一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法及其应用与流程

本发明涉及病原菌鉴定及种属分类技术领域，更具体地，涉及一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类的方法及应用。

背景技术：

桑树我国重要经济作物，具有药用价值，关于桑树的病害这方面的研究较少，一方面是桑树的病害并不是常年大面积的发生，影响生产，而桑树的经济价值也没有高到小范围的发病会造成生产损失，发病通常会直接选择剪枝；另一方面则是了解某些病的病征有哪些，怎么防治解决，却不大关注病原的研究。这也是在真菌的系统分类变动巨大的时候，桑树病原真菌的信息却没有多少更新的原因。

以桑污叶病为例，桑污叶病为夏秋季寄生在桑叶上的常见病害之一，常与桑黑斑病相混淆，多发于成熟老化的叶片上，嫩叶上少有。硬化早的桑叶、通风透光差、离地面较近的叶片易发病。发病时病叶背面蒙上一层黑色烟煤状物，在对应的叶表面也产生同样大小的灰黄色至暗褐色变色斑。严重时病斑融合或布满叶背，造成整张叶片变色。该病使叶质变劣，提早硬化，容易萎凋，不适于饲养蚕(王向东，2009)。该病的传播主要以菌丝在病叶组织内越冬，次年夏秋两季，越冬菌丝上产生分生孢子，借风雨传播，引起初侵染，后在新病斑上又产生分生孢子进行再侵染(张月季，1975)。该病多发生在晚秋落叶前，常与桑叶白粉病同时发生。

传统分类上桑污叶病(mulberry leaf mold)的病原菌原为桑旋孢霉(Clasterosporium mori Sydow)，属半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，暗梗孢科(/暗色孢科)(Dematiaceae)，穿孢霉属(/穿孔霉属/刀孢)(Clasterosporium)(1985)；而关于桑污叶病菌属(Clasterosporium)在最近出版的《DictionaryoftheFungi》(第十版)(Kirk,etal.,2008)中，被划归为真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)，巨座壳目(Magnaporthales)，巨座壳科(Magnaporthaceae)。桑污叶病菌属(Clasterosporium)的系统分类从门(phylum)到科(family)全部改变。

现有研究方法中，利用传统形态学分类方法对植物病原菌的鉴定方法中，植物病原菌的分离纯化需根据病原菌的特性进行操作。植物病原菌分专性寄生和非专性寄生两种。专性寄生菌为只能在特定宿主上生长繁殖，不能在人工培养基上培养，如白粉病菌(Agrios，2004,Plants Pathology(5_thedition))，非专性寄生则没有限制。对未知的植物病原菌进行分离，方法有两种。一种是刮取病斑上的菌丝孢子，接种至PDA培养基上，将生长的菌落不断纯化至获得纯培养菌株；另一种方法则是将叶片表面消毒后，将叶片置于合适的环境，叶片内生的菌丝会形成分生孢子梗继续生长至在叶片上重新形成病斑。传统的鉴定方法往往耗时较长，且在可能在分离纯化的过程中，丢失部分病原菌种。

真菌的鉴定及种属分类的研究方法，正从传统形态学逐渐向分子生物学过渡。利用分子生物学技术对真菌的系统分类方法中，更多的是以遗传物质的信息来佐证传统形态学的分类，并纠正一些主观分类的错误。分子生物学手段用于种属鉴定的常用手段，为使用引物扩增某个进化速度与变异程度成正比且有保守又有变异的基因片段，并通过测序比对，得到该物种的系统进化关系；完全相同或相似度极高的可以确定该物种的种属或相近物种。但这种方法不是完全准确，而且也没有适用所有物种的通用序列。

现有研究方法中，常用核糖体DNA(ribosome DNA,rDNA)序列进行测序比对。核糖体在细胞中具有重要功能，rDNA编码的基因许多都与蛋白质合成的反应过程密切相关，在蛋白质的生物合成中起决定作用。rDNA序列分为转录区和非转录区，转录区由编码核糖体5.8S、18S、28S蛋白结构的基因和基因间的2个转录间隔区(Internal Tanscribed Spacer,ITS)ITS1、和ITS2组成，共同组成一个转录单位。

rDNA中编码5.8S、18S、28S的rDNA序列较为保守，可以用于分析科间或更高级阶元间的系统发育。由于5.8S rDNA序列短、且高度保守，难以用于真菌的系统发育和分子鉴定；而18S rDNA的片段较长，片段中存在保守区和可变区，因此，现有研究中，通过选择不同的特异性扩增引物将某一结构域片段扩增后，经过测序以及对测序结果的分析比对，可用于真菌目、科、属(genus)等分类阶元的研究。但是，基于5.8S、18S、28S的rDNA序列难以对真菌种(species)水平的分类进行研究。不能确定病原真菌的种属，难以研究出针对性的防治方法。

现有的分子水平上对真菌物种的快速鉴定的研究方法中，一般通过检测ITS序列，由于ITS区受自然选择的压力较小，进化速率稍快，积累的变异也略多，因此更加适合用于分析物种的进化关系(陈剑山，2007)。但实际检测研究中发现，虽然扩增出来的ITS片段易于测序与比对，但是准确度仍有待提高，2个甚至更多真菌物种的ITS序列片段比对结果存在99％至100％相同的情况，难以进行物种层面的区分。

在实际鉴定研究中，造成一种病症的病原菌常为多种，例如，现有研究发现的桑葚菌核病的病原菌有4种，在现有技术方法下不能完全准确地获知造成桑葚菌核病的病原菌有多少种，是否有主要病原菌和次要病原菌等问题。换言之，利用传统形态学分类鉴定方法或分子生物学技术分类鉴定方法中，都只能得到一个定性的结果。不能得到一个定量的结果。综上所述，获得一种准确的病原菌鉴定及种属分类的方法具有重要的实际应用价值。

全基因组测序作为已经成熟且推广开来的一种测序，多用于基因的功能注释或进一步的比较基因组学的研究。全基因组的高通量测序多用于已知菌株的功能基因的查找鉴定，用于真菌的种属鉴定，其准确性毋庸置疑。基因组测序基于分子水平判定物种的技术已较为成熟，而测序的快速与成本低廉也使得这项技术变得更大众化。

针对桑树污叶病病原菌的鉴定及种属分类，现有的研究中，受研究方法的限制，缺乏高通量、准确性高、并且可以对病原菌进行定量检测的方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对现有对桑树病原菌鉴定不够准确、对桑树污叶病病原菌种属分类不明的技术不足，提供一种准确性更高同时种属分类明确的鉴定及物种分类方法。

本发明要解决的另一技术问题是提供所述方法在对桑树病原菌进行定量分析方面的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述方法在分析微生物物种丰度方面的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述方法在计算物种间遗传距离方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类的方法，利用高通量测序手段及生物信息学分析方法，建立一种桑树病原菌的快速、准确、高效的鉴定及种属分类方法。

具体地，所述鉴定及种属分类方法包括以下步骤：

S1.收集桑树病叶或感病部位的器官；

S2.提取桑树病叶或感病部位的器官的总DNA；

S3.IlluminaDNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.去除测序数据中桑树基因组序列；

S6.组装微生物基因组序列；

S7.组装完整核糖体序列；

S8.筛选标记微生物核糖体DNA序列；

S9.对比分析核糖体DNA序列进行种属分类；

其中，步骤S2所述提取桑树病叶的总DNA的方法为：剪取桑叶中的病斑区域，加入液氮充分研磨，用康为世纪真菌DNA提取试剂盒按照其操作说明提取病叶总DNA，所述总DNA保存于-20℃(冰箱)；

步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小400～600bp的双末端高通量测序文库；

步骤S4所述Illumina高通量测序的方法为：用Illumina Hiseq 2500测序仪对所述步骤S3中所述DNA文库进行高通量测序。

步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4中所述高通量测序数据进行数据比对分析。选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列。使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。

S5所述去除桑树的基因组DNA序列选用的参考基因组序列为：

桑属川桑(Morus notabilis)全基因组序列(GCA_000414095.2)和叶绿体基因组序列(NC_027110.1)。

优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；

优选地，所述比对算法为mem比对算法；

优选地，所述将测序数据与桑树参考基因组进行比对选用的是双末端比对方法和bwa(0.7.12-r1039)软件的默认参数；

优选地，所述编写的计算机程序是用python计算机语言编写。

步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述已去除桑树基因组序列的测序数据进行组装。

优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)。

步骤S7所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列；

优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；

优选地，所述比对方法采用无错配(0mismatch)和无空缺(0gap)比对；

优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)软件。

步骤S8所述筛选标记微生物核糖体DNA序列的方法为：使用序列比对分析软件，设定比对期望值，将步骤S6所述微生物基因组序列与数据库进行比对，根据比对结果对序列标签进行注释及物种分析；

优选地，所述比对期望值<1e-20；

优选地，所述序列比对分析软件为blastn(2.2.31+)软件；

优选地，所述数据库为NCBI数据库中的nt数据库。

步骤S9所述对比分析核糖体DNA序列进行种属分类的方法为：使用软件1对所述微生物核糖体DNA序列进行统计分析，选取系统树构建模型，将所述模型代入软件2中，构建系统进化树。

优选地，所述软件1为jModelTest2(https://github.com/ddarriba/jmodeltest2)在线软件；

优选地，所述系统树构建模型为取AIC(Akaike Information Criterion)值最小的替代模型GTR+G；

优选地，所述软件2为RaxML(8.1.5)；

优选地，所述构建系统进化树的方法为使用最大似然法构建的系统进化树，进化树迭代次数为1000次。

本发明同时提供所述桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法在桑树病原菌定量分析方面的应用。尤其是在鉴定桑树黑斑病和/或桑树白粉病方面的应用。

本发明还提供所述桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法在分析微生物物种丰度方面的应用。

所述应用的方法为：使用分析软件，计算核糖体DNA片段的平均测序深度，以此作为该物种的丰度值。

优选地，所述分析软件为bwa(0.7.12-r1039)与samtools(v1.2)。

本发明还提供所述桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法在计算物种间遗传距离方面的应用。

所述应用的方法为：使用软件3分别对核糖体DNA序列中的18S序列，ITS1+5.8S+ITS2序列，28S序列以及完整的核糖体DNA序列与近缘物种进行比对，使用软件4分别计算所述核糖体DNA序列各区段与近缘物种间的遗传距离。

优选地，所述软件3为muscle(v3.8.31)软件；

优选地，所述软件4为MEGA(6.06)软件。

本发明的有益效果是：

现有检测方法只能定性检测桑树病原菌，检测结果通常不准确。本发明首次提供了一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类的方法，利用高通量测序手段及生物信息学分析方法，实现快速、准确、高效的鉴定桑树病原菌，具有重要的推广应用价值。

附图说明

图1桑叶黑斑叶片所检测到的真菌微生物分类树。

图2验证核糖体组装结果的两对引物与通用引物ITS1/ITS4电泳图。

图3核糖体DNA序列组成与碱基GC比例分布。

图4遗传距离分析图(柱状图高度为p-Distance，须线为标准差)。

图5基于18S(A)构建的系统进化树。

图6基于ITS1+5.8S+ITS2(B)构建的系统进化树。

图7基于28S(C)构建的系统进化树。

图8基于完整核糖体DNA(D)构建的系统进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

本发明以对桑树黑斑病病原菌的鉴定及种属分类为例，根据本发明思想，本领域技术人员可以参照现有技术，对其他病症的病原菌进行鉴定及种属分类。

实施例1

在发病的桑园随机寻找到的具有典型病斑的叶片，收集，剪取桑叶中的病斑区域，剪下的病斑材料使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用康为世纪真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃。依照Illumina文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库，使用Illumina Hiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，共测得18.56M对测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量4.64Gb。

由于DNA提取过程中包含叶片材料，为减少测序数据中桑树基因组数据对微生物序列组装的影响，在进行微生物序列组装前首先去除桑树的基因组DNA序列。选取Morus notabilis全基因组序列(GCA_000414095.2)和叶绿体基因组序列(NC_027110.1)作为参考基因组序列，采用bwa(0.7.12-r1039)比对软件进行数据比对分析。比对选择mem比对算法，使用双末端比对方法和软件的默认参数，将测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的测序片段判定为桑树基因组序列。使用python编写的计算机程序从fastq测序数据中去除桑树测序数据，然后再进入微生物序列组装。微生物序列的组装使用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件进行。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的丰度值。

结果显示，共注释261条rRNA序列标签，数据包含232条细菌序列标签，29条真菌序列标签，对应16种真菌。通过对序列标签注释结果的查询，发现叶片表面存在多种植物致病病原菌，相对丰度最高的为Pseudocercospora属病原菌，见附图1，其分子标签测序深度为124X，相对丰度为49.80％，所占比例最高，相关文献报道该属绝大部分为植物病原，大部分导致植物出现褐斑，与本发明叶片病征相符合。

真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为6Kb。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行0mismatch和0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列，所述核糖体RNA的全长cDNA序列如SEQ.ID.NO1所示。

根据组装完整的核糖体DNA序列，进行扩增和Sanger测序，验证组装的正确性。设计引物序列和通用引物序列Its1、Its4分别如SEQ.ID.NO2～SEQ.ID.NO7所示，见表1。以cDNA文库为模板进行PCR扩增；PCR反应体系见表2所示。

表1 PCR验证引物序列表

表2 PCR反应体系(20μL)

ITS引物组PCR程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

验证核糖体组装结果的P1-F/R引物组和P2-F/R引物组PCR反应体系(20μL)反应条件：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃7min。取5μL的PCR扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(EB染色)电泳检测。通过琼脂糖凝胶电泳回收大小对应的PCR产物片段，见附图2所示，图2中，M:Takara DL2000Marker；1.真菌通用引物Its1和Its4；2.验证核糖体组装结果引物P1-F和P1-R；3.验证核糖体组装结果引物P2-F和P2-R；4.空白水对照。

将回收的片段进行Sanger测序；然后将测序结果与桑树黑斑病病原菌Pseudocercospora mori的核糖体RNA的全长cDNA序列进行比对，由此确定叶片上是否有桑黑斑病病原菌Pseudocercospora mori，并可由此推测桑黑斑病病原菌Pseudocercospora mori是否可能是致病菌。

由图2可知，泳道1的结果说明用真菌通用引物Its4和Its4扩增的模板DNA是属于真菌的DNA，而验证核糖体组装结果的P1引物组和P1引物组的PCR结果分别是(泳道2和3)，均扩增到相应的目的条带，进一步测序后的结果与组装的结果高度一致。

结果显示，根据高通量测序数据组装与实验验证结果，组装得到完整核糖体DNA序列，见附图3，长度5469bp(GC比例50.67％)。序列包含18S区域，ITS1区域，5.8S区域，ITS2区域，28S区域。其中18S区域长度1726bp(GC比例48.73％)，ITS1区域长度150bp(GC比例58.00％)，5.8S区域长度158bp(GC比例44.30％)，ITS2区域长149bp(GC比例57.05％)，28S区域长3286bp(GC比例51.37％)。18S区域和28S区域长度较大，占序列总长度的91.64％；而在GC比例上，ITS1区域(58.00％)和ITS2区域(57.05％)的平均GC比例则明显高于其他区域。所述18S rRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1～1726碱基序列所示；所示ITS1的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1727～1876，所述5.8S rRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1877～2034，所述ITS2的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2035～2183，所述28S rRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2184～5469。

使用blastn(2.2.31+)比对软件将核糖体DNA与nt数据库进行比对，对核糖体DNA序列进行注释，共注释出28S区域，ITS1区域，5.8S区域，ITS2区域和28S区域。使用python语言编写的计算机程序对序列的GC比例进行分析，计算各区域的平均GC比例。同时程序以100bp为计算窗口，以10bp为步进，计算核糖体DNA的GC比例特征。

使用muscle(v3.8.31)分别18S序列，ITS1+5.8S+ITS2序列，28S序列以及完整的核糖体DNA序列与近缘物种进行比对。使用MEGA(6.06)分别计算核糖体DNA序列各区段与近缘物种间的遗传距离。使用jModelTest2(https://github.com/ddarriba/jmodeltest2)选择系统进化树最优替代模型，并以此代入RaxML(8.1.5)使用最大似然法构建的系统进化树，进化树迭代次数为1000次。

使用MEGA(6.06)计算Pseudocercospora属物种与桑叶病原菌Pseudocercospora mori GD在18S区域，ITS1+5.8S+ITS2区域，28S区域与完整核糖体DNA之间p-Distance。18S序列在种间十分保守，种间区分度小；ITS序列虽然长度较短，但由于种间变化较快，区分度较高，同时误差也较大；28S序列较长，在种间具有一定的区分度，见附图4。附图4中，每一组方框组中，从左至右分别对应为18S区域，ITS1+5.8S+ITS2区域，28S区域与完整核糖体DNA的p-Distance。

经jModelTest2对rDNA序列进行统计分析，取AIC(Akaike Information Criterion)值最小的替代模型GTR+G为最优的系统树构建模型，见附图5～附图8所示。采用RaxML(8.1.5)经1000次迭代计算，分别计算基于18S序列(A)，ITS1+5.8S+ITS2序列(B)，28S序列(C)，完整核糖体DNA(D)序列进化树。结果显示，18S序列保守性强，种间区分度低；ITS1+5.8S+ITS2序列误差大，树分支结构的支持率较低；28S构建的系统进化树在结构上较接近完整核糖体DNA系统进化树，在遗传距离的计算方面，完整的核糖体DNA计算更为准确。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法及其应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5469

<212> DNA

<213> 核糖体RNA的全长cDNA序列

<400> 1

ctatacggtg aaactgcgaa tggctcatta aatcagttat cgtttatttg atagtacctt 60

actacatgga taaccgtggt aattctagag ctaatacatg ctaaaaaccc caacttcgga 120

aggggtgtat ttattagata aaaaaccaat gcccttcggg gctccttggt gaatcataat 180

aacttcacga atcgcatggc cttgcgccgg cgatggttca ttcaaatttc tgccctatca 240

actttcgatg gtaggataga ggcctaccat ggtttcaacg ggtaacgggg aattagggtt 300

cgactccgga gagggagcct gagaaacggc taccacatcc aaggaaggca gcaggcgcgc 360

aaattaccca atcccgacac ggggaggtag tgacaataaa tactgataca gggctctttt 420

gggtcttgta attggaatga gtacaattta aatcccttaa cgaggaacaa ttggagggca 480

agtctggtgc cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatattaa agttgttgca 540

gttaaaaagc tcgtagttga accttgggcc tggctggccg gtccgcctca ccgcgtgtac 600

tggtccggcc gggcctttcc ttctggggag cctcatgccc ttcactgggc gtgttgggga 660

accaggactt ttactttgaa aaaattagag tgttcaaagc aggcctttgc tcgaatacat 720

tagcatggaa taatagaata ggacgtgtgg ttctattttg ttggtttcta ggaccaccgt 780

aatgattaat agggacagtc gggggcatca gtattccgtt gtcagaggtg aaattcttgg 840

atttacggaa gactaactac tgcgaaagca tttgccaagg atgttttcat taatcaggaa 900

cgaaagttag gggatcgaag acgatcagat accgtcgtag tcttaaccat aaactatgcc 960

gactagggat cggtggatgt tatctttttg actccatcgg caccttacga gaaatcaaag 1020

tttttgggtt ctggggggag tatggtcgca aggctgaaac ttaaagaaat tgacggaagg 1080

gcaccaccag gcgtggagcc tgcggcttaa tttgactcaa cacggggaaa ctcaccaggt 1140

ccagacacaa gtaggattga cagattgaga gctctttctt gattttgtgg gtggtggtgc 1200

atggccgttc ttagttggtg gagtgatttg tctgcttaat tgcgataacg aacgagacct 1260

taacctgcta aatagccagg cccgctttgg cgggtcgccg gcttcttaga gggactatcg 1320

gctcaagccg atggaagttt gaggcaataa caggtctgtg atgcccttag atgttctggg 1380

ccgcacgcgc gctacactga cagagccaac gagttcatca ccttggccgg aaggtctggg 1440

taatcttgtt aaactctgtc gtgctgggga tagagcattg caattattgc tcttcaacga 1500

ggaatgccta gtaagcgcat gtcatcagca tgcgttgatt acgtccctgc cctttgtaca 1560

caccgcccgt cgctactacc gattgaatgg ctcagtgagg cctccggact ggcccaggga 1620

ggtcggcaac gaccacccag ggccggaaag ttggtcaaac tcggtcattt agaggaagta 1680

aaagtcgtaa caaggtctcc gtaggtgaac ctgcggaggg atcattactg agtgagggct 1740

cacgcccgac ctccaaccct ttgtgaacca aacttgttgc ttcgggggcg accctgccga 1800

cgactccgtc gccgggcgcc cccggaggtc ttctaaacac tgcatctttg cgtcggagtt 1860

tcaaacaaat gaaacaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 1920

cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 1980

acgcacattg cgccctttgg tattccgaag ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaccac 2040

tcaagcctgg cttggtattg ggcgccgcgg tgtttccgcg cgcctgaaag tcttccggct 2100

gagctgtccg tctctaagcg ttgtggattt ttcaattcgc ttcggagtgc gggcggccgc 2160

ggccgttaaa tctttattca aaggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt 2220

aagcatatca ataagcggag gaaaagaaac caacagggat tgccctagta acggcgagtg 2280

aagcggcaac agctcaaatt tgaaatctgg cgtaagcccg agttgtaatt tgtagaggat 2340

gcttctgggt agcggccggt ctaagttcct tggaacagga cgtcatagag ggtgagaatc 2400

ccgtatgtga ctggcttgca ccctccacgt agctccttcg acgagtcgag ttgtttggga 2460

atgcagctct aaatgggagg taaatttctt ctaaagctaa ataccggcca gagaccgata 2520

gcgcacaagt agagtgatcg aaagatgaaa agcactttgg aaagagagtt aaaaagcacg 2580

tgaaattgtt gaaagggaag cgcccgcaac cagactttgc ggcggtgttc ggccggtctt 2640

ctgaccggtt tactcgccgc cgtgaggcca tcatcgtctg ggaccgctgg ataagacctg 2700

aggaatgtag ctcccttcgg ggtgtgttat agcctctggt gatgcagcgc gtctcgggcg 2760

aggtccgcgc ttcggcaagg atgatggcgt aatggttgtc ggcggcccgt cttgaaacac 2820

ggaccaagga gtctaacatc tatgcgagtg ttcgggtgtc aaacccctac gcgtaatgaa 2880

agtgaacgga ggtgggaact ttttgtgcac catcgaccga tcctgatgtc ctcggatgga 2940

tttgagtaag agcatagctg ttgggacccg aaagatggtg aactatgcct gaatagggtg 3000

aagccagagg aaactctggt ggaggctcgc agcggttctg acgtgcaaat cgatcgtcaa 3060

atttgggtat aggggcgaaa gactaatcga accatctagt agctggttcc tgccgaagtt 3120

tccctcagga tagcagtaac gttttcagtt ttatgaggta aagcgaatga ttagaggcct 3180

tggggttgaa acaaccttaa cctattctca aactttaaat atgtaagaag tccttgttac 3240

ttagttgaac gtggacattt gaatgtaccg ttactagtgg gccatttttg gtaagcagaa 3300

ctggcgatgc gggatgaacc gaacgcgagg ttaaggtgcc ggaatatacg ctcatcagac 3360

accacaaaag gtgttagttc atctagacag caggacggtg gccatggaag tcggaatccg 3420

ctaaggagtg tgtaacaact cacctgccga atgaactagc cctgaaaatg gatggcgctt 3480

aagcgtatta cccatacctc gccgccaggg tagaaacgat gccctggcga gtaggcaggc 3540

gtggaggctc gtgacgaagc cttcggagtg atccggggta gaacagcctc tagtgcagat 3600

cttggtggta gtagcaaata ctcaaatgag aactttgagg actgaagtgg ggaaaggttc 3660

cgtgtgaaca gcagttggac acgggttagt cgatcctaag ccatagggaa gttccgtttt 3720

aaagtgtgcg ctccgcaccg cctggcgaaa gggaagccgg ttaacattcc ggcacctcga 3780

tgtggattat ccgcggcaac gcaactgaag gtggagacgt cggcgggggc cccgggaaga 3840

gttctctttt cttcttaacg gtccatcacc ctgaaatcgg tttgtccgga gctagggttt 3900

aacgaccggt agagcggcac acctttgtgc cgtccggtgc gctcccgacg acccttgaaa 3960

atccgccgga aggaatgatt ttcacgcgag gtcgtactca taaccgcagc aggtctccaa 4020

ggtgaacagc ctctagttga tagaacaatg tagataaggg aagtcggcaa aatagatccg 4080

taacttcggg aaaaggattg gctctaaggg ttgggcgcgt tgggccttgg gcagattccc 4140

cgggagcagg tcggcactag cttcacggcc ggcgccttcc agcacccggt ggcggacgcc 4200

cttggcaggc ttcggccgtc cggcgcgcgc ttaacaacca acttagaact ggtacggaca 4260

aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gcattgcgat ggtcagaaag tgatgttgac 4320

gcaatgtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg 4380

gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca aatgcctcgt catctaatta 4440

gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc ccactgtccc tatctactat ctagcgaaac 4500

cacagccaag ggaacgggct tggcagaatc agcggggaaa gaagaccctg ttgagcttga 4560

ctctagtttg acattgtgaa aagacatagg gggtgtagaa taggtgggag cttcggcgcc 4620

ggtgaaatac cactaccctt atcgtttttt tacttaatca atgaagcgga actggtcttc 4680

accgaccatt ttctggcgtt aaggtccttc gcgggccgat ccgggttgat gacattgtca 4740

ggtggggagt ttggctgggg cggcacatct gttaaaccat aacgcaggtg tcctaagggg 4800

gactcatgga gaacagaaat ctccagtaga gcaaaagggc aaaagtcccc ttgattttga 4860

ttttcagtgt gaatacaaac catgaaagtg tggcctatcg atcctttagt ccctcgaaat 4920

ttgaggctag aggtgccaga aaagttacca cagggataac tggcttgtgg cagccaagcg 4980

ttcatagcga cgttgctttt tgatccttcg atgtcggctc ttcctatcat accgaagcag 5040

aattcggtaa gcgttggatt gttcacccac taatagggaa cgtgagctgg gtttagaccg 5100

tcgtgagaca ggttagtttt accctactga tgaccgtcgt cccaatggta ataccgctta 5160

gtacgagagg aaccgcggtt tcagataatt ggtttttgcg gctgtccgac cgggcagtgc 5220

cgcgaagcta ccatctgctg gattatggct gaacgcctct aagtcagaat ccatgccaga 5280

acgggacgat cctctctagc acgccttagg cggataagaa taggcactgc cagtacccgg 5340

gaccctctca tctcttgcag gacacgcaag agcgaagggc gtatcgtaat ttaatcgcgc 5400

gctaggatga atcccttgca gacgacttgg acgtctgacc gggtcgtgta agcagtcgag 5460

tagccttgt 5469

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物P1-F序列

<400> 2

gtttcaacgg gtaacgggga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物P1-R序列

<400> 3

tccctacctg atccgaggtc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物P2-F序列

<400> 4

gcatgcgttg attacgtccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物P2-R序列

<400> 5

ggtgaagacc agttccgctt 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 通用引物ITS1序列

<400> 6

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 通用引物ITS4序列

<400> 7

tcctccgctt attgatatgc 20