一种巨大芽孢杆菌QBJP‑F6及其应用的制作方法

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌QBJP-F6及其在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

背景技术：

随着我国现代农业的发展，蔬菜工厂化育苗越来越受到人们的重视，穴盘育苗是当前工厂化育苗的主要措施。据不完全统计，我国需要育苗的作物面积非常大，其中水稻种植面积就超过3亿亩/年，经济作物超过5亿亩次/年。目前国内一般以富含有机质的材料(如泥炭、腐熟植物残体等)为主，再配以适当比例的轻质无机材料，如蛭石、膨胀珍珠岩等制成育苗基质。由于材料来源受地区和成本的限制，且泥炭为不可再生资源，限制着基质无土育苗的可持续发展，现已成为草炭匮乏地区蔬菜工厂化育苗发展的瓶颈。国外工厂化育苗发展很快，进口基质保水性明显优于国产泥炭基质，进口基质中有机质和速效磷、钾含量明显高于国产泥炭基质。因此提升国内育苗基质的整体水平变得尤为迫切。将促进作物生长的根际微生物与不同腐熟废弃物料(普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基质)相结合，研制成有机活性育苗生物基质，将打破传统育苗基质的配方及工艺，成为提升我国育苗基质整体水平的一个重大突破。目前，国内已有部分专家在尝试此方面工作，主要集中在利用AM菌根接种现有基质进行育苗，虽取得一些成果，但研究均不够系统深入，也没有形成大规模推广并被广大农民认可的产品，因而本专利的研究变得尤为重要。

植物根际促生菌是指定殖于植物根际系统，并能促进植物生长的一类微生物总称。能依靠直接产生信号物质，或者提高植物抗性、加速土壤养素循环等方式促进植物生长、提高防病能力、增加作物的产量。因而成为许多学者研究的热点。

植物根际(rhizosphere)是一个非常特殊的生态环境，是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面，植物进行光合作用，将光合产物运至地下，促进根际微生物的生长和代谢，而根际微生物将有机态养分转化为无机形态，利于植物吸收，同时，很多根际微生物能分泌促进根系生长的促生物质、拮抗土传病原菌的拮抗物质。植物根际形成了根际微生物的生境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤细菌和真菌的群落结构。与动物不同，植物生长位点是固定的，植物与其他生物的互作主要依靠分泌的各种化学信号物质。植物通过根系分泌能被土壤微生物识别的信号分子启动微生物与植物根系的对话，这种对话又反过来使微生物产生一些信号来启动微生物在根部的定殖。自然条件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所爱好，如果我们在育苗的时候能够将这些特定的针对不同作物根际的功能微生物，保活添加到基质中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基质，从而进一步育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，必定能够提高该类作物在大田种植中的产量。

技术实现要素：

本发明第一方面，提供了一种巨大芽孢杆菌QBJP-F6，分离之江苏省南京市六合区横梁街道钟林村南京秦邦吉品农业开发有限公司土壤内，该巨大芽孢杆菌QBJP-F6已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2016年8月22日；保藏号为CGMCC NO.12888。

菌株QBJP-F6在LB平板上菌落为淡黄色，边缘整齐，表面光滑，凸状隆起。幼龄时期菌落为圆形、突起、表面光滑且有光泽、湿润、半透明、粘稠、易挑取；随着培养时间的延长菌落粘性降低，表面光泽变暗，长时间培养变成浅褐色，易挑取。菌体呈杆状，末端为圆形，单个或呈短链排列，能运动，大小为(1.0-1.2)μm×(1.2-3.0)μm。能够液化明胶、水解淀粉、不还原硝酸，能够在5％NaCl条件能生长。

菌株16S rRNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株QBJP-F6与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium IAM 13418D16273相似性在99.96％以上，结合生理生化试验将QBJP-F6鉴定为巨大芽孢杆菌。

本发明的第二方面，提供了上述巨大芽孢杆菌QBJP-F6在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

进一步地，将巨大芽孢杆菌QBJP-F6进行液体发酵，将发酵液接种至普通育苗基质中，混合均匀得到功能型蔬菜育苗生物基质。

本发明的第三方面，提供了一种功能型蔬菜育苗生物基质，普通育苗基质中添加巨大芽孢杆菌QBJP-F6的发酵液所得，其中，巨大芽孢杆菌QBJP-F6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12888。

进一步地，普通育苗基质中含有机质≥20％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。只要满足上述标准的蔬菜育苗基质均适用于本发明。

进一步地，巨大芽孢杆菌QBJP-F6的发酵液通过以下发酵方法制备：

将巨大芽孢杆菌QBJP-F6接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度30～35℃，搅拌速度为170～200rpm/min，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为43～50h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

进一步地，所述功能型蔬菜育苗生物基质中巨大芽孢杆菌QBJP-F6活菌数≥2.0×10⁷CFU/g基质干重。

进一步地，所述蔬菜包括西瓜、黄瓜、辣椒或番茄。

本发明的第四方面，提供了上述功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、制备保藏号为CGMCC NO.12888的巨大芽孢杆菌QBJP-F6发酵液；

步骤2、将步骤1制备的发酵液按基质干重的2～10v/w％接种到普通育苗基质，混合均匀，使其中巨大芽孢杆菌QBJP-F6活菌数≥2.0×10⁷CFU/g基质干重，得到功能型蔬菜育苗生物基质。

进一步地，巨大芽孢杆菌QBJP-F6的发酵液通过以下发酵方法制备：

将巨大芽孢杆菌QBJP-F6接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度30～35℃，搅拌速度为170～200rpm/min，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为43～50h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

本发明的有益效果：

本发明分离出了一种巨大芽孢杆菌QBJP-F6，该菌株能够有效地在种苗根际定殖，菌株具有较强的促生功能，能够增强所育种苗后期盆栽及田间种植中的生长。将巨大芽孢杆菌QBJP-F6的发酵液添加到普通育苗基质中得到功能型蔬菜育苗生物基质，由于基质的良好通透性和优质保水性，普通基质与功能菌QBJP-F6结合后，能够大幅度促进QBJP-F6的存活能力，从而确保所育种苗根际带有大量活性功能菌，产品中稳定含有2.0×10⁷CFU/g(基质干重)以上的活性功能微生物，对蔬菜苗期的促生效果好，能够显著促进多种蔬菜苗期生长，能够得到根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，能够显著促进所育种苗后期栽培过程中的生长。

附图说明

图1为QBJP-F6在LB平板上的菌落形态。

图2为基于菌株QBJP-F6的16S rRNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树。

图3为生物基质育黄瓜苗的促生效果图(第一季)。

图4为生物基质育黄瓜苗的促生效果图(第二季)。

生物材料保藏信息

QBJP-F6，分类命名为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2016年8月22日；保藏编号为CGMCC NO.12888。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1、菌株的分离及鉴定

取5g土壤于盛有45ml无菌水的三角瓶内，在30℃，170r/min条件下的摇床中振荡20min，制成土壤悬浮液，80度水浴20min后，稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同梯度稀释液后涂平板，培养箱中黑暗培养1d～2d，后挑取单菌落，经平板纯化后，共挑选12株，分别测定各菌株产植物生长素吲哚乙酸(IAA)的能力(方法参考文献：Glickmann E,Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria.[J].Applied and environmental microbiology,1995,612)。采用同样的方法，结果初筛和复筛，获得一株促生能力优异的菌株QBJP-F6，保存留待进一步研究。

如图1所示，菌株QBJP-F6在LB平板上菌落为淡黄色，边缘整齐，表面光滑，凸状隆起。幼龄时期菌落为圆形、突起、表面光滑且有光泽、湿润、半透明、粘稠、易挑取；随着培养时间的延长菌落粘性降低，表面光泽变暗，长时间培养变成浅褐色，易挑取。菌体呈杆状，末端为圆形，单个或呈短链排列，能运动，大小为(1.0-1.2)μm×(1.2-3.0)μm。能够液化明胶、水解淀粉、不还原硝酸，能够在5％NaCl条件能生长。

如图2所示，菌株16S rRNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株QBJP-F6与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium IAM 13418D16273相似性在99.96％以上，结合生理生化试验将QBJP-F6鉴定为巨大芽孢杆菌。将QBJP-F6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年8月16日，保藏号为CGMCC NO.12888。

实施例2、功能菌菌液的生产

将菌株QBJP-F6(CGMCC NO.12888)接种至PDA培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH7.0，发酵温度为30℃，搅拌速度为170rpm/min，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

实施例3、功能型生物基质研发

以菌株QBJP-F6为功能菌的生物基质育苗效果

基质的研发：将实施例2制备的菌株QBJP-F6发酵液接种(按基质干重的5v/w％接菌，下同)至普通育苗基质中，混合均匀。基质中功能菌株QBJP-F6采用选择性培养基计数，选择性培养基的配方为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂2.0％，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高压灭菌20min。1％多粘菌素2mL，1％放线菌酮4mL(抗生素在培养基倒前冷却后加入)。功能菌QBJP-F6菌落数以每克基质干重计算。经计数，生物基质中含功能菌数约为4.1×10⁷CFU/g。

育苗试验处理如下：1)普通育苗基质(CK2)；2)添加未接菌空白培养液的育苗基质(CK1)；3)添加菌株QBJP-F6发酵液(按基质干重的5v/w％接菌，下同)的育苗生物基质(QBJP-F6)。将黄瓜种子消毒浸种催芽，露白后，埋入三个处理的基质中，每个处理30个重复。30天左右分别测定相关生长指标：株高、茎粗、SPAD、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重(表1)。并稀释涂布计数各处理中功能菌QBJP-F6在根际的定殖数量。

同样的处理，重复做第二季(表2)。

综上所述，两季苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK2)及添加未接菌空白培养基的育苗基质(CK1)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(QBJP-F6)对黄瓜苗的生长有明显的促生效果。在功能菌方面，两季苗盘育苗实验中，添加菌株QBJP-F6发酵液的育苗生物基质所育黄瓜种苗30天左右根际含有功能菌的数量分别为4.34×10⁷CFU/g、2.74×10⁷CFU/g(根际基质干重)。

表1第一季生物基质育苗30天对黄瓜苗期生长的影响

表2第二季生物基质育苗30天对黄瓜苗期生长的影响