酚的最终投加浓度为50～70g/L(以初始体积计算)、丙酮酸最终投加浓度为50～70g/L(以初始体积计算)，当底物邻苯二酚残留≥5g/L时，停止投料，继续搅拌0.5h～1h后反应结束，获得左旋多巴转化液。反应转化率之95％，转化液中左旋多巴含量可达100～120g/L。转化步骤中，还需要添加0.2mol/L～0.3mol/L的铵盐，包括但不限于甲酸铵、乙酸铵、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或多种组合。投入丙酮酸或其铵盐后，还投入底物质量1％～5％的抗氧化剂，抗氧化剂包括但不限于NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5、维生素C及其钠盐的任意一种或多种的组合。投入丙酮酸和抗氧化剂后，还投入0.5g/L～1.5g/L的螯合剂，螯合剂包括但不限于酒石酸及其钾钠盐、乙二胺四乙酸(EDTA)及其二钠盐的任意一种。如图3至图5所示，催化反应进行了4.5小时，体系中左旋多巴含量逐渐增加，邻苯二酚浓度始终≤5g/L；反应结束时，邻苯二酚的剩余含量只有0.71g/L。实施例22500L转化体系取实施例1获得的左旋多巴转化液2500L，浓度110g/L，加入浓盐酸调pH至0.96，浓盐酸用量为190kg。料液温度升至30～40℃，开启陶瓷膜系统过滤。选用江苏久吾高科技股份有限公司的陶瓷膜系统，陶瓷膜元件孔径为50nm，材质为二氧化锆，单根膜为19通道，膜总面积为21.2平方米。利用陶瓷膜收集清液，当达到最低循环量时，约500L体系，开始流加纯化水。检测截留液中左旋多巴的含量，当降至5g/L时，停止过滤，截留液总体积为530L。收集得到的清液体积为3000L，清液中左旋多巴的含量为89g/L，故陶瓷膜的收率为97.1％。向收集的3000L左旋多巴清液中加入36kg的活性炭，升温至52℃，缓慢搅拌2小时。保温结束后，此物料经压滤缸除去活性炭，清液经过精密过滤器后压入精烘包车间内的搪瓷反应釜中。开启搅拌，向反应釜中压入浓度为150g/L的亚硫酸钠溶液14L，至总料液中抗氧化剂浓度为0.5～1.0g/L。控制物料温度35℃左右，开启搅拌，缓慢加入30％的NaOH溶液，将pH调至3.9，缓慢搅拌2小时，开始降温；当温度降至8℃时，停止搅拌，静置结晶5小时。用篮式离心机离心收集晶体。离心时，用纯化水喷淋2次，每次用量为6L水，最后用水泡洗一次，用量为10L水。甩干后收集晶体总重量为290kg，装入一层聚乙烯袋，待烘干。对离心后的晶体物料进行真空微波干燥，干燥物料厚度5±0.5cm，干燥温度45℃，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥时长20～30min。干燥后总重量为245.6kg，故一次结晶收率为91.0％，总收率为89.3％。经检测，烘干得到的产品均符合EP和USP要求：总杂质按HPLC出峰面积百分比计不大于0.1％，结晶粉末的结晶度在90％以上，颗粒粒径为120μm～250μm。按EP要求，各指标分别为：外观为白色结晶性粉末，鉴别IR与对照品IR图谱一致，样品含量测定主峰保留时间与对照品峰保留时间一致，溶液颜色没有深于BY6标准比色溶液，干燥失重为0.19％，pH为5.7，残渣≤0.1％，重金属≤10mg/kg，有关物质合格，光学纯度为99.8％，含量用滴定法检测为99.3％。按USP要求，各项指标分别为：外观为白色结晶性粉末，鉴别IR与对照品IR图谱一致，样品含量测定主峰保留时间与对照品峰保留时间一致，干燥失重为0.19％，旋光度为-165°，残渣≤0.1％，重金属≤10mg/kg，含量用高效液相色谱法检测为99.1％，杂质检测符合要求。实施例35000L转化体系取实施例1获得的左旋多巴转化液5000L，浓度115g/L，加入浓硝酸调pH至1.04，浓硝酸用量为325kg，料液温度升至30-40℃之间，开启陶瓷膜系统过滤。选用江苏久吾高科技股份有限公司的陶瓷膜系统，陶瓷膜元件孔径为50nm，材质为二氧化锆，单根膜为19通道，膜总面积为21.2平方米。利用陶瓷膜收集清液，当达到最低循环量时，约700L体系，开始流加饮用水。检测截留液中左旋多巴的含量，当降至8g/L时，停止过滤，截留液总体积为830L。收集到的清液体积为6200L，清液中左旋多巴的含量为90.6g/L，故陶瓷膜的收率为97.7％。向收集的6200L左旋多巴清液中加入62kg的活性炭，升温至53℃，缓慢搅拌2小时。保温结束后，此物料经压滤缸除去活性炭，清液经过精密过滤器后压入精烘包车间内的搪瓷反应釜中。开启搅拌，向反应釜中压入浓度为150g/L的维生素C溶液25L，至总料液中抗氧化剂浓度为0.5～1.0g/L。控制物料温度35℃左右，开启搅拌，缓慢加入30％的氢氧化钾溶液，将pH调至4.3，缓慢搅拌2小时后，开始降温；当温度降至7℃时，停止搅拌，静置结晶5小时。用篮式离心机离心收集晶体。离心时，用纯化水喷淋2次，每次用量为6L水，最后用水泡洗一次，用量为10L水。甩干后收集晶体总重量为594kg，装入一层聚乙烯袋，待烘干。对离心后的晶体物料进行真空微波干燥，干燥物料厚度5±0.5cm，干燥温度45℃，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥时长20～30min。干燥后总重量为506kg，故一次结晶收率为90.1％，总收率为88.0％。经检测，烘干得到的产品均符合EP和USP要求。总杂质按HPLC出峰面积百分比计不大于0.1％，结晶粉末的结晶度在90％以上，颗粒粒径为120μm～250μm。按EP要求，各指标分别为：外观为白色结晶性粉末，鉴别IR与对照品IR图谱一致，样品含量测定主峰保留时间与对照品峰保留时间一致，溶液颜色没有深于BY6标准比色溶液，干燥失重为0.16％，pH为5.5，残渣≤0.1％，重金属≤10mg/kg，有关物质合格，光学纯度为99.6％，含量用滴定法检测为99.3％。按USP要求，各项指标分别为：外观为白色结晶性粉末，鉴别IR与对照品IR图谱一致，样品含量测定主峰保留时间与对照品峰保留时间一致，干燥失重为0.16％，旋光度为-164°，残渣≤0.1％，重金属≤10mg/kg，含量用高效液相色谱法检测为99.0％，杂质检测符合要求。试验例HPLC分析上述实施例2和实施例3产品的杂质，其结果如图1、图2所示。表1实施例2左旋多巴无水结晶粉末HPLC分析结果保留时间面积％面积高度积分类型13.52375730.03928VV26.2982911139599.962653746BB324.10521240.01256BV表2实施例3左旋多巴无水结晶粉末HPLC分析结果保留时间面积％面积高度积分类型13.08094820.03614VV24.0862912242599.942652535BB325.11594720.03731VB表1、表2分别对应说明书附图图1、图2的HPLC图谱。本发明根据现有的生产制备工艺，所使用的原料均易溶于水，故生产过程中无需用到有机溶剂。得到的产品中杂质含量远远低于其它工艺生产得到的产品，纯度均高于99.9％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3