人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR‑T载体及其构建方法和应用与流程

文档序号:11145244阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人源白细胞介素6的siRNA,所述siRNA选自下述中的a-h中的任一对:

a.SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列;

b.SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列;

c.SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列;

d.SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列;

e.SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列;

f.SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列;

g.SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列;

h.SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的siRNA在制备治疗缓解细胞因子释放综合症药物中的应用。

3.一种包含权利要求1所述的siRNA的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于:所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。

5.如权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于:所述的慢病毒表达载体包括:用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列,如SEQ ID NO.2所示;用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列,如SEQ ID NO.1所示;用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列,如SEQ ID NO.3所示;用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件;用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白,如SEQ ID NO.11所示;用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列,如SEQ ID NO.12所示;用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子,如SEQ ID NO.14所示;用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的抗CD19嵌合抗原受体的编码基因,如SEQ ID NO.52或SEQ ID NO.53所示;用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件,如SEQ ID NO.13所示;用于胞内转录siRNA的人RNA聚合酶III启动子hU6,如SEQ ID NO.14所示。

6.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括:如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件。

7.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括:如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件,以及如SEQ ID NO.4所示的RSV启动子。

8.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变,具体为:g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。

9.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述抗CD19嵌合抗原受体,包括依次串联的如SEQ ID NO.16所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.17所示的CD19单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.18所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.19所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.22所示的CD137嵌合受体共刺激因子,以及如SEQ ID NO.23所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。

10.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述抗CD19嵌合抗原受体,包括依次串联的如SEQ ID NO.16所示的CD8leader嵌合受体信号肽、、如SEQ ID NO.17所示的CD19单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.18所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.19所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.21所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.24所示的CD28嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.22所示的CD137嵌合受体共刺激因子以及如SEQ ID NO.23所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。

11.一种包含权利要求1所述的siRNA的慢病毒表达载体的构建方法,包括以下步骤:

(1)将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQ ID NO.1所示)、原核复制子pUC Ori序列(如SEQ ID NO.2所示)、病毒复制子SV40Ori序列(如SEQ ID NO.3所示)、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、ZsGreen1绿色荧光蛋白(如SEQ ID NO.11所示)、IRES核糖体结合序列(如SEQ ID NO.12所示)、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如SEQ ID NO.13所示)、人RNA聚合酶III启动子hU6(如SEQ ID NO.14所示)存储于慢病毒骨架质粒上;

(2)将人EF1α启动子(如SEQ ID NO.15所示)、用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的抗CD19嵌合抗原受体组合成二代CAR或三代CAR设计方案,经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中,得到二代CAR或三代CAR设计的重组慢病毒质粒;

(3)将上述siRNA以及如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的negative control序列,分别克隆至步骤(2)所得的重组慢病毒质粒中,得到IL-6敲减重组慢病毒质粒;

(4)将步骤(3)得到的重组慢病毒质粒分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞,在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后,包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中,收集包含的重组慢病毒载体的上清液;

(5)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的离子交换方式进行纯化,分别得到重组慢病毒载体。

12.如权利要求11所述的构建方法,其特征在于:步骤(4)中,所述抽滤步骤控制上清体积在200ml~2000ml,真空度控制在-0.5MPA~-0.9MPA,防止由于堵孔带来的载体损失;所述吸附步骤控制溶液的PH值在6~8,防止PH的变化导致载体失活;所述洗脱步骤控制洗脱液的离子强度在0.5M~1.0M,防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。

13.如权利要求3-10任一项所述的重组表达载体在制备CAR-T治疗过程中由IL6释放引起的炎症细胞因子综合症药物中的应用。

14.一种CART细胞,所述的CAR-T细胞是由上述siRNA修饰的T淋巴细胞。

15.根据权利要求14所述的CAR-T细胞在制备B淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤治疗药物中的应用。

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