本发明涉及一种由玄参为原料提取制备可作为对照品的高纯度哈巴苷的制备方法。
背景技术：
玄参为玄参科草本植物(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)的根茎，味甘、苦、咸，性微寒，有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效，玄参作为常用中药材，对于其化学成分研究日益剧增。
目前针对哈巴苷提取方法有溶剂直接提取法，水提醇沉和微波提取等方法。传统工艺采用水以及水醇混合溶液提取，再以大孔吸附树脂的方法处理，此法脱色效果差，洗脱线性不佳。例如，CN104327127A公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，其包括以下步骤：(1)将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数30％的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；(2)将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，分别收集含有安哥拉苷C的洗脱液、含有桃叶珊瑚苷和哈巴苷的洗脱液，减压回收乙醇，干燥、分别得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物；(3)将安哥拉苷C粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为4：6：10的正丁醇、乙酸乙酯、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5ml/min的流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的流出液，浓缩、干燥，制得安哥拉苷C粗品；(4)将安哥拉苷C粗品用中低压制备色谱进行纯化，用水、甲醇体积比1：1的混合溶剂进行等度洗脱，流速35mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的洗脱液、减压浓缩，冷冻干燥，制得安哥拉苷C纯品；(5)将桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为2:7:8:8的正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5ml/min的流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，浓缩、干燥，分别制得桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品；(6)将桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱分离，用水和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，流速35mL/min，波长210nm的紫外检测器检测，定时收集洗脱液，用HPLC检测，合并相同成分的洗脱液，收集得到含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷粗品B；(7)桃叶珊瑚苷粗品B再通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比5:95的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷纯品；(8)取步骤(5)得到的哈巴苷粗品，通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比12:88的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含哈巴苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得哈巴苷纯品。
上述专利方法虽然最终获得了纯度大于等于95％的哈巴苷，但是操作过程非常复杂并对仪器和设备要求较高，可控性差，不适于放大生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种简单可控适于放大生产的高纯度哈巴苷的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种高纯度哈巴苷的制备方法，其包括以下步骤：
(1)原料提取：将玄参药材粉碎成粗粉，采用水或乙醇水溶液进行初提，并浓缩得到初提液；
(2)树脂脱色富集纯化：将所述初提液通过活化好的阳离子交换树脂，然后依次水洗和用体积分数为35％～45％的乙醇水溶液进行解析得到含哈巴苷的流份，并浓缩得到哈巴苷粗品；
(3)硅胶柱层析：采用300-400目硅胶填充柱对哈巴苷粗品进行层析并对收集液进行浓缩获得浓缩物，其中采用氯仿：甲醇：水三者的混合液的下层为洗脱溶剂；
(4)反相柱层析：采用十八烷基硅烷键合硅胶层析柱，以乙腈水溶液为洗脱剂，对所述浓缩物进行反相层析获得收集液，经旋干即得可作为对照品应用的哈巴苷。
优选地，步骤(2)中，所述阳离子交换树脂的型号为XAD-8型。该型号的阳离子交换树脂的脱色、纯化以及富集效果最佳。
优选地，步骤(2)中，将初提液以0.5～1BV的速度通过阳离子交换树脂。
优选地，步骤(2)中，所述乙醇水溶液的体积分数为38％～42％。
根据本发明的一个具体方面，步骤(2)实施如下：将初提液以0.5～1BV的速度通过活化好的XAD-8型阳离子交换树脂，然后分别用1～3倍量柱体积的水洗脱除去杂质，再用体积分数为38～42％的乙醇溶液解析得到含哈巴苷的流份，然后63-65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/15～1/20体积。
进一步地，步骤(2)中，还将所得哈巴苷粗品与2～4倍(优选3倍)质量的100-200目硅胶混合均匀获得粗品硅胶混合物，在步骤(3)中，将所述粗品硅胶混合物加入到硅胶填充柱中。
优选地，步骤(3)中，氯仿：甲醇：水三者的体积比为60～70:30～40:10。在一个具体的实施方式中，氯仿：甲醇：水三者的体积比为65:35:10。
进一步地，步骤(4)中，十八烷基硅烷键合硅胶层析柱的柱规格可选40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm。
优选地，步骤(4)中，乙腈水溶液的质量浓度为10％～20％。
根据本发明，步骤(1)可按照本领域技术人员熟知的方法来实施，优选地，步骤(1)中，采用体积分数为60％～70％的乙醇水溶液进行提取。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明工艺在保证和进一步提高产品纯度的前提下，工艺步骤明显减少，操作更加简单，对仪器和设备要求不高，可控性好，易于工业化生产。
具体实施方式
本申请发明人在其长期大量研究中意外发现采用特定阳离子交换树脂(XAD-8型阳离子交换树脂)来处理玄参提取物可实现脱色富集纯化一次完成，该树脂既可以脱去玄参中大量黑色素样物质，又可以得到品质良好的哈巴苷粗品，这对于后期处理纯化有至关重要的作用。在此发现基础上，我们进一步提供一种良好可操控的常规提取制备方式，后续只需要少数常规2-3个步骤即可得到哈巴苷纯度为98％以上的产物，这相对于其他方法具有良好的可控效果，且目前已成功放大到千克级别。因此本发明是相较现有工艺而言获取高纯哈巴苷明显简化和有效的方法，这对于玄参相关化学成分的药理药效研究有重要的理论依据和应用价值。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。以下实施例中，所采用的XAD-8型阳离子交换树脂购自sigma公司。使用前进行活化处理，活化方法为：0.01mol/L的氢氧化钠溶液洗脱4个柱长体积，再以蒸馏水洗脱至中性。
实施例1
一种哈巴苷对照品的高效制备方法，其包括以下步骤：
(1)将1kg玄参药材粉碎成粗粉，按照质量体积比1kg/L加入10倍量的体积分数为70％的乙醇溶液10L，渗滤提取3次，每次4小时，合并提取液以65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/10体积，过滤除去机械杂质颗粒，得到初提液；
(2)将步骤(1)所得初提液以1BV/h速度通过活化好的XAD-8型阳离子交换树脂处理，先水洗脱除去杂质和糖类，再以用体积分数为40％的乙醇溶液解析得到含哈巴苷的粗品，然后65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/20体积，加入3倍量的100-200目的硅胶，混合均匀得到粗品硅胶混合物并干燥研磨后备用；
(3)选直径7.5cm和高度45cm的玻璃层析柱，然后以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合溶液，取下层溶液加入300-400目硅胶1千克匀浆后注入玻璃层析柱，以压缩空气加压压实至硅胶完全沉淀平整，得到硅胶填充柱，然后将步骤(2)所制备的粗品硅胶混合物注入硅胶填充柱顶，然后再以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合的混合液，取下层进行洗脱，以TLC指导跟踪合并，再以65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩后得到哈巴苷粗品浓缩物；
(4)步骤(3)的浓缩物过十八烷基硅烷键合硅胶柱(反相硅胶柱)，柱规格为40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm；并以15％的乙腈溶液洗脱，TLC/HPLC跟踪检测流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.21％以上纯度样品1克。
实施例2
一种哈巴苷对照品的高效制备方法，其包括以下步骤：
(1)将3kg玄参药材粉碎成粗粉，按照质量体积比1kg/L加入15倍量的体积分数为70％的乙醇溶液30L，渗滤提取3次，每次4小时，合并提取液，65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/10体积，过滤除去机械杂质颗粒，得到初提液；
(2)将步骤(1)所得初提液1BV/h速度通过活化XAD-8型阳离子交换树脂处理，水洗脱除去杂质和糖类，再用体积分数为40％的乙醇溶液解析得到哈巴苷粗品，然后65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/20体积。加入3倍量的100-200目的硅胶混合均匀得到粗品硅胶混合物并干燥研磨后备用，
(3)选直径8.5和高度68cm的玻璃层析柱，然后以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合，取下层溶液加入300-400目硅胶2.5千克匀浆后注入玻璃层析柱，以压缩空气加压压实至硅胶完全沉淀平整，得到硅胶填充柱，然后将步骤(2)所得粗品硅胶混合物注入硅胶填充柱顶，然后再以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合的混合液的下层来洗脱，以TLC指导跟踪合并，再以薄膜旋转蒸发器浓缩后得到哈巴苷粗品浓缩物；
(4)步骤(3)的浓缩物过十八烷基硅烷键合硅胶柱(反相硅胶柱)，柱规格为40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm，以15％的乙腈溶液洗脱，TLC,HPLC跟踪检测流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.37％以上纯度样品3.1克。
实施例3
一种哈巴苷对照品的高效制备方法，其包括以下步骤：
(1)将10kg玄参药材粉碎成粗粉，按照质量体积比1kg/L加入10倍量的体积分数为70％的乙醇溶液，渗滤提取3次，每次4小时，合并提取液，65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/10体积，过滤除去机械杂质颗粒，得到初提液；
(2)将步骤(1)所得初提液以1BV/h的速度通过活化XAD-8型阳离子交换树脂处理，水洗脱除杂质和糖类，再用体积分数为40％的乙醇溶液解析得到哈巴苷粗品，然后65摄氏度薄膜旋转蒸发器浓缩至原提取液1/20体积。加入3倍量的100-200目的硅胶混合均匀得到粗品硅胶混合物干燥研磨后备用；
(3)选直10cm径和高度90cm的玻璃层析柱，然后以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合，取下层溶液加入300-400目硅胶18千克匀浆后注入玻璃层析柱，以压缩空气加压压实至硅胶完全沉淀平整，得到硅胶填充柱，然后将步骤(2)所得粗品硅胶混合物注入硅胶填充柱顶，然后再以氯仿：甲醇：水按体积比65:35:10混合的混合液的下层来洗脱，以TLC指导跟踪合并，再以薄膜旋转蒸发器浓缩后得到哈巴苷粗品浓缩物；
(4)步骤(3)的浓缩物过以十八烷基硅烷键合硅胶(反相硅胶柱)，柱规格为40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm；以15％的乙腈溶液洗脱，HPLC跟踪检测流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.46％以上纯度样品12.6克。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。