具有强寄生广谱病原真菌的哈茨木霉工程菌株的构建及其应用的制作方法

本发明涉及一株强寄生广谱病原真菌的哈茨木霉工程菌株的构建及其应用，属于应用微生物技术领域。

技术背景

重寄生是指一种真菌捕食或者寄生另外一种真菌，获取营养，满足自身的生长繁殖；当被捕食的或被寄生的是植物病原真菌，可以抑制病原真菌的生长繁殖，达到生物防治植物真菌病害的效果。研究和应用最广泛的真菌杀菌剂是在根际有较强竞争能力的木霉(Trichoderma spp.)，因为其能重寄生植物病原真菌，减轻真菌引起的病害；定殖植物根际，活化养分，促进植物生长，提高经济作物产量。

已登记的木霉制剂，主要用于土壤处理(与各种肥料混合施用)和种子处理(种子包衣)。由于土壤和作物种类的差异、土壤温度、湿度的变化以及土著微生物的存在显著影响着外源木霉的定殖，严重制约了功能木霉的进一步应用。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)SQR-T037是我国科学家分离得到并已实现商品化应用的一株兼具生防和促生功能的植物有益菌，田间应用效果并没有实验室条件下那么稳定。因此，随着SQR-T037基因组的测序完成，研究木霉重寄生病原真菌的关键基因，通过遗传改造，获得稳定遗传的工程菌株，增强木霉重寄生土壤病原真菌能力，提高木霉生防效果，对木霉及其相关产品的意义重大。因此，研究木霉菌中与生防相关基因的功能，对明确其的生防机制和改良菌种都具有重要的理SQR-T037论意义。

活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)，是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，机体内氧化代谢可不断形成活性氧，在一定的空间、时间和一定的限度内活性氧有积极的生理作用。早期研究表明，产生ROS是植物、动物重要免疫防御反应之一，参与多种信号传导。目前研究最为深入的是哺乳动物gp91^phnox，巨噬细胞接触病原细菌后，活性氧剧增，超氧化物、过氧化氢可以直接杀死病原细菌或者激发多种蛋白酶；功能分析真菌gp91^phnox的同源蛋白Nox1，对菌丝的繁殖和防御有重要影响。敲除Aspergillus nidulans的基因nox1无法形成子实体，阻止该菌的有性生殖。敲除Podospora anserina和Neurospora crassa中nox1，有同样的现象。NOX介导的ROS系统同样也影响真菌自我防御机制，识别非自身的菌丝体。本发明从活性氧H₂O₂为出发点，发掘木霉重寄生病原真菌的关键基因，并且构建强寄生病原真菌的工程菌株，满足农业生产运用需求。

技术实现要素：

本发明发现了参与调控哈茨木霉重寄生病原真菌过程的相关核心基因；

本发明的另一目的在于构建一种强寄生多种病原真菌的工程菌株，提高木霉在农业生产中防治病害效果，促进以功能木霉为主的微生物菌肥中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的Nox1基因在调控木霉重寄生病原真菌中的应用。

一种构建过表达nox1重组质粒的方法，该构建方法为：构建以pcDNA1为强启动子的过量表达载体，以引物扩增H₂O₂合成的相关编码基因cDNA及基因的下游500bp序列，然后将扩增产物分别插入质粒pPcdna1-cel7b中ClaI位点和SalI位点，得到过量表达nox1重组质粒。所述H₂O₂合成的相关编码基因为Nox1基因。优选的，以哈茨木霉SQR-T037的基因组DNA为模板以引物infu-ter-fw(SEQ ID NO.2)和infu-ter-rev(SEQ ID NO.3)扩增基因nox1下游500bp为终止子；设计引物Infu-nox-fw(SEQ ID NO.4)和infu-nox-rev(SEQ ID NO.5)从哈茨木霉SQR-T037 cDNA中扩增nox1的cDNA。

采用上述方法构建的过表达nox1重组质粒。

一种构建强寄生广谱病原真菌的木霉工程菌株的方法，构建以pcDNA1为强启动子的过量表达载体，以引物扩增H₂O₂合成的相关编码基因cDNA及基因的下游500bp序列，然后将扩增产物分别插入质粒pcdna1-cel7b中ClaI位点和SalI位点，得到过量表达nox1重组质粒，将过量表达nox1重组质粒转化野生型木霉SQR-T037，PCR验证后，确定获得遗传稳定的木霉工程菌SQR-NOX1-4。

含有上述过量表达nox1重组质粒的工程菌株。

采用上述的方法构建的木霉工程菌株工程菌株。

上述的过量表达nox1重组质粒在强化木霉重寄生病原真菌及提高生防效果中的应用。

上述的工程菌株在强化木霉重寄生病原真菌及提高生防效果中的应用。

上述的工程菌株在制备以功能木霉为主的微生物菌肥中的应用。

本发明技术方案的详细内容为：

1.基因nox1调控SQR-T037重寄生多种病原真菌

SQR-T037基因组中，预测三个ROS相关的家族基因。Nox1，酶促反应的核心结构域，与哺乳动物gp91^phnox结构相似。

本领域技术人员研究发现了H₂O₂是SQR-T037重寄生病原真菌的主要活性因子，而Nox1基因介导菌丝表面H₂O₂的合成，参与调控功能木霉重寄生多种病原真菌的过程。敲除基因nox1，突变子合成H₂O₂能力显著减弱，重寄生核盘菌、尖孢镰刀菌和齐整小菌核的能力显著减弱；互补突变子能恢复野生型重寄生病原真菌的能力。

2.构建过量表达nox1工程菌

构建以pcDNA1为强启动子的过量表达载体。以哈茨木霉SQR-T037的基因组DNA为模板以引物infu-ter-fw(SEQ ID NO.2)和infu-ter-rev(SEQ ID NO.3)扩增基因nox1下游500bp为终止子；内切酶SalI酶切质粒pPcdna1-cel7b，切胶回收后纯化线性化质粒；利用In-Fusion HD Cloning Kit将终止子与线性化质粒融合，转入E.coli DH5α中，提取质粒，得到新的质粒pPcdna1-ter。

收集新鲜培养的SQR-T037的菌丝，液氮研磨后，提取RNA，反转录后制备成cDNA。设计引物Infu-nox-fw(SEQ ID NO.4)和infu-nox-rev(SEQ ID NO.5)从SQR-T037 cDNA中扩增nox1的cDNA，内切酶ClaI酶切pPcdna1-ter，切胶回收后纯化线性化质粒，利用In-Fusion HD Cloning Kit将nox1的cDNA片段与pPcdna1-ter融合，得到重组质粒pPcdna1-nox1-hyg(图2-2)，PEG-CaCl₂介导转化野生型SQR-T037，获得遗传稳定的木霉工程菌，并命名为SQR-NOX1-4。

荧光定量PCR确定SQR-NOX1-4基因nox1转录水平约是野生型的40倍；荧光探针H₂DCFDA检测突变子菌丝表面H₂O₂显著提高，避光下和光照条件下，木霉工程菌SQR-NOX1-4或突变子完全重寄生灰霉病菌、交链格孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌、立枯丝核菌和齐整小菌核，表现出更强的重寄生病原真菌能力。

本发明在接种尖孢镰刀菌后，比较木霉工程菌SQR-NOX1-4与野生型SQR-T037防控病害的盆栽实验，实验结果表明：SQR-NOX1-4显著减少黄瓜根际尖孢镰刀菌的数量，降低黄瓜的发病率，达到23.33％。

所述的强寄生广谱病源真菌的哈茨木霉工程菌株构建过程如下：

PDA平板接种SQR-T037菌块，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水(0.8-0.9％W/V NaCl,0.05％W/V Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；

在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h。观察PDA平板上孢子是否萌发，如未萌发，延长培养时间；

配制溶解酶溶液：0.15g溶解酶(Lysing enzyme，Sigma)溶于20mL溶液A(1.2M sorbitol，0.1M KH₂PO₄，pH 5.6)，0.2μm滤膜过滤除菌；

取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30mL；4℃、2000rpm离心10min，去上清；

加20mL溶液A，再次离心，去上清；加1mL溶液B(1M sorbitol，50mM CaCl₂，10mM TrisHCl，pH 7.5)，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL得到原生质体悬浮液。用质粒大提试剂盒提取质粒pPcdna1-nox1-hyg，Nanodrop测DNA浓度，确保质粒浓度达到1μg/μL；

准备15mL离心管中分别加200μL原生质体悬浮液、10μL纯化的质粒pPcdna1-nox1-hyg和50μL PEG(25％W/V PEG6000，50mM CaCl₂、10mM TrisHCl，pH 7.5)；用枪头混匀，冰上放置20min；

加2mL PEG，轻轻混匀，20℃下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；

将2mL混合液涂布在覆盖层析纸(Whatman)的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；

将条形层析纸片转到含100mg/L潮霉素的PDA平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养10天，至产孢；稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，得到工程菌株。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了Nox1介导的H₂O₂是SQR-T037重寄生病原真菌过程中的重要抑菌成分，研究表明，敲除nox1，突变子失去重寄生核盘菌、尖孢镰刀菌和齐整小菌核的能力，构建互补菌株，恢复野生型所具有的抗性，说明该基因nox1直接调控木霉重寄生病原真菌过程。SQR-T037过量表达nox1工程菌SQR-NOX1-4显著提高重寄生灰霉病菌、交链格孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌、立枯丝核菌和齐整小菌核的能力。盆栽实验证明，2个月内，接种工程菌显著减少尖孢镰刀菌的数量，抑制黄瓜的发病率。本发明可有效解决以木霉为主的微生物制剂及相关生物肥料中功能菌抑制病害发生和田间应用效果不稳定的问题。

附图说明

图1.敲除SQR-T037的nox1策略和PCR筛选转化子

注：A.敲除nox1策略；B.扩增proble2筛选突变子；C.纯化后的突变子；泳道1和2是扩增proble1，泳道4和5扩增proble2；D.扩增proble3；Hyg：潮霉素基因

图2.构建过量表达nox1质粒

注：1.G-418为抗性；2.潮霉素B为抗性。表达Cassette包括pcDNA1启动子、nox1编码区和nox1终止子；箭头是筛选突变子引物

图3.PCR验证过量表达nox1的突变子

注：1-6，随机挑选的突变子；7，野生型SQR-T037

图4.Real-Time PCR验证过量表达nox1的6株突变子菌种基因nox1的转录水平

图5.检测野生型SQR-T037、突变体Δnox1和工程菌株SQR-NOX1-4的菌丝表面H₂O₂活性

图6野生型SQR-T037、突变体Δnox1、Δnox1互补突变体和工程菌株SQR-NOX1-4重寄生病原真菌

注：A.1、2.木霉菌丝重寄生核盘菌；A.3、4.木霉菌丝重寄生尖孢镰刀菌；A.5、6.木霉菌丝重寄生烟草赤星病菌；B.7、8.木霉菌丝重寄生灰霉病菌；B.9、10.木霉菌丝重寄生齐整小菌核

具体实施方式

下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的使用范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。

1.重寄生病原真菌重寄生因子发掘

1)根据SQR-T037基因组注释文件，确定已报道的ROS产生的相关基因nox1(序列见SEQ ID NO.1)经与木霉基因组T.atroviride和T.harzianum CBS 226.95；http://genome.jgi-psf.org/Triat1/Triat1.home.htmL；http://genome.jgi.doe.gov/Triha1/Triha1.home.htmL)blast后，结合生物信息学分析，确定nox1的cDNA序列；

2)利用酵母重组系统构建含有潮霉素的敲除载体，PEG-CaCl₂转化技术，同源重组敲除SQR-T037中基因nox1，获得敲除突变子(图1)；

3)Geneticin抗性基因片段克隆。引物Infusion-Gen-fw(SEQ ID NO.6)和Infusion-Gen-rev(SEQ ID NO.7)从载体pPki-gen(维也纳技术大学Irina S.Druzhinina教授提供，载体pPki-gen及其序列已经公开发表，详见：Seiboth B,Karimi RA,Phatale PA,Linke R,Hartl L,Sauer DG,Smith KM,Baker SE,Freitag M,Kubicek CP(2012)The putative protein methyltransferase LAE1 controls cellulase gene expression in Trichoderma reesei.Mol Microbiol84(6):1150–1164.)中扩增geneticin抗性基因片段，BamHI酶切pUC19，切胶回收并纯化线性化质粒，用In-Fusion HD Cloning Kit将PCR片段融入pUC19的BamHI酶切位点上，得到载体pUC19-Gen。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件：

预变性：94℃5min；

变性：94℃2min；退火：56℃3min；延伸：72℃3min或者30s；共30个循环。

终止延伸：72℃10min；

保温：4℃。

4)互补转化子构建。

以引物Enox-fw(SEQ ID NO.7)和Enox-rev(SEQ ID NO.8)从质粒pPcdna1-nox1-hyg(本发明中见“具体实施方法”2-1)扩增包括pcDNA1启动子、nox1的cDNA和终止子的表达Cassette，PCR程序：变性：95℃3min；退火：56℃1min；延伸：72℃3min；共30个循环；终止延伸：72℃10min。HindIII酶切pUC19-Gen，切胶回收并纯化线性化质粒，利用In-Fusion HD Cloning Kit将PCR片段与质粒pUC19-gen融合，转入大肠杆菌E.coli DH5α中，提取质粒，得到互补质粒pPcdna1-nox1-gen。PEG-CaCl₂介导转化木霉突变子Δnox1原生质体，得到互补突变子(图2)。

5)检测菌丝表面ROS水平(H₂O₂和O₂·^-)，分析突变子重寄生尖孢镰刀菌、齐整小核菌、核盘菌和交链格孢菌的能力差异。结果表明，敲除突变子Δnox1合成H₂O₂的能力显著减弱(图5)，重寄生病原真菌能力也显著减弱(图6)，确定nox1是木霉重寄生病原真菌重寄生过程中的关键基因。

2.表达nox1木霉工程菌的构建与重寄生能力分析

1)以pcDNA1为强启动子的过量表达载体。以引物infu-ter-fw(SEQ ID NO.2)和infu-ter-rev(SEQ ID NO.3)扩增基因nox1下游500bp为终止子；内切酶SalI酶切pPcdna1-cel7b(维也纳技术大学Agnieszka Przylucka博士提供，质粒pPcdna1-cel7b已经公开发表，详细见：Uzbas F,Sezerman U,Hartl L,Kubicek CP,Seiboth B,2012.A homologous production system for Trichoderma reesei secreted proteins in a cellulase-free background.Applied Microbiology and Biotechnology 93,1601-1608.)，切胶回收后纯化线性化质粒；利用In-Fusion HD Cloning Kit将终止子与线性化质粒融合，转入E.coli DH5α中，提取质粒，得到新的质粒pPcdna1-ter。

收集新鲜培养的SQR-T037的菌丝，液氮研磨后，提取RNA，反转录后制备成cDNA。引物Infu-nox-fw(SEQ ID NO.4)和infu-nox-rev(SEQ ID NO.5)从SQR-T037 cDNA中扩增nox1的cDNA，内切酶ClaI酶切pPcdna1-ter，切胶回收后纯化线性化质粒，利用In-Fusion HD Cloning Kit将nox1的cDNA片段插入质粒pPcdna1-ter的ClaI位点，转入E.coli DH5α中，其他质粒，得到重组质粒pPcdna1-nox1-hyg(图2-2)，PEG-CaCl₂介导转化野生型，获得20株转化子。

2)分别随机挑选6个阳性转化子，PCR验证nox1表达cassette插入基因组中(图4)；根据Real-Time PCR验证过量表达nox1的6株突变子的nox1表达水平，nox1OE4转录水平最高，选取为工程菌株，并命名为SQR-NOX1-4(图4)；

3)比较SQR-NOX1-4与野生型重寄生尖孢镰刀菌、齐整小核菌、核盘菌和交链格孢菌的能力差异，确定工程菌SQR-NOX1-4菌丝能够产生更多的H₂O₂(图5)，有更强的重寄生病原真菌能力(图6)。

3.木霉工程菌提高生防黄瓜病害的效果验证

1)以双元载体pCAMBIA1300(NCBI登录号：AF234296.1)为新建载体的框架，从质粒pAN7-1(NCBI登录号：Z32698.1)扩增4kb片段，包括潮霉素抗性基因(hph)、曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(gpdA)和色氨酸转录终止子(trpC)，添加XhoI和HindIII酶切位点，与XhoI和HindIII酶切预酶切的pCAMBIA1300酶连，得到载体pCAMBIA-hph。扩增质粒，引入ApaI酶切位点；从质粒pgGFP(以色列Tel Aviv大学A.Sharon教授提供，PgGFP质粒的图谱或构建方法已经公开发表，详见：Maor R,Puyesky M,Horwitz BA,Sharon A,1998.Use of green fluorescent protein(GFP)for studying development and fungal-plant interaction in Cochliobolus heterostrophus.Mycological Research 102,491-496.)扩增gfp序列，并连有ApaI酶切位点，T4连接酶连接两片段，得到载体pCAMBIA-gfp。

2)通过农杆菌EHA105转化尖孢镰刀菌黄瓜转化型(Fusarium.oxysporum f sp.cucumerinum J.H.Owen,FOC)，获得还有绿色荧光蛋白标记的FOCgfp；

3)大棚温室培养条件下，探究SQR-NOX1-4和野生型SQR-T037对FOCgfp的抑制效果，根据gfp序列荧光定量PCR确定FOC的数量，并确定SQR-NOX1-4的生防效果。取20kg沙性土壤(有机质7.43mg/kg、碱解N 35.9mg/kg、有效磷88.75mg/kg、有效钾165.02mg/kg；pH 5.63)，和数目约为10¹⁰的SQR-Nox1-4和野生型SQR-T037孢子以及0.4kg商业有机肥(碱解N 6.27％W/W、有效磷4.71％W/W、有效钾10.01％W/W)预混，之后与土壤混合，接种同一大小的黄瓜幼苗，25-32℃温室培育，1周后接种数目约为10¹⁰的FOCgfp孢子。以未接种木霉的有机肥处理为对照，每个处理10株，重复三次。2个月后记录发病率，并取根际土，提取DNA，荧光qPCR定量检测根际土的病原菌的数量，结果以gfp基因在每克土中的拷贝数计，即gfp copies·g^-1root；

4)结果显示，跟踪黄瓜2个月的生长指标，结果表明接种SQR-NOX1-4和SQR-T037，尖孢镰刀菌FOC的数量显著降低，其中接种SQR-NOX1-4后，FOC的数量为1.18copies·g^-1soil，差异显著，且黄瓜的发病率平均值为23.33％。

表1工程菌株SQR-NOX1-4和SQR-T037对黄瓜植株的影响

注：数值间包含同一字母表示差异不显著(p<0.05)。