本发明涉及一种凝血酶Xa因子抑制剂的制备方法。尤其涉及一种贝曲西班及其类似物的制备方法。
背景技术：
控制流血的止血是通过手术手段或通过血管收缩和凝固的生理学性质发生。血小板和凝血两者都参与恢复止血和血栓形成疾病，凝固级联的某些组分主要负责参与为血栓形成和止血中的主要事件的血小板凝集和纤维蛋白沉积的过程的增强和加速。
凝块形成包括使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，纤维蛋白聚合成网状物以在损伤后恢复止血。类似过程在血栓形成疾病中导致血管阻塞。纤维蛋白原转化成纤维蛋白是由凝血级联中的一系列反应的最终产物凝血酶催化。凝血酶也是活化血小板，从而在动脉和静脉血液流动的条件下促使血栓形成的关键参与者。出于这些原因，已经假设凝血酶的高效调控能达成血栓形成的高效调控。若干类目前使用的抗凝剂直接或间接影响凝血酶(即，未分段肝素、低分子量肝素、肝素样化合物、五糖和华法林(warfarin))。直接或间接抑制凝血酶活性也是临床发展中各种抗凝剂的焦点(艾瑞克森(Eriksson)和奎兰(Quinlan)，药物(Drugs)11：1411-1429，2006综述)。
凝血酶的前体凝血酶原由因子Xa转化为活性酶。组织因子/因子VIIa介导的因子Xa产生的局部活化是由因子IXa/因子VIIIa复合物增强且使得凝血酶原酶装配于活化血小板上。作为凝血酶原酶复合物的一部分的因子Xa是负责血管系统中持续凝血酶形成的唯一酶。不同于作用于各种包括纤维蛋白原和PAR受体的蛋白质底物的凝血酶，因子Xa似乎具有单一生理学底物，即凝血酶原。因为一个因子Xa分子可能能够产生超过1000个凝血酶分子(曼恩(Mann)等人，血栓形成和止血杂志(J.Thrombosis.Haemostasis)1：1504-1514，2003)，所以直接抑制因子Xa作为间接抑制凝血酶形成的方式可能是高效的抗凝策略。诸如因子VIIa、因子IXa或因子Xa等活化蛋白酶自身具有较差的蛋白分解活性。然而，其装配成辅因子相关的膜结合型复合物会显著增强其催化效率。因子Xa的这一作用最为显著，其中效率增加105倍(曼恩(Mann)等人，血液(Blood)76(1)：1-16，1990)。由于血液中所存在的酶原浓度较高(1.4μM凝血酶原对比150nM因子X)和活化动力学，因此需要抑制量少于凝血酶的因子Xa以实现抗凝作用。与凝血酶相比因子Xa作为治疗标靶的优越性的假设的间接证明也可见于预防深静脉血栓形成的临床试验中。因此，已经表明选择性抑制因子Xa的化合物可适用作活体外诊断剂或适用于在某些血栓形成病症中治疗性投药，例如参看WO94/13693。
已经以源自食血生物体的多肽以及不为大多肽型抑制剂的化合物的形式报导若干因子Xa抑制剂。其它因子Xa抑制剂包括诸如具有脒基取代基的含氮杂环化合物等小分子有机化合物，其中化合物的两个官能团可在两个其活性位点处与因子Xa结合。。
因子Xa抑制剂包括具有包含经由酰胺键连接的苯基-脒基、苯基和卤基-苯基的结构的抑制剂(美国专利第6,844,367B1号)。其它因子Xa抑制剂已经用卤基-吡啶基置换卤基-苯基(参考美国专利第6,376,515B和6,835,739B2号)。美国专利第6,376,515B2号揭示实例206中所鉴别的特异性因子Xa抑制剂化合物，这一化合物也在美国专利第6,835,739B2号中以实例206揭示且在本文中鉴别为式I化合物。式I化合物由如下结构表示：
贝曲西班(Betrixaban)，结构如式I,化学名[2-({4-[(二甲基氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺，是一口服长效凝血酶Xa因子抑制剂，可选择性抑制Xa因子，延长凝血时间，减少凝血酶生成而达到抗血栓作用，与常用药物及食物间的相互作用很小，无需调整剂量和用药监控，应用于内科入院患者深静脉血栓(VTE)的急性预防。贝曲西班也是唯一一个大部分通过胆汁排泄(肾脏排泄＜5％)的新型抗凝剂，尤其适用于肾衰患者，仅严重肾损伤患者可能需调整剂量。
贝曲西班(Betrixaban)是由波多拉制药公司(Portola)于2004年8月从米伦纽姆医药公司处获得授权开发。2012年3月，波多拉制药公司在美国启动用于内科入院患者深静脉血栓(VTE)的急性预防的Ⅲ期临床研究，目前临床研究正在美国、欧洲多个地区开展。
鉴于贝曲西班在治疗血栓形成疾病中的实用性，因此对优化贝曲西班的合成方法以利于实现生产工业化规模放大存在需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种制备贝曲西班游离碱或其类似物的方法。该方法也包括制备贝曲西班游离碱的中间体化合物。
本发明提供一种改进的式I化合物或其类似物的合成方法，大大减少/避免杂质的产生，原料易得且便宜，易操作，条件温和而后处理废液少，因此，在工业化放大规模生产方面，本发明的方法更加容易推广和接受。
本发明的目的还在于提供一种贝曲西班游离碱或其盐，它们的医药组合物，及用途。一方面，在一个实施方案中，本发明提供制备贝曲西班游离碱(式I)化合物或其类似物的合成方法，
其包含：
在格氏试剂存在下，使式D化合物或其盐反应得到贝曲西班游离碱(式I),
所述D化合物为：
所述格氏试剂为RMgX，其中R选自C1～C5直链或支链的烷烃基、C2～C10直链或支链的烯烃基、取代的或未取代的芳基。
X选自卤素；
进一步，R选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、异丙烯基、苯基、苄基；
优选地，R选自甲基、异丙基；
进一步，X选自氟、氯、溴、碘；
优选地，X选自氯、溴；
优选地，所述格氏试剂为甲基氯化镁、甲基溴化镁、异丙基氯化镁、、异丙基溴化镁。
本发明所述方法中，在反应温度下，向式D化合物或其盐和胺的溶剂混合物中加入格氏试剂的溶剂溶液，搅拌0.5～3小时后，加入水淬灭反应，过滤，洗涤得贝曲西班游离碱(式I)或其类似物。
其中，所述胺为二烷基胺，例如二甲胺、二乙胺、二丙胺，二异丙胺，甲基乙基胺。
其中，所述溶剂选自非质子性溶剂；进一步地，非质子性溶剂选自四氢呋喃、乙醚、二噁烷、己烷、甲基叔丁基醚、庚烷、环己烷中的一种或多种的混合物。更进一步地，非质子性溶剂选自四氢呋喃；
所述反应温度为-15～25℃；优选地，所述反应温度为-10～0℃。
在另一个实施方案中，本发明提供制备贝曲西班游离碱(式I)关键中间体(式D)或其盐的合成方法，
其包括，将式A化合物暴露于反应条件下以形成所述式D化合物或其盐。
所述A化合物为：
所述反应条件包含：
在碱性试剂存在下，使式A化合物与式B化合物接触反应以形成式D化合物或其盐；
优选地，式A化合物:式B化合物:碱性试剂(物质的量比)为1:1.05:0.4；
所述式B化合物为：
其中，所述碱性试剂为有机碱试剂、无机碱试剂；
优选地，所述有机碱试剂选自三乙胺、哌啶、吡啶、叔丁醇钾、叔丁醇钠，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、碳酸钾、碳酸钠；
更优选地，所述碱性试剂为三乙胺、吡啶；
所述反应为在反应温度下，将式A化合物、吡啶溶于有机溶剂中，加入式B化合物后反应2～5小时；
其中，式A化合物与有机溶剂的重量体积比(克/毫升)为1:7～1:10；式A化合物与碳酸钠饱和水溶液的重量体积比(克/毫升)为1:3～1:5；
优选地，式A化合物与有机溶剂的重量体积比(克/毫升)为1:8，式A化合物与碳酸钠饱和水溶液的重量体积比(克/毫升)为1:3.5；
所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、N,N二甲基甲酰胺、N,N二甲基乙酰胺、甲基四氢呋喃、二氧六环或其一种或多种的混合物；
优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃；
所述反应温度为15～35℃；优选反应温度为20～30℃；
优选地，本发明所述的方法中，还进一步包括向反应体系中加入碳酸钠饱和水溶液，调PH值为8～11，搅拌1～2小时后抽滤，洗涤干燥后得到式D化合物；
更优选地，PH值为9～10。
另一方面，本发明提供制备贝曲西班游离碱(式I)化合物或其类似物的方法，其包含：
a)在碱性试剂存在下，使式A化合物与式B化合物接触反应以形成式D化合物或其盐。
优选地，式A化合物:式B化合物:碱性试剂(物质的量比)为1:1.05:0.4；
所述碱性试剂为有机碱试剂、无机碱试剂；
优选地，所述有机碱试剂选自三乙胺、哌啶、吡啶、叔丁醇钾、叔丁醇钠，所述无机碱选自氢化钠、碳酸钾、碳酸钠；
更优选地，所述有机碱性试剂为吡啶；
所述反应为在反应温度下，将式A化合物、吡啶溶于有机溶剂中，加入式B化合物后反应2～5小时；
本发明的方法中，式A化合物与有机溶剂的重量体积比(克/毫升)为1:7～1:10；
本发明的方法中，式A化合物与碳酸钠饱和水溶液的重量体积比(克/毫升)为1:3～1:5；
优选地，式A化合物与有机溶剂的重量体积比(克/毫升)为1:8；
优选地，式A化合物与碳酸钠饱和水溶液的重量体积比(克/毫升)为1:3.5；
所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、N,N二甲基甲酰胺、N,N二甲基乙酰胺、甲基四氢呋喃、二氧六环或其一种或多种的混合物；
优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃；
所述反应温度为15～35℃；优选反应温度为20～30℃；
优选地，所述反应还进一步包括后处理，后处理包括：向反应体系中加入碳酸钠饱和水溶液，调PH值为8～11，搅拌1～2小时后抽滤，洗涤干燥后得到式D化合物；优选地，PH值为9～10；
b)在格氏试剂存在下，使式D化合物或其盐反应得到贝曲西班游离碱(式I)：
所述格氏试剂为RMgX，其中R选自C1～C5直链或支链的烷烃基、C2～C10直链或支链的烯烃基、取代或未取代的芳基。
X选自卤素；
进一步，R选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、异丙烯基、苯基、苄基；
优选地，R选自甲基、异丙基；
进一步，X选自氟、氯、溴、碘；
优选地，X选自氯、溴；
进一步优选地，所述格氏试剂为甲基氯化镁、甲基溴化镁、异丙基氯化镁、异丙基溴化镁。
所述反应为：反应温度下，向式D化合物或其盐和胺的溶剂混合物中加入格氏试剂的溶剂溶液，搅拌0.5～3小时后，加入水淬灭反应，过滤，溶剂洗涤得贝曲西班游离碱(式I)。
其中，所述溶剂选自非质子性溶剂；进一步地，非质子性溶剂选自四氢呋喃、乙醚、二噁烷、己烷、甲基叔丁基醚、庚烷、环己烷中的一种或多种的混合物。更进一步地，非质子性溶剂选自四氢呋喃；
其中，所述胺为二烷基胺，例如二甲胺、二乙胺、二丙胺，二异丙胺，甲基乙基胺；所述反应温度为-15～25℃；优选地，所述反应温度为-10～0℃。
另一方面，本发明提供一种上述方法制备得到的贝曲西班游离碱(式I)化合物或其类似物。
另一方面，本发明还提供一种采用上述贝曲西班游离碱(式I)化合物制备贝曲西班药用盐的方法，及其制备得到的贝曲西班药用盐。
另一方面，本发明还提供一种上述贝曲西班游离碱或其药用盐在预防或治疗哺乳动物中以不期望的血栓形成为特征的症状中的用途。
另一方面，本发明还提供一种包含上述贝曲西班游离碱或其药用盐的药物组合物，特别是用于预防或治疗哺乳动物中以不期望的血栓形成为特征的药物组合物。
具体实施方式
如背景技术所论述，式I化合物是贝曲西班游离碱，是有效的Xa抑制剂。本发明包括式I化合物的改良合成方法。
1.定义
如本说明书和权利要求书中所使用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式"一"和"所述"包括多个提及物。
如本文中所使用，术语"包含"指方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。
如本文中所使用，术语"C1～C5直链或支链"是指具有1到5个碳原子且碳原子以直链或含有支链的形式连接，"C2～C10直链或支链"是指具有2到10个碳原子且碳原子以直链或含有支链的形式连接。
如本文中所使用，术语"接触"是指使两种或两种以上化学分子靠近以使这两种或两种以上化学分子之间可发生反应。举例来说，接触可包含混合和连续混合化学物质。接触可通过将两种或两种以上化学物质完全或部分溶解或悬浮于一种或一种以上溶剂中、将一种于溶剂中的化学物质与另一种固相或气相的化学物质混合或混合两种或两种以上固体化学物质或所属领域的技术人员通常已知的其它方法来进行。
如本文中所使用，术语"反应条件"是指进行化学反应时所处的详细情况。反应条件的实例包括但不限于一个或一个以上以下因素:反应温度、溶剂、pH值、压力、反应时间、反应物的摩尔比、碱或酸的存在或催化剂等。反应条件可以按照使用这些条件的特定化学反应命名，诸如偶合条件、氢化条件、酰化条件、还原条件、盐形成条件等。己知反应的反应条件通常为所属领域的技术人员所知。
如本文中所使用的，术语“药用盐”是指衍生自各种生理上可接受的有机和无机抗衡离子的化合物盐。该抗衡离子是本领域所熟知的且作为实例包括当分子含有酸性官能团时的钠、钾、钙、镁、铝、锂和例如四烷基铵的铵等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐等。当作为制备生理学上可接受的盐的有用中间体和/或用于例如体外的非治疗状况时，具有非生理学上可接受阴离子或阳离子的盐也在本发明的范围内。
如本文中所使用，术语"转化率"是指参与反应了的物质的量与原本的物质总量的百分比。
当在化合物前使用术语“基本上不含”时表示包含少于0.7％、或少于0.15％、或少于0.1％、或少于0.04％、或少于0.03％的该化合物。
2.化合物制备方法
本发明提供了以高纯度制备贝曲西班的利于实现生产工业化规模放大的方法，该方法纯度高、杂质少、成本低、操作方便。
制备贝曲西班的方法已在美国专利US 6,376,515中被公开，化合物B与化合物J在碱诸如吡啶以及溶剂诸如二氯甲烷的存在下反应生成步骤A中的化合物K。在步骤B中，化合物K随即通过两步方法转化成贝曲西班，所述方法包括在高腐蚀性HCl气体饱和的甲醇中将化合物K转化成亚氨酸酯(imidate)中间体，并使经干燥的亚氨酸酯中间体与二甲胺在甲醇中在回流条件下反应获得贝曲西班。该方法包括使用腐蚀性化学试剂以及苛刻的条件。
WO2008/057972描述利用使用二甲基氨基锂(由二甲胺和己基锂反应形成)的一步方法代替美国专利US 6,376,515中的两步方法以将化合物K转化成贝曲西班。但是，WO2008/057972的方法仍然存在以下缺点：
(1)采用大容量的溶剂和易燃易爆的危险的二甲基氨基锂(由二甲胺和己基锂反应形成)，使操作难度增大，尤其二甲基氨基锂(由二甲胺和己基锂反应形成)需在氮气保护下进行投料操作和物料转移，使用设备较多，合成工艺条件严苛，不利于工业生产的规模化放大；
(2)该方法的制备过程中不可避免的会产生单甲基化和脱卤的副产物(式E和式F)且不易纯化除去；
(3)该方法的后处理需使用大量的水去除锂盐，产生大量锂盐废液不易处理，不利于绿色环保的合成的工业放大。
WO2011/084519中公开了一种采用化合物C和化合物D，在酰胺偶联试剂中接触反应生成贝曲西班或其盐，该方法不使用二甲基氨基锂(由二甲胺和己基锂反应形成)试剂，但是该方法用以工业化放大仍然存在难以接受的缺陷在于，该方法使用的化合物C原料不易制备得到，购买价格昂贵，并且化合物C还存在自我缩合的可能性，性质不稳定不易保存，因此，采用该方法以实现贝曲沙班或其盐的工业化放大规模生产仍然不被推广和广泛接受。
基于以上发现，本发明提供一种改进的式I化合物的合成方法，采用格式试剂制备得到贝曲西班游离碱化合物(I)，所述试剂具有良好的反应活性和选择性，大大减少/避免杂质的产生，尤其是单甲胺脒基杂质(式E)、脱氯杂质(式F)的产生。原料易得且便宜，易操作，条件温和而后处理废液少，因此，在工业化放大规模生产方面，本发明的方法更加容易推广和接受。
合成式I化合物
本发明提供一种改进的式I化合物的合成方法，其中所述改进是使用较温和的条件和(或)得到较高的产率和(或)较少的副产物(杂质)。较温和的条件包括较易操作的温度、较少量试剂或溶剂、较少或较易操作的步骤、使用易燃易爆等级较低的试剂、后处理产生较少或不产生三废(废气、废水、废渣)。
改进的式I化合物的合成方法包括如下步骤：
1)加入式D化合物或其盐和二甲胺的四氢呋喃溶液，搅拌降温至-10℃。
2)-10-0℃下滴加镁格氏试剂的四氢呋喃溶液。滴加完后，-10～0℃反应30分钟。
3)加入水淬灭反应后，过滤，滤饼加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂搅拌后过滤，滤液浓缩除去溶剂得粗品式I化合物，
4)粗品用四氢呋喃洗涤纯化得式I化合物。
所述式D化合物为：
所述式I化合物为：
式I化合物是贝曲西班游离碱化合物，其中式I化合物的二甲脒基的合成是贝曲西班制备的关键步骤。
本发明所涉及的式I的二甲脒基的合成方法，以镁格氏试剂实现二甲脒基的合成。相比于现有技术有以下优点：镁格氏试剂价格低廉；相对于易燃易爆的有机锂试剂，镁格氏试剂相对温和、易燃易爆等级低，可实现大规模生产的工业化；后处理使用水直接淬灭后，过滤即可除去镁格氏试剂反应后的镁杂质，操作工艺简洁，产生的三废较少；综上所述，本发明的式I的制备方法原料易得，价格低廉，条件温和、工艺简洁、经济环保更适合工业的大规模生产，有利于实现合成贝曲西班的绿色环保的工业放大。
在一个实施例中，本发明提供了式I化合物合成方法中格氏试剂优选为异丙基氯化镁。
在另一个实施例中，本发明提供了式I化合物合成方法中格氏试剂优选为甲基氯化镁。
在一个实施例中，本发明提供了式I化合物合成方法中温度优选为-10～0℃。
表1
如表1所示，采用镁格氏试剂转化率可达到99％以上，不产生脱氯杂质。单甲胺脒基(式E)的杂质最少可控制为小于0.08％。如上证明，本发明使用较温和的格氏试剂使反应的定向转化成式I化合物转化率达到99％以上，并且避免脱氯杂质(式F)的生成，大大减少单甲胺脒基的杂质生成。
合成式D化合物或盐
本发明提供一种改进的式D化合物或其盐的合成方法，其中所述改进是使用较温和的条件和(或)较高的产率和(或)较少的副产物(杂质)。较温和的条件包括较易操作的温度、较少量反应试剂、较少量溶剂、较少或较易操作(包含反应投料操作和后处理操作)的步骤、使用易燃易爆等级较低的试剂。
改进的式D或其盐的合成方法包括如下步骤：
1)15-35℃下，式A化合物溶于四氢呋喃中，式A化合物与四氢呋喃的重量体积比(g/mL)为1:5。
2)向1)体系中加入碱试剂，搅拌均匀。
3)式B溶于四氢呋喃中，式B与四氢呋喃的重量体积比(g/mL)为1:3，15-35℃下滴入上述反应液中。保持15～35℃温度反应2～5小时。
4)优选地，向体系中滴加碳酸钠饱和水溶液，调PH值为9-10，搅拌1～2小时后抽滤，滤饼依次用水和有机溶剂淋洗后干燥得到式D化合物。式A化合物与碳酸钠饱和水溶液的重量体积比(g/mL)为1:3.5。
所述式A化合物为：
所述式B化合物为：
式D化合物或其盐是制备贝曲西班游离碱化合物的关键中间体。
本发明所涉及的式D化合物合成方法优化方法为：
A.投料比的优化：
采用优化后的碱为吡啶，采用优化后的溶剂四氢呋喃(8.0vol)，2-氨基-N-(5-氯吡啶-2-基)-5-甲氧基苯甲酰胺(式A)与4-氰基苯甲酰氯(式B)反应生成目标产物N-(5-5-氯吡啶-2-基)-2-(4-氰基苯甲酰基)-5-甲氧基苯甲酰胺(式D化合物)。适当的调整4-氰基苯甲酰氯(式B)与碱的投料量，分别选择了三个投料比，均于25～35℃反应2小时。取1滴样品，用四氢呋喃(1.0mL)加3滴水稀释，送HPLC分析。
表2
操作：
批次1(投料比为式A:式B:吡啶＝1.0:1.0:0.4)；
1)室温(23-28℃)下，向四口瓶中加入四氢呋喃(4.0vol)和(1.0eq)的式A，搅拌均匀。
2)向体系中加入0.4eq的吡啶，搅拌均匀。
3)将1.0eq的式B用四氢呋喃(3.0vol)溶解，加入恒压滴液漏斗中。在25-35℃之间，将酰氯的溶液缓慢滴加到反应液中，滴加过程中，反应液出现大量黄色粉末状不溶物，滴加完毕后，用四氢呋喃(1.0vol)冲洗恒滴。
4)于25～35℃反应2小时后，取1滴样品，用四氢呋喃(1.0ml)加3滴水稀释，送HPLC。
批次2-5改变投料比，其他操作不变。
通过以上五个批次实验现象及结果的对比(表2)，最终选定最大单杂最低，HPLC纯度相对较高的批次3。即投料比最终选定为式A:式B:吡啶＝1.0:1.05:0.4。
B.反应温度的优化：
以优化后的投料量比例，采用优化后的溶剂，选取0-10℃,20-30℃,40-50℃,60-70℃(回流)反应2小时，考察反应效果，取1滴样品，用THF(1.0ml)加3滴水稀释，送HPLC。
表3
操作：
批次1(0-10oC)：
1)室温(23-28℃)下，向四口瓶中加入四氢呋喃(4.0vol)和(1.0eq)的式A，搅拌均匀。
2)向体系中加入0.4eq的吡啶，搅拌均匀，冰水浴降温至0℃。
3)将1.05eq的式B用四氢呋喃(3.0vol)溶解，加入恒压滴液漏斗中。在0-10℃之间，将酰氯的溶液缓慢滴加到反应液中，滴加过程中，反应液出现大量黄色粉末状不溶物，滴加完毕后，用四氢呋喃(1.0vol)冲洗恒滴。
4)于0-10℃反应2小时后，取1滴样品，用四氢呋喃(1.0ml)加3滴水稀释，送HPLC。
批次2～4改变温度，其他操作不变。
通过以上四个批次实验现象及结果的对比(表3)，发现低温不利于搅拌，升高温度对反应产率的提高也很有限，综合考虑，最终选定反应温度为20-30oC。
C.后处理pH值优化
该步骤生成的产物为中间体D化合物的盐酸盐，后处理需进行调碱处理，因此不同的pH值会影响产品的收率与质量，我们以优化后的投料量比例，采用优化后的溶剂，选取优化后的反应温度反应2小时，后处理分别将体系调制pH为7-8、9-10、11-12，考察不同pH体系下的得到的产品收率与质量。
表4
操作
批次1：
1)室温(23-28℃)下，向四口瓶中加入四氢呋喃(4.0vol)和(1.0eq)的式A，搅拌均匀。
2)向体系中加入0.4eq的吡啶，搅拌均匀，冰水浴降温至0℃。
3)将1.05eq的式B用四氢呋喃(3.0vol)溶解，加入恒压滴液漏斗中。在0-10℃之间，将酰氯的溶液缓慢滴加到反应液中，滴加过程中，反应液出现大量黄色粉末状不溶物，滴加完毕后，用四氢呋喃(1.0vol)冲洗恒滴。
4)于0-10℃反应2小时后，取1滴样品，用四氢呋喃(1.0ml)加3滴水稀释，送HPLC。
5)加入饱和的碳酸钠水溶液调节pH值7-8，充分搅拌。
6)过滤，用水(40mL x 2)泡洗滤饼，滤饼晾干，得产品6.63g。
批次2；
操作同批次1；只是把后处理pH值调为9-10，得产品7.04g。
批次3；
操作同批次1；只是把后处理pH值调为11-12，得产品6.99g。
通过以上三个批次实验结果的对比(表4)，发现pH为7-8时产品纯度较高，但是收率较低，随pH值的升高，收率在逐渐升高。考虑到pH值越高对于生产设备的要求越高，最终选择后处理pH值为9-10。
本发明所涉及改进的式D合成方法与现有技术相比，溶剂四氢呋喃的使用量从原来的21体积减少至8体积，使用相对少量的式B化合物(1.05当量)，优化后处理采用3.5体积饱和碳酸钠水溶液淬灭中和反应液并控制PH值调节，析出的D化合物经过滤、水洗并干燥后以较高的收率(90％以上)得到。如上证明，本发明改进的式D制备方法在不降低产品(式D)纯度，提高反应收率的基础上使反应试剂(式B)和溶剂(THF)使用量减少，不仅降低了成本，而且使反应条件相对温和、后处理工艺简洁、不产生危害级别高的工业三废(废气、废水、废渣)，经济环保更适合绿色环保的工业大规模生产。
用于本发明方法中的化合物可由易于获得的起始物质制备得到。应当理解当给出典型或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应混合物的摩尔比、溶剂、压力等)时，也可使用其它工艺条件，除非另作说明。最佳反应条件可随着具体反应混合物或所使用的溶剂而改变，但是该条件是本领域技术人员通过常规的优化工艺可以确定的。
此外，对于本领域技术人员显而易见的是，常规的保护基对于阻止某些官能团发生不希望的反应是必需的。用于不同官能团的适宜保护基以及用于保护及脱保护特定官能团的适宜条件也都是本领域所熟知的。例如，T.W.Greene和G.M.Wuts(1999)ProtectingGroupsinOrganicSynthesis，第三版，Wiley，NewYork中描述了多种保护基，其以引用的方式并入本发明中。
3.式I化合物或其盐
本发明提供一种上述方法制备得到的贝曲西班游离碱(式I)化合物，该化合物基本上不含化合物E和/或化合物F。
本发明还包括式(I)化合物所有的药物学上可接受的异构体、盐、水合物、溶剂化物以及前药衍生物。另外，式(I)的化合物可以各种异构体或者互变异构体的形式存在，而且所有的此等异构体和互变异构体形式及其药物学上可接受的盐、水合物、溶剂化物以及前药衍生物都包括在本发明的范围内。
例如，本发明包括的式(I)化合物盐的一些实例包括但不限于盐酸盐、乳酸盐、马来酸盐、乙酸盐、苯氧基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、抗坏血酸盐、樟脑酸盐、葡糖酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、富马酸盐、顺丁烯二酸盐苹果酸盐、丙二酸盐、。所属领域的技术人员应认识到其它酸也可用于利用本发明方法制备式I化合物的盐。然后可使第一种盐转化为诸如马来酸盐等第二种盐。
4.医药组合物
由本发明的方法制得的化合物和盐可用于医药组合物中。本发明的医药组合物可用于预防或治疗罹患某种病状的个体，其中这种病状以不想要的血栓形成为特征。本发明的医药组合物包含医药学上可接受的载剂和治疗上可接受的量的式I化合物的盐，例如式I化合物的马来酸盐。
通常为水溶液或悬浮液的式I化合物的马来酸盐的诊断学应用通常将利用诸如溶液或悬浮液等调配物。
在血栓形成病症的控制中，本发明化合物可以诸如用于经口投药的片剂、胶囊、含片或酏剂、栓剂、无菌溶液或悬浮液或可注射投药等组合物形式利用或并入成形物件中。可向需要治疗的个体(通常为哺乳动物个体)投与将提供最佳功效的适当剂量的本发明化合物。投药剂量和方法将随个体而变化且取决于诸如所治疗的哺乳动物的类型、其性别、体重、饮食、并行药物、总体临床病状、所使用的特定化合物、使用这些化合物的特定用途和医学领域的技术人员将认识到的其它因素等因素。
除含有活性剂外，适用于本发明中的片剂还可包含填充剂、粘合剂、压缩剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、水、滑石粉和所属领域的技术人员公认的其它要素。片剂可为在核心处具有单层的均一片剂，或具有多个层以实现优选释放概况。在一些情况下，本发明的片剂可经诸如肠溶包衣包覆。所属领域的技术人员应了解其它赋形剂也适用于本发明的片剂。
本发明化合物也可通过使用与化合物分子偶合的抗体、抗体片段、生长因子、激素或其它靶向部分来传递。本发明化合物也可与作为可靶向的药物载剂的合适聚合物偶合。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基-天冬酰胺-苯酚或聚氧化乙烯-经棕榈酰基残基取代的聚赖氨酸。此外，本发明化合物还可与一类适用于实现药物控释的可生物降解聚合物偶合，这些聚合物为例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸盐和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。聚合物和半渗透性聚合物基质可形成诸如阀门、支架、管、假体等成形物件。
5.用途
由本发明所制备的式I化合物和/或盐可用于商业合成。通过给药哺乳动物治疗有效量的式I化合物(例如贝曲西班)或者其药用盐(例如贝曲西班的马来酸盐)以用于预防或治疗哺乳动物中以不希望的血栓形成为特征的病症。式I化合物或其药用盐可单独使用或与药用赋形剂结合使用以预防由不希望的血栓形成为特征的病症的发作。以不希望的血栓形成为特征的病症将包括涉及动脉和静脉血管系统的病症。
如本申请中所揭示的选择和使用的本发明所制备的化合物和/或盐适用于预防或治疗以不希望的血栓形成为特征的病症，诸如(a)治疗或预防任何发生在静脉系统中的血栓形成性综合征，包括自发发生或在恶性肿瘤、手术或外伤的情况下发生的深部静脉血栓形成或肺栓塞，(b)治疗或预防任何血栓形成介导的脑血管综合征，包括栓塞性中风、血栓形成性中风或短暂缺血性发作，(c)治疗或预防任何血栓形成介导的急性冠状动脉综合征，包括心肌梗塞、不稳定型心绞痛、顽固性心绞痛、血栓溶解疗法后或冠状动脉血管成形术后发生的阻塞性冠状动脉血栓，(d)治疗或预防与仪器(例如心脏或其它血管内导管插入、主动脉内球囊泵、冠状动脉支架或心瓣膜)相关的、及假肢器官装置匹配的血栓形成并发症，(e)治疗或预防任何凝血紊乱，包括弥散性血管内凝血(包括脓毒性休克或其它感染、手术、妊娠、外伤或恶性肿瘤的情况且无论是否与多器官衰竭相关)、血栓性血小板减少性紫癜、血栓闭塞性脉管炎或与肝素诱发性血小板减少相关的血栓形成疾病，(f)治疗或预防与体外循环(例如肾透析、心肺旁路或其它加氧程序、去血浆法)相关的血栓形成并发症。
除适用于人类治疗外，本发明的式I化合物和/或盐还适用于包括哺乳动物、啮齿动物等的伴侣动物、外来动物和农场动物的兽医治疗，例如包括猪、马、狗、猫和鸡、鸭等。
6.实例
除非另作说明，否则整个说明书中所使用的缩写具有以下含义：
A％＝总面积百分比
aq.＝水溶液
cm＝厘米
d＝双重峰
eq.＝当量
EtOH＝乙醇
g＝克
HPLC＝高效液相色谱
hr＝小时
Hz＝赫兹
IR＝红外
J＝耦合常数
Kg＝千克
L＝升
M＝摩尔浓度
m＝多重峰
Me＝甲基
MeO＝甲氧基
MeOH＝甲醇
mg＝毫克
min.＝分钟
mL＝毫升
mm＝毫米
MTBE＝甲基叔丁基醚
N＝当量浓度
nM＝纳摩尔浓度
NMR＝核磁共振
S＝单重峰
TDS＝总溶解固体
THF＝四氢呋喃
μM＝微摩尔浓度
下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实施例1：制备式I化合物
20～25℃氮气保护下，向1L瓶中加入319mL二甲胺的四氢呋喃(2.0M)溶液。然后向瓶中加入40g化合物D，搅拌均匀。控温-10℃至–5℃，向体系滴加异丙基氯化镁的THF溶液(2.0M)295mL后继续搅拌2小时。检测反应完全后。加入21mL水后温度升至20～25℃搅拌1小时，过滤，滤饼加入1L的DCM/MeOH(体积比1/1)溶液中搅拌。混合液过滤，滤液浓缩除去大部分溶剂后加入THF溶液200mL,室温搅拌过夜，过滤，得固体化合物I(33.3克，收率75％，纯度98.16％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6):δ3.87(s,3H),7.19(dd,J＝9.0,2.9Hz,1H)，7.44(d,J＝3.0Hz,1H),7.79–7.72(m,2H),8.05–7.92(m,2H),8.11(t,J＝8.5Hz,3H),8.43(dd,J＝2.6,0.7Hz,1H),9.49(br,2H)，11.10(br,2H).
13C NMR(DMSO-d6):δ167.6,164.4,156.1,151.0,146.8,138.3,137.8,132.7,130.7,129.1,128.2,127.4,126.3,125.5,118.5,116.7,114.3,56.1,42.3.IR(KBr,cm-1):3393,3012,1684,1505,1372,1296,1036,847,511。
本实施例的贝曲西班合成方法，条件温和(反应温度分别为0℃以下，及室温)，后处理废液少，易操作，原料便宜或也容易制备得到，产物纯度好，收率高，非常适合于工业化放大规模生产。
实施例2：制备式I化合物
20～25℃N2保护下，向200L反应釜中加入2750mL二甲胺的四氢呋喃(2.0M)溶液和450g化合物D，搅拌均匀。控温-10℃至0℃，向体系滴加甲基氯化镁的THF溶液(3.0M)2200mL后继续搅拌2小时。TLC显示原料消耗完全。0℃下，加入237mL水后温度升至室温搅拌1小时，过滤。滤饼加入10L的DCM/MeOH(体积比1/1)溶剂，过滤。滤液浓缩除去大部分溶剂后加入THF溶液约2000mL,室温搅拌过夜，过滤，得固体化合物I(330克，收率66％)。
本实施例的贝曲西班合成方法，条件温和(反应温度分别为0℃以下，及室温)，后处理废液少，易操作，原料便宜或也容易通过本发明的方法制备得到，产物收率高，非常适合作为工业化放大规模生产的方法推广。
实施例3：制备式I化合物
20～25℃N2保护下，向10L玻璃反应釜中加入49.0L二甲胺的四氢呋喃(2.0M)溶液和8.0Kg化合物D，搅拌均匀。控温-10℃至0℃，向体系滴加甲基氯化镁的THF溶液(3.0M)39.1L后继续搅拌2小时。TLC显示原料消耗完全。0℃下，加入4.2L水后温度升至室温搅拌1小时，过滤。滤饼加入178L的DCM/MeOH(体积比1/1)溶剂中室温搅拌1小时后，过滤。滤液浓缩除去大部分溶剂后加入35.6L的THF,室温搅拌过夜，过滤，得固体化合物I(6.4Kg，收率72％)。
本实施例的贝曲西班合成方法，条件温和(反应温度分别为0℃以下，及室温)，后处理废液少，可大大减少/避免难以除去的杂质E/F的产生因而易操作，原料便宜或也容易制备得到，收率高，非常适合于工业化放大规模生产。
实施例4：制备式D化合物
25℃下，向2000mL四口瓶中依次加入四氢呋喃(450mL，5体积)、式A化合物(90g，1eq)和吡啶(28mL，1.05eq)，搅拌均匀。加入对氰基苯甲酰氯(式B化合物，56g，1.05eq)的四氢呋喃(150mL)溶液，搅拌2小时。向体系中滴加碳酸钠饱和水溶液(300mL)，搅拌半小时后过滤，滤饼用水(200mL)和乙酸乙酯(200mL)洗涤，干燥得到式D化合物(119克，纯度98.4％，收率90.8％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6):δ3.87(s,3H),7.15-7.16(m,1H),7.47(s,1H),7.90-7.92(m,1H),8.01(m,2H),8.16(m,4H),8.45(m,1H),11.38(br,2H)。本实施例提供的式D的合成方法，收率高，纯度好，可直接用于贝曲沙班的制备。
实施例5：制备式D化合物
20℃下，向100L反应釜中依次加入四氢呋喃(32L，5体积)、式A化合物(6.4Kg，1eq)和吡啶(2.0L，1.05eq)，搅拌均匀。加入对氰基苯甲酰氯(式B化合物，4.0Kg，1.05eq)的四氢呋喃(11L)溶液，搅拌2小时。向体系中滴加碳酸钠饱和水溶液(21L)，搅拌半小时后过滤，滤饼用水(14.2L)和乙酸乙酯(14.2L)洗涤，干燥得到式D化合物(8.45Kg，收率91％)。
本实施例提供的式D的合成方法，制备过程简单，原料便宜易得，收率高达90％以上，可直接用于贝曲沙班的制备。