本发明涉及一种新的苯基噻唑类TRPC6离子通道的抑制剂及其制备方法，以及在制备胃癌治疗相关药物中的应用，属于药物化学领域。
背景技术：
胃癌的发病率在恶性肿瘤中排列第2位，仅次于肺癌，是消化道常见的恶性肿瘤，全世界每年有超过60万人死亡。近年来关于胃癌的治疗方式取得了较大进展，有包括手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗和中医药治疗等在内的各种方法。但胃癌的具体发病机制并不清楚，近年来发现钙离子通道与肿瘤密切相关。胞内钙离子参与许多生命活动过程，如细胞的收缩、代谢、分泌和分化等。
瞬时受体电位(Transient receptorpotential,TRP)广泛存在于细胞膜上，是一种非选择性的阳离子通道蛋白，具有调节感觉传导、参与细胞信号传递及调节发育等重要作用，TRP通道蛋白是一个庞大的家族，分为TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML 6个亚家族，TRPC通道可以分为TRPC1-7共七种亚型，根据氨基酸序列的同源性，可以分为四种亚类：TRPC1、TRPC2、TRPC4/5、TRPC3/6/7。
TRPC6是TRPC家族中选择性最强的通道蛋白，TRPC6基因在许多组织细胞中可以编码一些构成钙库操纵性通道(store operated channels，SOC)的亚单位，生长因子刺激细胞产生二酰甘油和三磷酸肌醇，这两种重要的第二信使激活TRPC6，通过特定的酪氨酸/丝氨酸磷酸化诱导肌质网释放钙离子，或通过促进肌纤维膜钙离子从SOC内流而增加细胞质内钙离子浓度。当因TRPC6过表达或基因突变引起钙离子内流增加时，往往造成细胞中脂类与蛋白质的合成紊乱，进而引起细胞的恶性增殖，导致多种疾病的发生。
技术实现要素：
本发明为解决现有技术中存在的技术问题，提供一种苯基噻唑类化合物，以及它们的制备方法和在胃癌治疗相关药物中的应用。
本发明的研究发现，TRPC6在人胃癌细胞中过度表达，在AGS和MKN45胃癌细胞中加入TRPC通道抑制剂SKF96365，能诱导癌细胞阻滞在G2/M期，抑制胃癌细胞增殖。对无TRPC6通道的突变癌细胞也会停留在G2/M期，细胞增殖也会受到抑制。此外，通过抑制TRPC6通道活性，在裸鼠移植的人胃癌移植瘤的生长也会受到显著抑制。综上所述，TRPC6可作为胃癌临床治疗新靶点，开发出针对TRPC6基因表达及通道功能的新的抗肿瘤药物， 将为胃癌的临床治疗提供新途径。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种苯基噻唑衍生物，具有通式(1)所示的结构：
其中：
n为1-4之间的整数；
R1、R2、R3、R4分别选自氢、卤素、烷基、烷氧基、芳基、氨基、烷基氨基、硝基或羟基，并且R1、R2、R3、R4不得同时为氢；
X选自C或N；
R5选自氢、甲基、乙基；
R6、R7、R8分别选自氢、卤素、硝基或烷基；
R9选自其中，R10、R11分别选自氢、烷基、芳基、环烷基、烷氧羰基或酯基，m为0-4之间的整数。
优选的，具有通式(1)所示结构化合物为，
一种制备所述的苯基噻唑化合物的方法，反应路线如下：
制备方案如下：
一种制备所述的苯基噻唑化合物的方法，参与制备的化合物包括，
化合物(2)，结构式为
化合物(3)，结构式为
化合物(4)，结构式为
化合物(5)，结构式为
化合物(6)，结构式为
以及反应物R9H；
其中，n、R1、R2、R3、R4、X、R5、R6、R7、R8、R9的定义如前所述；
具体步骤如下，
步骤a：取化合物(2)、化合物(3)，同时取HOBT和HBTU，然后惰性气体保护下加 入重蒸的DMF，室温下搅拌30min，加入DIPEA，反应4-6h，反应结束后进行提纯，即得到化合物(4)；
步骤b：取化合物(4)，加重蒸的DMF溶解，加入和K2CO3，50℃搅拌反应8-12h，反应结束后进行提纯，即得到化合物(5)；
步骤c：取化合物(5)，加DMSO溶解，加入IBX，室温搅拌3-5h，反应结束后进行提纯，即得到化合物(6)；
步骤d：取化合物(6)，加DMF和MeOH溶解，DMF和MeOH的加入量为体积比1:1，然后加入R9H，室温搅拌10-20min后加入NaBH3CN，室温搅拌反应18-24h，其中，所述的化合物(6)与R9H、NaBH3CN的摩尔比为1:5:3，最后反应结束后进行提纯，即得到具有通式(1)所示结构的化合物。
所述的结构式(1)的一种苯基噻唑衍生物及其优选的化合物在制备作为TRPC6抑制剂用于胃癌治疗药物中的应用。
本发明在长期充实胃癌药物研究与开发的基础上，以TRPC6为靶标筛选大量化合物，得到了具有显著TRPC6抑制活性和胃癌细胞抑制活性的苯基噻唑类化合物
本发明通过实验发现，通式(1)化合物是优秀的TRPC6通道抑制剂，具有合成方法简单，对胃癌细胞抑制活性良好等优点，可用于治疗因TRPC6表达异常而引起的胃癌。
具体实施方式
下面，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
化合物1a的合成与表征：
取化合物(2a)1.1g(5.18mmol)，化合物(3a)0.84g(5.18mmol)，HOBT 2.09g(15.5mmol)，HBTU 5.87g(15.5mmol)加入100ml圆底烧瓶，氮气保护下加入重蒸的DMF 40ml，加入 DIPEA 8.1ml(46.6mmol)，室温下搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯200ml稀释，用水(50ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(4a)1.46g，产率78％。
取化合物(4a)0.9g(2.57mmol)，碳酸钾1.06g(7.11mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入25ml重蒸的DMF，缓慢滴加碘乙醇0.6ml(7.11mmol)，50℃搅拌反应12h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得淡黄色色固体(5a)0.65g，产率64％。
取化合物(5a)0.61g(1.74mmol)，IBX 0.97g(3.49mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO溶解，室温搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(6a)0.5g，产率83％。
取化合物(6a)0.08g(0.23mmol)于10ml圆底烧瓶，加入DMF/MeOH混合液(v/v 1:1)4ml，加入四氢吡咯0.094g(1.15mmol)，室温搅拌30min，加入NaBH3CN 0.043g(0.69mmol)，室温搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸出去MeOH，用乙酸乙酯10ml稀释，用水(3ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体1a 0.043g，产率53％。
化合物1a结构测定数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.59(s,1H),7.54(s,1H),7.39(s,1H),7.35(s,1H),6.98(s,1H),3.85(s,3H),2.95(s,2H),2.60(s,4H),1.81(s,4H). 13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.93,159.67,153.29,145.59,145.01,142.81,139.58,134.68,130.15,127.82,125.22,121.52,106.21,56.12,53.62,45.41,23.27.
实施例2：
化合物1b的合成与表征：
取化合物(2b)1.73g(6mmol)，化合物(3b)1.33g(6mmol)，HOBT 2.43g(18mmol)，HBTU 6.83g(18mmol)加入100ml圆底烧瓶，氮气保护下加入重蒸的DMF 40ml，加入DIPEA 8.92ml(54mmol)，室温下搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯200ml稀释，用水(50ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(4b)2.21g，产率75％。
取化合物(4b)1.47g(3mmol)，碳酸钾1.24g(9mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入25ml重蒸的DMF，缓慢滴加碘乙醇0.7ml(9mmol)，50℃搅拌反应8-12h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得淡黄色色固体(5b)1.08g，产率67％。
取化合物(5b)0.8g(1.5mmol)，IBX 0.84g(3mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO溶解，室温搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(6b)0.64g，产率79％。
取化合物(6b)0.16g(0.3mmol)于25ml圆底烧瓶，加入DMF/MeOH混合液(v/v 1:1)10ml，加入二丙胺0.2ml(1.5mmol)，室温搅拌30min，加入NaBH3CN 0.056g(0.9mmol)，室温搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸出去MeOH，用乙酸乙酯20ml稀释，用水(3ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体1b 0.089g，产率49％。
化合物1b结构测定数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(dd,J＝2.0,1.0Hz,1H),7.90(s,1H),7.22(d,J＝7.5Hz,1H),3.90(s,3H),3.73(t,J＝7.2Hz,2H),2.96(t,J＝7.2Hz,2H),2.55(s,3H),2.53–2.45(m,7H),1.57(qt,J＝8.0,5.3Hz,4H),0.92(t,J＝8.1Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.25,157.64,150.65,138.00,137.46,136.90,129.80,128.84,128.81,126.74,126.71,125.64,124.90,124.64,123.49,121.04,120.42,113.33,113.30,107.74,57.46,56.07,52.56,45.41,20.39,14.28,13.36,11.47.
实施例3：
化合物1c的合成与表征：
取化合物(2c)1.68g(6mmol)，化合物(3c)0.85g(6mmol)，HOBT 2.43g(18mmol)，HBTU 6.83g(18mmol)加入100ml圆底烧瓶，氮气保护下加入重蒸的DMF 40ml，加入DIPEA8.92ml(54mmol)，室温下搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯200ml稀释，用水(50ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(4c)1.77g，产率73％。
取化合物(4c)1.21g(3mmol)，碳酸钾1.24g(9mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入25ml重蒸的DMF，缓慢滴加碘丙醇0.86ml(9mmol)，50℃搅拌反应12h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯(EA)100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得淡黄色色固体(5c)0.96g，产率69％。
取化合物(5c)0.69g(1.5mmol)，IBX 0.84g(3mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO溶解，室温搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(6c)0.5g，产率73％。
取化合物(6c)0.14g(0.3mmol)于25ml圆底烧瓶，加入DMF/MeOH混合液(v/v 1:1)10ml，加入盐酸二甲胺0.12g(1.5mmol)，室温搅拌30min，加入NaBH3CN 0.056g(0.9mmol)，室温搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸出去MeOH，用乙酸乙酯20ml稀释，用水(3ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体1c 0.079g，产率54％。
化合物1c结构测定数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(s,1H),4.67(t,J＝7.6Hz,1H),3.90(s,3H),3.84(s,2H),2.59(t,J＝7.6Hz,1H),2.51(s,2H),2.46(s,2H),2.30(s,3H),2.18(p,J＝7.6Hz,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.93,151.88,150.14,145.35,143.85,142.40,141.98,134.21,129.95,126.58,121.70,110.36,60.68,56.26,55.58,44.85,41.75,26.12,16.05,13.00.
实施例4：
化合物1d的合成与表征：
取化合物(2d)2.04g(6mmol)，化合物(3d)1.21g(6mmol)，HOBT 2.43g(18mmol)，HBTU 6.83g(18mmol)加入100ml圆底烧瓶，氮气保护下加入重蒸的DMF 40ml，加入DIPEA8.92ml(54mmol)，室温下搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯200ml稀释，用水(50ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(4d)2.13g，产率68％。
取化合物(4d)1.57g(3mmol)，碳酸钾1.24g(9mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入25ml重蒸的DMF，缓慢滴加碘乙醇0.7ml(9mmol)，50℃搅拌反应12h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得淡黄色色固体(5d)1.11g，产率65％。
取化合物(5d)0.85g(1.5mmol)，IBX 0.84g(3mmol)加入50ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO溶解，室温搅拌4h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯100ml稀释，用水(25ml×4)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体(6d)0.63g，产率74％。
取化合物(6d)0.17g(0.3mmol)于25ml圆底烧瓶，加入DMF/MeOH混合液(v/v 1:1)10ml，加入N-甲基哌嗪0.17ml(1.5mmol)，室温搅拌30min，加入NaBH3CN 0.056g(0.9mmol)，室温搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸出去MeOH，用乙酸乙酯20ml稀释，用水(3ml×5)洗涤除去DMF，有机相用无水Na2SO4干燥1h，过滤，滤液旋干过柱得白色固体1d 0.11g，产率56％。
化合物1d结构测定数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(s,1H),7.41–7.35(m,2H),7.04–6.94(m,4H),3.73(t,J＝7.3Hz,2H),2.97(d,J＝10.5Hz,5H),2.90(s,3H),2.71(q,J＝8.0Hz,2H),2.59(q,J＝8.0Hz,2H),2.32–2.22(m,7H),2.11(t,J＝5.2Hz,4H),1.28(dt,J＝20.2,8.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.25,155.90,153.65,149.09,146.75,146.20,140.21,138.37,135.80,133.49,132.60,129.59,125.77,123.21,122.69,122.30,120.05,118.80,55.76,54.93,52.30,45.41,45.27,43.87,24.27,20.75,14.56,12.98.
实施例5苯基噻唑类衍生物的TRPC6通道抑制实验
将稳定表达TRPC6的HEK293细胞以4×104/孔接种于96孔板中，在37℃温度下CO2培养箱孵育培养过夜，待细胞长满后去除细胞培养液，加入Fluo-4(AM)(50μL,2μM)，37℃避光孵育一个小时，让荧光染料充分进入细胞。化合物和DAMGO均用HBSS配置，设8个梯度浓度组，化合物板每孔加入80μL不同浓度的待测化合物，设一组不含化合物的做阴性对照。随后吸掉Fluo-4(AM)，用HBSS洗3次除去胞外残余的Fluo-4(AM)，再加入80μL的HBSS，然后把细胞板和化合物板放入FDSS/μCELL药物筛选系统，检测在480nm激发光和540nm发射光下的荧光强度的变化。实验开始前，先检测30s内的荧光变化，然后仪器自动向细胞板每孔中加入20μL的化合物，再检测120秒钟，再每孔加入DAMGO(20μL,1μM)进行刺激，测试180s。
化合物的TRPC6通道抑制活性数据如下：
实施例6MTT法观察化合物1a、1b、1c、1d对胃癌细胞的生长抑制作用
取生长状态良好的AGS、MKN45胃癌细胞，加入完全培养基吹打成为均匀的单细胞悬液，调整细胞浓度成3×104个/mL，以100μL/孔的体积接种于96孔细胞培养板中。24h后分别加入10个浓度梯度的1a、1b、1c、1d处理，每种化合物每个浓度设3个平行孔，每孔加入带化合物培养基体积为100μL。药物作用72h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液。孵育2h后弃去含MTT的培养基，每孔加入150μL DMSO溶解沉淀，充分震荡，使紫色结晶完全溶解，于570nm处测定吸光度值A，根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率，细胞存活率＝实验组OD/对照组OD×100％。并计算IC50值。
化合物胃癌细胞抑制活性数据如下：
研究结果显示，所测试的化合物1a、1b、1c、1d对AGS和MKN45胃癌细胞均具有明显的生长抑制活性，其半数抑制浓度均在5.0-18.0μM。