一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记及其制备方法与流程

本发明涉及SNP标记的技术领域，尤其涉及一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记及其制备方法。

背景技术：

我国养猪业历史悠久，养殖规模与技术不断扩大与提高。然而，养猪业的发展也面临着挑战，其中猪的疫病控制能力尚低，对疾病的监测、诊断、防御和扑灭等环节仍需要加强。为了防御疾病，药物的大量使用使得猪肉食品安全问题突出，因此，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业的新策略和热门研究方向。

全基因组关联分析(GWAS，genome-wide association studies)自1996年被提出(Rish N,Merikangas K,1996)，近些年成为研究复杂性状的新方法，特别是在畜禽的重要经济性状、疾病的抗性、品种的特征等性状研究的应用，大大丰富了畜禽标记辅助选择(MAS,marker assisted selection)可用的分子标记，为畜禽重要经济性状提供了遗传基础，从而克服了连锁分析的局限性。

Klein等人利用全基因组关联分析首次报道了与年龄相关的视网膜黄斑变性，在医学界运用人类基因组中数量众多的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)为标记对病例进行关联分析，从而发现影响复杂疾病的遗传基础，这在人类疾病研究中是一大突破。如最近利用GWAS发现在TCF7L2和CDKN2A/2B基因上存在与亚洲人、印度人早发型II型糖尿病有关的SNPs(Chidambaram M et al.,2016)。在畜禽上，Daetwyler等人利用Affymetrix公司的10K SNP芯片对484头荷斯坦奶牛进行方差组分连锁分析和连锁不平衡单点回归分析发现了与305天产奶量、乳汁率、乳蛋白含量；体细胞评分；个体寿命；产犊间隔；初产年龄相关的102个潜在的QTL和144个显著相关的SNPs。依赖于基因分型和高通量测序，传统的分子标记GWAS通过基因分型寻找可能影响人类疾病的基因多态。如果将GWAS与临床结合起来，运用抗原作为探针，就可以利用细胞GWAS寻找真正影响发病机制的基因多态。

IFNγ(interferon gamma)是II型干扰素的唯一成员，由活化的T细胞和自然杀伤细胞产生，具有激活激活巨噬细胞并促进其功能，促进多种细胞表达MHCI类和MHCII类分子，促进Th0细胞分化成Th1细胞，并抑制Th2细胞增殖等作用。Ben等人的研究发现，IFNγ基因存在多态，相比于正常人，在慢性乙型肝炎患者中AA基因型更容易产生低水平的IFNγ，这可能降低对乙型肝炎病毒的敏感性；另有研究表明IFNγ可以通过抑制粒细胞趋化蛋白2的生成而对胶原诱导性关节炎起保护作用；研究还发现IFNγ能抗肝纤维化；最新研究发现在I型糖尿病患者自然杀伤细胞上的MHCI类限制性T细胞相关分子CRTAM可以触发分泌IFNγ的自然杀伤细胞IFNγ的表达，表明CRTAM可以作为鉴定炎性细胞的一个标。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记，以此作为猪病毒免疫性状相关的SNP分子标记在标记辅助选择中应用。

本发明的另一个目的在于提出一种与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记的制备方法，可有效确定与猪病毒免疫性状相关联的SNPs。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列为：CACTTTAGGA[A/G]TTCCTGTTTT，所述核苷酸序列的11bp处有一个A11-G11的碱基突变，导致多态性。

进一步说明，所述SNP分子标记在猪病毒免疫性状检测中应用。

进一步说明，所述SNP分子标记位于1号染色体的264617769处，即为等位基因的突变位点，所述SNP分子标记与细胞因子IFNγ呈极显著相关。

一种与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取猪基因组DNA；

(2)Elisa细胞因子检测：对35日龄小猪进行Poly I:C模拟病毒刺激，刺激4小时后采血，分离血清进行Elisa细胞因子检测；

(3)基因分型：将所述猪基因组DNA样品在全基因组芯片上做基因分型；

(4)细胞因子与基因型间的关联分析：采用PLINK软件进行数据的质量控制；采用GenABEL软件包进行全基因组关联分析，从中选取与IFNγOD值显著关联的SNP，注释该SNP，再通过生物信息学方法对目标区域内的基因进行功能注释，确定与猪病毒免疫性状相关联的SNPs。

进一步说明，所述Elisa细胞因子检测，包括如下步骤：

(1)用标准品稀释液倍比稀释IFNγ标准液使终浓度分别为500、250、125、62、31、16、8、0pg/mL；

(2)用Streptavidin-HRP稀释液将Streptavidin-HRP稀释至终浓度2.5μL/mL；

(3)在酶标板中每孔加50μL标准稀释液或待测样品，室温孵育1h；

(4)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL生物素标记的抗体，室温孵育1h；

(5)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL Streptavidin-HRP，室温孵育30min；

(6)Wash buffer清洗3次，每孔加100μLTMB底物，避光反应30min；

(7)每孔加100μL stop solution终止反应；

(8)酶标仪绘制标准曲线，测待测样品OD值。

进一步说明，所述提取猪基因组DNA为从猪血液中提取猪基因组DNA，按常规DNA提取方法得到DNA溶液，并将所述DNA溶液和1μL加样缓冲液混匀，上样于1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20～25分钟，紫外灯下观测电泳结果并拍照，判断DNA的完整性；对提取后的DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.8-2.2之间，A260/A230在1.8-2.2之间被判定为合格。

进一步说明，所述全基因组芯片中包含61177个SNP位点，所述质量控制为采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率(SNP call rate)>90％、最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)检验的P值<10-5以及样本检出率(sample call rate)>90％指标为标准，质控后共得到43481个SNP。

本发明的有益效果：本发明通过运用了全基因组关联分析的方法寻找得到了与猪病毒免疫性状相关的SNP分子标记，其中从获得的核苷酸序列可以看到在该序列的第11位碱基处有一个A11-G11的碱基突变，导致多态性；所述的SNP分子标记可用于猪细胞因子性状的检测，即作为猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用，为猪病毒免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

附图说明

图1是本发明一种与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记的制备方法的一个实施例的技术流程图；

图2是本发明得到的DRGA0002194分子标记序列，其中DRGA0002194是原SNP芯片序列号码，经过检测分析得到本发明关联的SNP分子标记；该SNP分子标记位于猪1号染色体的264617769处，即为等位基因的突变位点；

图3是本发明全基因组关联分析得到的曼哈顿图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列为：CACTTTAGGA[A/G]TTCCTGTTTT，所述核苷酸序列的11bp处有一个A11-G11的碱基突变，导致多态性。本发明主要涉及一个与猪细胞因子性状相关的SNP分子标记，通过运用了全基因组关联分析(GWAS,genome-wide association studies)的方法寻找得到了与猪病毒免疫性状相关的SNP分子标记，其中从获得的核苷酸序列可以看到在该序列的第11位碱基处有一个A11-G11的碱基突变，导致多态性；所述的SNP分子标记可用于猪细胞因子性状的检测，即作为猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记在标记辅助选择中应用，为猪病毒免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

进一步说明，所述SNP分子标记在猪病毒免疫性状检测中应用。

进一步说明，所述SNP分子标记位于1号染色体的264617769处，即为等位基因的突变位点，所述SNP分子标记与细胞因子IFNγ呈极显著相关。

如图1所示，一种与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取猪基因组DNA；

(2)Elisa细胞因子检测：对35日龄小猪进行Poly I:C模拟病毒刺激，刺激4小时后采血，分离血清进行Elisa细胞因子检测；

(3)基因分型：将所述猪基因组DNA样品在全基因组芯片上做基因分型；

(4)细胞因子与基因型间的关联分析：采用PLINK软件进行数据的质量控制；采用GenABEL软件包进行全基因组关联分析，从中选取与IFNγOD值显著关联的SNP，注释该SNP，再通过生物信息学方法对目标区域内的基因进行功能注释，确定与猪病毒免疫性状相关联的SNPs。本发明通过提取猪基因组DNA在全基因组芯片上进行基因分型；并对35日龄小猪模拟病毒刺激后采血，进行Elisa细胞因子检测；最后通过全基因组关联分析的方法进行细胞因子与基因型间的关联分析，从而有效确定与猪病毒免疫性状相关联的SNPs，得到了与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记。

进一步说明，所述Elisa细胞因子检测，包括如下步骤：

(1)用标准品稀释液倍比稀释IFNγ标准液使终浓度分别为500、250、125、62、31、16、8、0pg/mL；

(2)用Streptavidin-HRP稀释液将Streptavidin-HRP稀释至终浓度2.5μL/mL；

(3)在酶标板中每孔加50μL标准稀释液或待测样品，室温孵育1h；

(4)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL生物素标记的抗体，室温孵育1h；

(5)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL Streptavidin-HRP，室温孵育30min；

(6)Wash buffer清洗3次，每孔加100μLTMB底物，避光反应30min；

(7)每孔加100μL stop solution终止反应；

(8)酶标仪绘制标准曲线，测待测样品OD值。

进一步说明，所述提取猪基因组DNA为从猪血液中提取猪基因组DNA，按常规DNA提取方法得到DNA溶液，并将所述DNA溶液和1μL加样缓冲液混匀，上样于1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20～25分钟，紫外灯下观测电泳结果并拍照，判断DNA的完整性；对提取后的DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.8-2.2之间，A260/A230在1.8-2.2之间被判定为合格。

进一步说明，所述全基因组芯片中包含61177个SNP位点，所述质量控制为采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率(SNP call rate)>90％、最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)检验的P值<10-5以及样本检出率(sample call rate)>90％指标为标准，质控后共得到43481个SNP。

实施例

1、实验样品采集

实验猪群来自杜洛克×二花脸F₂群体的293头小猪；猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

对所有35日龄小猪注射Poly I:C后4小时内采血，用抗凝管采集血液，4℃保存备用；同时采集小猪耳样，用于提取猪基因组DNA。(具体方法参照北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒提供的说明书)

2、Elisa细胞因子测定

检测所用试剂盒购自Thermofisher公司(Porcine INFγElisa kit)

(1)用标准品稀释液倍比稀释IFNγ标准液使终浓度分别为500、250、125、62、31、16、8、0pg/mL；

(2)用Streptavidin-HRP稀释液将Streptavidin-HRP稀释至终浓2.5μL/mL；

(3)在酶标板中每孔加50μL标准稀释液或待测样品，室温孵育1h；

(4)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL生物素标记的抗体，室温孵育1h；

(5)用Wash buffer清洗3次，每孔加100μL Streptavidin-HRP，室温孵育30min；

(6)Wash buffer清洗3次，每孔加100μLTMB底物，避光反应30min；

(7)每孔加100μL stop solution终止反应；

(8)酶标仪绘制标准曲线，测待测样品OD值。

3、猪基因组DNA的提取与检测

试验采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)从猪血液中提取猪基因组DNA，具体操作步骤如下：

(1)用猪血加入抗凝管，加200μL裂解液，加入200μL缓冲液体GA(该试剂盒自带)，振荡至彻底悬浮；

(2)加入20μL蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀，置于56℃水浴锅消化过夜；

(3)加入200μL缓冲液GB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)重复操作步骤7；

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；

(11)取2μL上一步所得溶液DNA溶液和1μL加样缓冲液混匀，上样于1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20分钟，紫外灯下观测电泳结果并拍照，以判断DNA的完整性；用NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher Scientific，USA)对提取后的DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.8-2.2之间，A260/A230在1.8-2.2之间被判定为合格；对合格的DNA进行浓度测定，然后将浓度统一稀释至200ng/μL，放入-20℃的冰箱存放；不合格的DNA样品则需要重新提取。

4、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将293头猪血液中提取的基因组DNA样品在Illumina公司研制的Porcine SN P60BeadChip全基因组芯片上杂交，该芯片中包含61177个SNP位点。

采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，保证数据可靠性，以SNP基因型检出率(SNP call rate)>90％、最小等位基因频率(minor allele frequency，M AF)>0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)检验的P值<10^-5以及样本检出率(sample call rate)>90％指标为标准，质控后共得到43481个SNP。

5、数据整理与分析

(1)表型数据分析

利用R统计分析软件，对细胞因子测定值进行正态性检验，结果显示该性状基本符合正态分布。

(2)全基因组关联分析

采用GenABEL软件，进行GWAS分析，运用下述混合线性模型分析数据，模型为：Y＝Xβ+Zu+e；

其中，Y为处理后的性状值；β为固定效应(包括性别效应和批次效应)，μ为随机加性效应；X和Z为已知设计矩阵；e为未观测到的残基向量。

(3)检验SNP与性状关联的显著性

当某个SNP符合P<1.15×10^-6条件时，则这个SNP达到了全基因组的基因组水平显著。

(4)SNP注释

根据芯片SNP信息，在Ensembl网站(www.ensembl.org)的Sus scrofa Buid10.2数据库中，运用Variant Effect Predictor工具，注释该SNP，即确定SNP位点所在染色体及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中已知基因的内部还是侧翼区域内；再利用生物信息学方法，根据Ensem bl、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等网站提供的基因结构、基因类型、基因功能和通路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释，进一步确定与猪细胞因子性状相关联的SNPs，如图2所示，得到的DRGA0002194分子标记序列。

6、结果分析

R统计猪细胞因子表型性状数据检测统计结果见表1-2。

表1DRGA0002194的基因型分布

由表1可知：在280个个体里面，AA基因型个体有0个，AG基因型个体有13个，GG基因型个体有267个，初步说明A为次等位基因(MAF)，该位点可能受过选择。

表2细胞因子表型性状

表3多态性位点DRGA0002194基因型与细胞因子IFNγ的关联分析

注：**表示差异极显著P<0.01

由表2、3可知：IFNγ的方差为0.0116，DRGA0002194与IFNγ的关联P值低于1.15×10^-6的标准，说明DRGA0002194与细胞因子IFNγ呈极显著相关。如图3所示，全基因组关联分析得到的曼哈顿图。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一个与猪细胞因子IFNγ相关的SNP分子标记及其制备方法

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<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa)

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