一种蛋白质与金属有机骨架材料的复合物的界面合成方法与流程

本发明涉及一种蛋白质与金属有机骨架材料的复合物的界面合成方法，属于有机-无机杂化材料制备技术领域。

背景技术：

金属有机骨架化合物，是金属离子与有机配体结合形成的一种纳米尺寸的复合物，它是由含氧、氮等的多齿有机配体与过渡金属离子通过自组装形成的配位聚合物。这些材料具有三维的孔结构，以金属离子为连接点，有机配体位支撑构成空间进行延伸。目前，已经有大量的金属有机骨架化合物被合成，主要是以含羧基有机阴离子配体或与含氮杂环有机中性配体为主。金属有机骨架化合物具有孔结构丰富、比表面积大、化学稳定性好、结构可调控等优点。在催化、储能、分离和分子识别等领域中都有广泛的应用。

有机-无机杂化材料集中了有机材料和无机材料各自的特点，在光学、热学、电磁学和生物学等方面具有许多优越性能。蛋白质与金属有机骨架材料复合物作为一种新型的有机-无机杂化材料，在生物催化、医学检测、生物传感器等方面都具有很大应用前景。现有的蛋白质与金属有机骨架材料复合物的制备技术主要有两种：1)首先合成金属有机骨架材料，然后以此为载体将蛋白分子通过物理吸附或者化学结合的方法固定化在金属有机骨架材料；2)在溶液中进行蛋白分子、金属离子和有机配体的混合，通过共沉淀法一步制备蛋白质与金属有机骨架材料复合物。然而上述方法存在难以批量制备、合成技术较为复杂、酶活性损失较大的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种蛋白质与金属有机骨架材料的复合物的界面合成方法，该界面合成方法基于喷墨打印技术，具有操作简单、条件温和、稳定性好、可批量制备、调控方便等特点。

本发明所提供的蛋白质与金属有机骨架材料的复合物的界面合成方法，包括如下步骤：

通过喷墨打印的方式，将蛋白质、金属离子和有机配体喷射于打印基底上，经反应即得所述复合物。

本发明界面合成方法可采用具有多墨盒的商用或工业喷墨打印机，如市售的爱普生喷墨打印机、佳能喷墨打印机、惠普喷墨打印机、Dimatix材料喷印机等。

上述的界面合成方法中，将蛋白质溶液、金属离子溶液和有机配体溶液分别加入至喷墨打印机的不同的墨盒中；

所述蛋白质溶液、所述金属离子溶液和所述有机配体溶液的加入量均可为1～6mL，如3mL；

所述蛋白质溶液、所述金属离子溶液和所述有机配体溶液分别由所述蛋白质、所述金属离子和所述有机配体溶解于溶剂中得到。

上述的界面合成方法中，所述溶剂可为水、甲醇、二甲基甲酰胺、乙醇、乙二醇、异丙醇、叔丁醇、丙三醇、二甲基亚砜、乙腈、TritonX-100和丙酮中的一种或几种的混合物；

所述蛋白质溶液、所述金属离子溶液和所述有机配体溶液的粘度均可为1～10mPa·s，具体可为2.7～2.9mPa·s、2.7mPa·s、2.8mPa·s或2.9mPa·s；

所述蛋白质溶液、所述金属离子溶液和所述有机配体溶液的表面张力均可为10～70mN/m，具体可为36～39mN/m、36.5～38.3mN/m、36.5mN/m、36.8mN/m或38.3mN/m。

上述的界面合成方法中，所述蛋白质与所述金属离子的质量比可为0.00001～1：1，具体可为0.22～0.43：1、0.22：1或0.43：1；

所述金属离子与所述有机配体的摩尔比可为1：0.1～100，具体可为1：8～40、1：8或1：40。

上述的界面合成方法中，所述反应的温度可为-10～50℃，时间可为0.01～48小时，如在25℃下反应6～24小时、6小时或24小时。

上述的界面合成方法中，所述蛋白质为细胞色素C、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、乙醇脱氢酶、蔗糖酶、南极假丝酵母脂肪酶、3α-羟类固醇脱氢酶、黄递酶、尿酸酶、乳酸脱氢酶和过氧化氢酶中的任一种或几种；

所述蛋白质的分子量可为5～300kDa。

上述的界面合成方法中，所述金属离子为锌离子、铜离子和铝离子中任一种或几种；

所述锌离子来自于水合硝酸锌、水合醋酸锌、水合硫酸锌和水合氯化锌中任一种或几种；

所述铜离子来自于水合醋酸铜、水合硝酸铜和水合氯化铜中任一种或几种；

所述铝离子来自于水合硝酸铝、水合氯化铝和水合硫酸铝中任一种或几种。

上述的界面合成方法中，所述有机配体为2-甲基咪唑、苯并咪唑、咪唑、均苯三酸、苯甲酸、对苯二甲酸、偏苯三酸中任一种或几种。

上述的界面合成方法中，所述打印基底为普通A4打印纸、滤纸、涂覆亲水高分子层的塑料薄片、PET薄片、PVC薄片、铜片、无纺布、牛皮纸和锡纸中的任一种。

上述的界面合成方法中，所述界面合成方法包括根据计算机设计的图案和色彩进行喷墨打印的步骤，打印图案形状根据实际用途设计，可为圆形，长方形或更复杂的图案，可通过打印图案的颜色配比来调控喷墨打印各反应物间的比例。

本发明方法在所述打印基底上得到的所述蛋白质与金属有机骨架材料的复合物也属于本发明的保护范围。

本发明具有以下优点：

本发明蛋白质与金属有机骨架材料的复合物的界面合成方法具有操作简单、条件温和、稳定性好、可批量制备、调控方便等特点。对不同种蛋白质、金属有机骨架材料以及不同的打印介质都具有很好的适用性。可以直接在介质表面一步、快速合成蛋白质与金属有机骨架材料复合物，并可以根据需要进行图案化设计。所得产品的稳定性提高、催化活性提高，在生物催化、医学和环境检测、生物传感器等方面都有很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1所制备的复合物的扫描电镜图。

图2是实施例2所制备的复合物的扫描电镜图。

图3是实施例3所制备的复合物的扫描电镜图。

图4是实施例4所制备的复合物的扫描电镜图。

图5是实施例5所制备的复合物的扫描电镜图。

图6是实施例6所制备的复合物的扫描电镜图。

图7是实施例7所制备的复合物的扫描电镜图。

图8是实施例8所制备的复合物的扫描电镜图。

图9是实施例9所制备的复合物的扫描电镜图。

图10是实施例10所制备的复合物的扫描电镜图。

图11是实施例11所制备的复合物的扫描电镜图。

图12是实施例13所制备的复合物的扫描电镜图。

图13是实施例14所制备的复合物的扫描电镜图。

图14是实施例15所制备的复合物的扫描电镜图。

图15是实施例16所制备的复合物的扫描电镜图。

图16是实施例15所制备的复合物的扫描电镜图。

图17是实施例16所制备的复合物的扫描电镜图。

图18是实施例1所制备的复合物与ZIF-8晶体的X射线衍射数据图。

图19是实施例1所制备的复合物对过氧化氢的显色示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蛋白质与金属有机骨架材料复合物的界面合成

1、配制含细胞色素C(分子量为12400)，浓度为8mg/mL的溶液(粘度为2.8mPa.s，表面张力为38.3mN/m)，溶剂为水、丙三醇和TritonX-100的混合物，三者的质量比为175:75:1。

2、分别配制浓度为125mmol/L的水合硝酸锌的溶液(粘度为2.7mPa.s，表面张力为36.5mN/m)和浓度为1mol/L的2-甲基咪唑的溶液(粘度为2.8mPa.s，表面张力为36.5mN/m)，溶剂均为DMSO、乙二醇和乙醇的混合物，三者的体积比为4:6:9。

3、将上述的硝酸锌溶液放入打印机蓝色墨盒中，2-甲基咪唑溶液放入到红色墨盒中，细胞色素C溶液放入到黄色墨盒中，将步骤2中的混合溶剂加入黑色墨盒(所有墨盒必须有墨水才能打印)，加入量为3mL，，静置10分钟。

4、使用滤纸作为打印基底，装入喷墨打印机的进纸区。

5、设置打印图案颜色为：蓝色100％，黄色100％，红色100％，即细胞色素C与锌离子的质量比为0.22：1，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1：8，执行打印程序，重复打印次数4次。

6、将步骤5所得产物置于25℃下空气中干燥6小时。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图1所示，由图1可知，所得复合物的主体形状比较规则，颗粒粒径在100nm～500nm之间。

本实施例制备的复合物的X射线衍射图如图18所示，由图18可知，复合物保留了金属有机骨架化合物(ZIF-8)中的晶面。

本实施例制备的复合物对过氧化氢检测结果如图19所示，由图19可知，以细胞色素C/ZIF-8复合物为催化剂时，对浓度在10mM到120mM之间的过氧化氢待测液，可以明显的看出颜色深浅的差异，可以用于过氧化氢浓度的快速检测。

上述打印细胞色素C的样品片检测过氧化氢的具体方法是：以过氧化氢和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物，将待测的样品片裁剪成0.6mm直径的圆片，将2mM过氧化氢与532μM ABTS加入1mL磷酸缓冲溶液(50mM，pH7.0)中，取10μL滴在圆片上，放置10min，观察显色显色。

将打印细胞色素C的样品片替换为下述实施例中制备的蛋白质-复合物，其它操作一致，以细胞色素C测定的酶活为100％进行计算。

实施例2、蛋白质与金属有机骨架材料复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤2中硝酸锌溶液更改为醋酸铜溶液(粘度为2.9mPa.s，表面张力为36.8mN/m)，二甲基咪唑溶液更改为均苯三酸溶液(粘度为2.9mPa.s，表面张力为36.8mN/m)，浓度分别为20mmol/L和80mmol/L，进行反应。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图2所示，由图2可知，所得复合物的主体形状为比较规则的片状结构，颗粒粒径在50nm～200nm之间。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到10mM。

实施例3-4、蛋白质与金属有机骨架材料复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将细胞色素C依次替换为辣根过氧化物酶和南极假丝酵母脂肪酶。

复合辣根过氧化物酶的复合物的扫描电镜图如图3所示。

葡萄糖氧化酶的复合物的扫描电镜图如图4所示。

由上述各图可得知，实施例3-4制备得到的复合物主体形状比较规则，尺寸在100nm～500nm之间。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到15mM。

实施例5-7、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的合成

将实施例1中的介质由滤纸改为PVC薄片、打印胶片和铜片，将几种材质的打印次数依次改为1次。

PVC薄片打印的复合物扫描电镜照片如图5所示。

打印胶片打印的复合物扫描电镜照片如图6所示。

铜片打印的复合物扫描电镜照片如图7所示。

由上述各图可得知，实施例5-7制备得到的复合物，尺寸在100nm～1μm，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物相比表面不规则程度增加。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到10mM。

实施例8、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤3的打印次数改为8次。

打印8次的复合物的扫描电镜照片如图8所示，由图8可知，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物相比界面上的分布密度增加。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到12mM。

实施例9、将实例8中的介质由滤纸改为A4打印纸。

复合物的扫描电镜照片如图9所示，由图9可知，本实施例制备的复合物与实施例1制得的复合物晶体的分布更加不均匀。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到20mM。

实施例10、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤1的酶替换成辣根过氧化物酶，浓度替换为4mg/mL。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图10所示，由图10可知，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物基本一致。

实施例11、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液浓度替换为62.5mmol/L和1mol/L，得到的结果如图11所示。

实施例12、蛋白质与有机骨架化合物的复合物的界面合成。

操作步骤同实施例2，不同之处在于，将均苯三酸替换为对苯二甲酸，得到的复合物表面不规则。

实施例13、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，金属溶液和有机配体溶液的溶剂替换为水、乙醇和乙二醇的混合物。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图12所示，由图12可知，本实例所得的复合物大小均匀，尺寸在100nm左右。

实施例14、蛋白质与金属有机骨架化合物复合物的合成

1、分别配制浓度为0.0625mol/L的水合硝酸锌水溶液(粘度为2.8mPa.s，表面张力为36.5mN/m)，浓度为2.5mol/L的2-甲基咪唑水溶液(粘度为2.8mPa.s，表面张力为36.5mN/m)，溶剂为DMSO、乙二醇和乙醇的混合物，对所得溶液分别进行超声处理10分钟。

2、配制细胞色素C溶液(粘度为2.8mPa.s，表面张力为38.3mN/m)，溶剂为水、叔丁醇和乙二醇的混合物，细胞色素C的浓度为8mg/mL。

3、将上述的硝酸锌溶液放入打印机蓝色墨盒中，2-甲基咪唑溶液放入到红色墨盒中，细胞色素C溶液放入到黄色墨盒中，将步骤2中的混合溶剂加入黑色墨盒，将步骤2中的混合溶剂加入黑色墨盒，加入量为3ml，静置10分钟。

4、使用A4纸作为打印基底，装入打印机进纸区。

5、设置打印图案颜色为：蓝色100％，黄色80％，红色100％，即细胞色素C与锌离子的质量比为0.43：1，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1：40，执行打印程序，打印次数1次。

6、将步骤5所得产物置于25℃下空气中干燥24小时。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图13所示，由图13可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。

将复合物应用于H₂O₂检测，检测限可达到10mM。

实施例15、蛋白与金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例14，不同之处在于，将步骤1的细胞色素C浓度替换为0.15mg/mL。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图14所示，由图14可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。

实施例16、蛋白/金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将打印图案颜色比例调整为蓝色80％，黄色100％，红色80％。

本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图15所示，由图15可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大，并掺杂部分副产物。

实施例17、蛋白/金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤2中硝酸锌溶液更改为硝酸铝溶液，二甲基咪唑溶液更改为对苯二甲酸溶液，浓度分别为20mmol/L和80mmol/L，进行反应。

本实施例制备的复合物主体形状为比较规则，颗粒粒径在100nm～500nm之间。

实施例18-19、蛋白/金属有机骨架化合物复合物的界面合成

操作步骤同实施例14，不同之处在于将细胞色素C分别更换为黄递酶和乙酰胆碱酯酶。本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图16和图17所示，由图可知，实施例所得的复合物粒径分布范围较大。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。