一种美洲大蠊胸腺素基因THY2及其扩增方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种美洲大蠊胸腺素编码基因thy2及其扩增方法。

背景技术：

胸腺素(thymosin)主要是由胸腺产生的一种淋巴细胞生长因子，普遍存在于各种组织细胞当中。最早是由goldstein和white于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，是一组小分子多肽，含有40多种组分，因而命名为胸腺素。根据等电点(pi)可将胸腺素分为α、β、γ3个家族，其中pi在5.0-7.0的称为β族胸腺素(β-thymosin，tβ)，其结构高度保守，由40-44个氨基酸组成，分子质量约为5.0ku，广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。β族胸腺素属于极性蛋白质分子家族，最初被认为是一种胸腺激素，具有不同程度地影响血管发生以及诱导凋亡的特性。到目前为止，已发现的β族胸腺素有15种，在人体内β族胸腺素主要有3种表现形式，即胸腺素β4、胸腺素β10和胸腺素β15。其中，胸腺素β4分布最广泛、含量最多，占β族胸腺素总量的70％-80％。他们在维持激动蛋白的动态平衡及肿瘤发病与转移，细胞凋亡，炎症，血管生成和创伤愈合等多种生理、病理过程发挥重要作用。

近年来，胸腺素的生物学功能倍受人们关注，它在许多生理和病理活动中起重要作用。哺乳动物胸腺素已经用于临床治疗病症。然而，关于无脊椎动物胸腺素的报道很少，其在结构上比脊椎动物的更为复杂，功能有待于进一步的研究，其多聚形式的相似性与复杂性，有可能也具备良好的药用效果。本发明涉及的是编码美洲大蠊胸腺素合成的基因，该基因是首次从美洲大蠊中得到，命名为thy2。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中涉及到thy2基因及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一个美洲大蠊胸腺素编码基因thy2及从pcr扩增出美洲大蠊胸腺素编码基因thy2的方法。

本发明提供了一个美洲大蠊胸腺素基因thy2，它是序列表中seqidno.1所示的dna序列。

本发明seqidno.1的dna序列由393个碱基组成。

另外，本发明还提供了一种美洲大蠊胸腺素编码基因thy2的pcr扩增方法，该方法包括如下步骤：

a.从美洲大蠊组织提取总rna，反转录为cdna；

b.合成引物；

primerf5’-cgcgaattcatgtcggccccagtc-3’

primerr5’-ccgctcgagttatgctttcttctcttcatcg-3’

c.通过pcr获得美洲大蠊胸腺素编码基因。

进一步的，上述pcr的反应体系为50微升体系，其中：2×tsingkemastermix为25微升，primerf为1.5微升，primerr为1.5微升，cdnatemplate为2微升，ddh2o为20微升。

进一步的，上述pcr的反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸20s-30s，35次循环，最后72℃延伸10min，4℃forever。

附图说明

图1为美洲大蠊rna的提取电泳图谱

图2为胸腺素基因thy2和thy2的pcr扩增产物

具体实施方式

实施例1：美洲大蠊rna的提取及反转录

取人工饲养的美洲大蠊(四川好医生攀西药业有限责任公司西昌养殖基地提供)，本实验采用成都福际生物技术有限公司的组织总rna提取试剂盒根据说明书提取总rna，取1微升rna样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，美洲大蠊rna的提取电泳图谱如图1所示。然后采用北京全式金生物科技有限公司的去dna反转录试剂盒进行反转录合成第一链cdna。

实施例2：pcr扩增出美洲大蠊胸腺素编码基因thy2

由转录组分析得到基因序列，根据其基因序列及pet-28表达载体的多克隆位点区特征设计引物，用primerpremier5软件设计引物。该引物为带有酶切位点的引物(酶切位点序列加下划线)，设计合成的引物如下：

表1扩增thy2片段的引物

使用上述第一链cdna产物进行pcr反应，反应体系为：50微升体系

反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸20s-30s，35次循环，最后72℃延伸10min，4℃forever。pcr产物于-20℃保存。

将pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳中，gel-green染色，紫外灯下切下凝胶，用gelextractionkit，按照说明书操作，回收dna片段。

根据转录组分析得到的基因序列设计原核表达引物，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后有明显的三条带，大小与预测的结果一致。其中两个的表达量相对高一点，起主要功能，命名为thy1和thy2，它们几乎都来源于同一基因，只是由于内含子的剪切方式不同而导致序列之间存在差异，进而可能导致功能上有所不同。pcr结果如图2所示。测序鉴定分析得到基因thy1编码区的长度为507bp，编码169个氨基酸，thy2编码区的长度为393bp，编码131个氨基酸。rna的不同剪接可以产生不同的胸腺肽，因此形成了多聚胸腺素。其中，thy2基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

sequencelisting

<110>四川好医生攀西药业有限责任公司

<120>一种美洲大蠊胸腺素基因thy2及其扩增方法

<130>2016

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<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>美洲大蠊

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agcgaattggaaggcttcaaaactgtaaatatgaagaaggctgaaacccacgaaaaaaat120

gttttacccacagcagaagatgttgccaccgaaaaaactcagaaggctcttcttcagggt180

gtagaagctttcgacacggggaaactgaaacacacagaaactcaggaaaaaaatcccctt240

ccagacaaagatgccattgagcaagaaaggggaaagcagaacctgattgctggaattgaa300

aattttgatcccagaaagttgaagcatactgaaacccaagaaaagaatcctctgccaaca360

aaagaagccatcgatgaagagaagaaagcataa393