本发明属于生物技术和酶工程领域，涉及一种耐热酯酶突变体制备方法和应用。
背景技术：
在聚合物材料中添加增强其塑性的物质称为增塑剂，亦称塑化剂或可塑剂，是塑料制品加工中不可缺少的加工助剂。但长期以来，国际环境保护部门研究发现，以邻苯二甲酸二辛酯(DOP)等邻苯类产品为主的塑化剂，容易引发组织发生癌变，扰乱内分泌，因此，国际上普遍对其采取相应的限制使用措施。
目前，我国生产无毒、环保的非邻苯类增塑剂品种相对匮乏，相关应用更少。大量的研究表明，环氧化油脂及其衍生物可作为增塑剂代替DOP的使用。传统的环氧化物的生产一般是通过化学法进行，化学工艺生产环氧化物需要消耗大量的能量和水资源，也会导致大量“三废”的产生。目前已经有越来越多的研究尝试利用生物化工技术实现环氧化过程。酶法催化环氧化因其具有高选择性、专一性、高收率，而且能最大限度地降低开环等副反应发生的优势而备受关注。现有的酶催化方法中，使用最多的催化剂为脂肪酶，溶剂为甲苯、二甲苯和正己烷等有机溶剂。众所周知，脂肪酶可以水解甘油酯生成游离脂肪酸，因此利用脂肪酶催化脂类进行环氧化时，会伴随有脂类物质自身和产物环氧化甘油酯被脂肪酶水解产生脂肪酸的副反应发生。如需要得到低酸价的环氧化物，需要对环氧化反应产物进行脱酸处理，导致延长工艺流程，增加生产成本。酯酶作为一种特殊的酰基水解酶，一般只水解短链的酰基甘油酯，广泛用于食品加工、生物医药、日用化工以及造纸等领域。在过氧化氢或过氧酸存在下，酯酶具有良好氧化酶活性，所以利用酯酶以上特性，将其应用于酶法制备环氧大豆油、脂肪酸甲酯和不饱和烯烃类的生产中，不仅可以解决酶法制备水解副反应的发生，还可以获得高纯度的产品，提高环氧化物增塑剂的品质。
蛋白质工程是一种能够改善蛋白质特性的方法，该方法在生物医药，生物催化等领域得到了普遍的应用。利用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白质酶分子进行定向突变和理性改造可以获得性能优良的酶突变体。
技术实现要素：
针对现有的环氧化工艺副反应多、酸价高、环氧得率低的缺点。本发明解决的技术问题是提供一种高过氧化酶活性的PestE酯酶突变体，可用于制备高性能的环氧化物。通过对Pyrobaculum calidifontis酯酶(PestE)蛋白质结构(PDB:3ZWQ)的分析，根据PestE酯酶基因序列(genbank登录号AB078331.1)理性选择突变位点，PestE酯酶野生型DNA序列经密码子优化后为SEQ ID NO.1所示，运用定点突变的方法而获得高活性突变体。采用“原始氨基酸-位置-替换氨基酸”的方法来表示酯酶突变体中氨基酸发生的位置，所述突变体为：含有L89R突变位点以及选自L40A、F20A、F33A、L213A和F289A所组成中至少一个突变位点。
本发明的技术方案具体如下：
该突变体是对来源于Pyrobaculum calidifontis的野生型耐热酯酶进行突变获得的，野生型耐热酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述突变发生的位点包括如下至少一个突变位点：所述突变发生的位点为第89位氨基酸由L突变为R，第20位氨基酸由F突变为A，第33位氨基酸由F突变为A，第40位的氨基酸由L突变为A，第213位氨基酸由L突变为A，第289位氨基酸由F突变为A，其中第89位为必要突变位点。
所述突变体为L89R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3；或者由L89R与L40A组成双突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4，L89R与L213A、F20A组成三突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5，L89R与F20A、F33A组成三突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6，L89R与L40A、F289A组成三突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7。
SEQ ID NO.2
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVLGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.3
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.4
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLIAVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.5
MPLSPILRQILQQLAAQLQARPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADAMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.6
MPLSPILRQILQQLAAQLQARPDMDVKTVREQAEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.7
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLIAVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNAYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
所述突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过表达载体pET-23a和PestE酯酶野生型基因序列全合成质粒；
(2)再利用定点突变方法设计引物，用PCR方法引入目的氨基酸突变位点以获得相应突变体。
所述PCR引物序列如下：
L89R-F:5'-TGGAGGTGGATTCGTACGTGGTTCTGTGGAAACTC-3'(SEQ ID NO.8)
L89R-R:5'-GAGTTTCCACAGAACCACGTACGAATCCACCTCCA-3'(SEQ ID NO.9)
L40A-F:5'-GAAGTCAAGTCTTATCGCGGTGAAGATGGCAAACG-3'(SEQ ID NO.10)
L40A-R:5'-CGTTTGCCATCTTCACCGCGATAAGACTTGACTTC-3'(SEQ ID NO.11)
F20A-F:5'GCTGCACAATTGCAGGCTAGACCAGATATGG3'(SEQ ID NO.12)
F20A-R:5'CCATATCTGGTCTAGCCTGCAATTGTGCAGC3'(SEQ ID NO.13)
F33A-F:5'GGTGAGAGAGCAGGCCGAGAAGTCAAGTC3'(SEQ ID NO.14)
F33A-R:5'GACTTGACTTCTCGGCCTGCTCTCTCACC3'(SEQ ID NO.15)
L213A-F:5'GTTATTCTTACTGCCGATGCAATGGCCTGGTTTGGTAG3'(SEQ ID NO.16)
L213A-R:5'CTACCAAACCAGGCCATTGCATCGGCAGTAAGAATAAC3'(SEQ ID NO.17)
F289A-F:5'GTCATTCATGGCTTTGTCAATGCCTATCCAATATTAGAGGAAGG3'(SEQ ID NO.18)
F289A-R:
5'CCTTCCTCTAATATTGGATAGGCATTGACAAAGCCATGAATGAC3'(SEQ ID NO.19)
将利用上述突变体制备的重组质粒转入宿主细胞制得的重组菌株。所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21。
所述耐热酯酶突变体在制备环氧化甘油酯中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所获得的突变体具有更好耐高温性，具有更好的稳定性，可明显提高过氧化酶活，并且显著提高突变体过氧化氢的耐受性。
(2)本发明利用酯酶催化甘油酯进行环氧化反应，环氧化能力明显高于野生型，没有副反应发生，环氧脂肪酸甘油酯的得率高、成分单一、易于分离回收，生产过程可控性强，具有经济性和环保性。
附图说明
图1为酯酶PestE及其突变体的蛋白电泳纯化图，泳道1是标准蛋白质分子量Marker，泳道2是纯化后的PestE-WT，泳道3是纯化后突变体PestE-L89R。
具体实施方式
以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明所使用的酯酶，其蛋白序列号已被蛋白质数据库公布(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)：来源于Pyrobaculum Calidifontis的酯酶(PestE,PDB ID:3ZWQ)。
实施例1
1.1酯酶PestE野生型及其突变体的构建：根据Genbank酯酶PestE登录号AB078331.1的基因序列以及表达载体pET-23a，委托上海生工生物工程股份有限公司合成，获得pET-23a-PestE质粒。基因合成后，利用引物L89R-F:5'-TGGAGGTGGATTCGTACGTGGTTCTGTGGAAACTC-3'及L89R-R:5'-GAGTTTCCACAGAACCACGTACGAATCCACCTCCA-3'扩增得到突变体，经基因测序正确后，进行下一步突变。比如以引物F20A-F:5'GCTGCACAATTGCAGGCTAGACCAGATATGG3'，F20A-R:5'CCATATCTGGTCTAGCCTGCAATTGTGCAGC3'为下一步引入的突变体，在获得突变体L89R的基础上扩增得另一个突变体，经基因测序鉴定结果为双突变体质粒。以此方法在催化活性中心附近设计大量突变体，并进行大量测序，测序之后对可能影响催化效率的突变体进行下一步的克隆和表达。
1.2酯酶PestE野生型及突变体表达和重组蛋白纯化：耐热酯酶PestE野生型及其突变体，在宿主大肠杆菌BL21中自诱导表达，自诱导实验过程如下：
(1)将克隆阳性质粒加入到大肠杆菌BL21感受态中与其混合，放置在冰浴上。
(2)在冰浴上放置30min，在42℃热击90s后，置冰浴5min。
(3)加入有氨苄青霉素的LB培养基，在37℃转速200rpm培养一定时间后，将培养物接种加入自诱导培养基中在37℃培养至OD600达到对数期，继续培养12h收菌。
(4)将收集的菌体用PBS缓冲液制成悬浊液，用超声仪破壁，破壁好的悬浊液在12000rpm离心15min，收集上清。
(5)纯化过程如下：先用3体积的PBS缓冲液平衡Ni柱，将制备好粗酶液进行上样，再用PBS缓冲液平衡纯化系统，待平衡后用加20mM咪唑PBS缓冲液将杂蛋白洗脱。再用洗脱液缓冲液(500mM咪唑和500mM NaCl PH7.4的磷酸盐缓冲液)进行洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的酶。
(6)利用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白纯度，纯化后的酶蛋白纯度大于90％。(见图1)
1.3PestE酶突变体酶活动力学检测：为筛选出高酶活突变体，采用酶标仪检测突变体过氧化酶活的方法进行酶活动力学检测，具体过程如下：
(1)用NaOH调节0.1M戊酸至不同pH(3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5)。在上述10ml戊酸中加入100μL 100×0.18mM乙氯-5,5-二乙基-1,3-环己二酮，和90mM NaBr。
(2)酶活测量体系：在96孔板中依次加入100μL酸溶液、10μLH2O2(30％w/w)和10μL酶液，测量OD290nm吸光值。
(3)根据米氏常数分析，分别以戊酸和过氧化氢为双底物所获得突变体催化常数分别为23.08s-1和29.01s-1，较野生型分别是6倍和3倍。野生型PestE酶和突变体催化常数的比较表1所示。
表1野生型PestE和突变体催化常数的比较
实施例2
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，突变体为L89R的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧大豆油。经检测其酸值为0.15mgKOH/g，环氧值6.1。经液相色谱-质谱分析产物中环氧脂肪酸甘油三酯含量为80.6％，环氧脂肪酸甘油二酯和单酯的含量为1.5％。
实施例3
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，突变体为L89R/L40A(双突变位点所组成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧大豆油。经检测其酸值为0.15mgKOH/g，环氧值7.2。经液相色谱-质谱分析产物中环氧脂肪酸甘油三酯含量为95％，环氧脂肪酸甘油二酯和单酯的含量为1.0％。
实施例4
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，突变体为L89R/L40A/L213A(三突变位点所组成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧大豆油。经检测其酸值为0.15mgKOH/g，环氧值5.5。经液相色谱-质谱分析产物中环氧脂肪酸甘油三酯含量为70.3％，环氧脂肪酸甘油二酯和单酯的含量为1.7％。
实施例5
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，突变体为L89R/F20A/F33A(三突变位点所组成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧大豆油。经检测其酸值为0.15mgKOH/g，环氧值6.5。经液相色谱-质谱分析产物中环氧脂肪酸甘油三酯含量为83.6％，环氧脂肪酸甘油二酯和单酯的含量为1.6％。
实施例6
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，突变体为L89R/L40A/F289A(三突变位点所组成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧大豆油。经检测其酸值为0.15mgKOH/g，环氧值5.8。经液相色谱-质谱分析产物中环氧脂肪酸甘油三酯含量为74.7％，环氧脂肪酸甘油二酯和单酯的含量为1.0％。
对比实施例1
在反应容器中加入大豆油100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，野生型PestE酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧脂肪酸甲酯。经检测其酸值为0.32mgKOH/g，环氧值5.2。经液相色谱分析产物中环氧脂肪酸甘油酯组成，环氧脂肪酸甘油三酯为66.2％，环氧脂肪酸甘油二酯的含量为1.2％，环氧脂肪酸单酯含量为0.2％。
对比实施例2
在反应容器中加入大豆油脂肪酸甲酯100g，双氧水(含有过氧化氢30％)40g，甘油三酯脂肪酶Lipase CALB(购自诺维信公司)1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒温磁力搅拌器中以600rpm的搅拌速度进行环氧化反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相。减压蒸馏回收有机相中的乙酸乙酯，即得到环氧脂肪酸甲酯。经检测其酸值为8.98mgKOH/g，环氧值7.1。经液相色谱分析产物中环氧脂肪酸甘油酯组成，环氧脂肪酸甘油三酯为60.4％，环氧脂肪酸甘油二酯的含量为20.4％，环氧脂肪酸单酯含量为12.3％。
由于氨基酸具有简并性，因此能够编码所述突变体的核苷酸序列均属于本发明所保护的范围。本领域技术人员可以理解的是，在以上所述的六个突变位点基础上，通过其他位点的突变获得突变体而不影响所述突变体的功能均属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种耐热酯酶突变体及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
atgcctctgt caccaatcct gagacaaatc ctgcaacaac tggctgcaca attgcagttt 60
agaccagata tggatgtaaa gacggtgaga gagcagttcg agaagtcaag tcttatcctg 120
gtgaagatgg caaacgagcc tatccataga gtggaagaca tcacaattcc aggaagaggt 180
ggacctatta gagcaagagt gtacagacca agagacggag aaagattgcc tgcagttgta 240
tactaccatg gaggtggatt cgtacttggt tctgtggaaa ctcatgacca cgtttgtaga 300
cgacttgcta acttgtccgg agctgttgtt gtatctgttg actacaggct agcaccagaa 360
cacaaattcc cagctgctgt tgaagatgca tacgatgctg ccaaatgggt agctgataat 420
tacgacaaat tgggtgttga caacggtaaa attgccgtcg caggtgactc agcaggtggt 480
aacttagcag ctgttacagc tattatggct cgtgatcgtg gagaatcatt tgtcaagtac 540
caggtgctaa tatatcccgc tgttaacttg accggttctc caactgtttc ccgtgttgaa 600
tattccggac ctgaatacgt tattcttact gccgatctaa tggcctggtt tggtaggcag 660
tatttctcca aacctcaaga tgctttgtct ccctatgcca gtcctatatt tgctgacttg 720
tctaatcttc cccctgcctt ggtcattacc gctgagtatg atccattaag ggatgagggc 780
gagttatatg cccacttgtt aaagactagg ggcgttcgag ctgtcgctgt tcgttataat 840
ggggtcattc atggctttgt caatttctat ccaatattag aggaagggcg agaagccgtc 900
agtcaaattg ctgctagtat taagtctatg gccgtcgcc 939
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<211> 313
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 2
Met Pro Leu Ser Pro Ile Leu Arg Gln Ile Leu Gln Gln Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gln Phe Arg Pro Asp Met Asp Val Lys Thr Val Arg Glu Gln
20 25 30
Phe Glu Lys Ser Ser Leu Ile Leu Val Lys Met Ala Asn Glu Pro Ile
35 40 45
His Arg Val Glu Asp Ile Thr Ile Pro Gly Arg Gly Gly Pro Ile Arg
50 55 60
Ala Arg Val Tyr Arg Pro Arg Asp Gly Glu Arg Leu Pro Ala Val Val
65 70 75 80
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Phe Val Leu Gly Ser Val Glu Thr His Asp
85 90 95
His Val Cys Arg Arg Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Val Val Val Ser
100 105 110
Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Lys Phe Pro Ala Ala Val Glu
115 120 125
Asp Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Trp Val Ala Asp Asn Tyr Asp Lys Leu
130 135 140
Gly Val Asp Asn Gly Lys Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Gly
145 150 155 160
Asn Leu Ala Ala Val Thr Ala Ile Met Ala Arg Asp Arg Gly Glu Ser
165 170 175
Phe Val Lys Tyr Gln Val Leu Ile Tyr Pro Ala Val Asn Leu Thr Gly
180 185 190
Ser Pro Thr Val Ser Arg Val Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Tyr Val Ile
195 200 205
Leu Thr Ala Asp Leu Met Ala Trp Phe Gly Arg Gln Tyr Phe Ser Lys
210 215 220
Pro Gln Asp Ala Leu Ser Pro Tyr Ala Ser Pro Ile Phe Ala Asp Leu
225 230 235 240
Ser Asn Leu Pro Pro Ala Leu Val Ile Thr Ala Glu Tyr Asp Pro Leu
245 250 255
Arg Asp Glu Gly Glu Leu Tyr Ala His Leu Leu Lys Thr Arg Gly Val
260 265 270
Arg Ala Val Ala Val Arg Tyr Asn Gly Val Ile His Gly Phe Val Asn
275 280 285
Phe Tyr Pro Ile Leu Glu Glu Gly Arg Glu Ala Val Ser Gln Ile Ala
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Ala Ser Ile Lys Ser Met Ala Val Ala
305 310
<210> 3
<211> 313
<212> PRT
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<220>
<223> 1
<400> 3
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Gln Leu Gln Phe Arg Pro Asp Met Asp Val Lys Thr Val Arg Glu Gln
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Ser Asn Leu Pro Pro Ala Leu Val Ile Thr Ala Glu Tyr Asp Pro Leu
245 250 255
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