本发明属于工业微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种利用木糖母液发酵产丁二酸所用的菌株及其生产方法。
背景技术：
：丁二酸(Succinicacid)，又称琥珀酸(butanedioicacid)，是一种常见的天然有机酸，最初1546年由Georgius从琥珀中分离发现，因而得名。丁二酸的分子式为C4H6O4，分子量为118.09，味酸，相对密度为1.572，熔点为188℃，沸点235℃(分解温度)。丁二酸一种重要的C4平台化合物，是1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要大宗化学品和专用化学品的基本原料，广泛应用于食品、塑料、医药、香料等工业，可以取代苯合成250种以上的化工产品。其中最具有发展前景的领域为合成塑料，它是合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)等可生物降解高分子材料的主要原料。目前，丁二酸的主要生产方法是以石油为原料化学法合成，不仅需要消耗大量不可再生的石化原料，生产成本较高，而且环境污染严重。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料为价格低廉、可再生的生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量CO2，绿色环保；(3)发酵条件温和。因此，微生物发酵法近年来备受瞩目，成为近年来国内外的研究热点。目前，有关发酵生产丁二酸的所用的原料除葡萄糖外，主要为粮食原料，如美国Argonne实验室进行了玉米生产丁二酸研究，日本味之素和三菱化学公司共同联合开展以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸的研究。但由于近几年粮食原料的生物工业的蓬勃发展，粮食出现短缺，价格上涨趋势明显，此外过度依赖粮食也会影响国家的粮食安全，所以使用价格低廉的农业废弃物为原料进行丁二酸发酵是降低丁二酸生产成本的关键之一。非粮淀粉原料(木薯、芭蕉芋、浮萍等)、甘蔗糖蜜、乳清及纤维素等被用来生产丁二酸。目前，与化学合成法相比，微生物发酵生产丁二酸的成本仍然偏高，需要进一步探索更为低廉的原料。木糖母液是以玉米芯、甘蔗渣等纤维素原料提取木糖过程中产生的副产物，价格十分低廉。通常状况下，每生产1吨结晶木糖可产生1.5吨的木糖母液。木糖母液中含有高达60％左右的混合糖，主要是木糖、阿拉伯糖及少量的葡萄糖，具有较强的开发应用潜力。中国专利CN104789606A公开了一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，其利用重组大肠杆菌(E.coli)发酵木糖母液发酵生产丁二酸的方法，发酵过程中需要对木糖母液进行脱毒预处理，不仅增加了生产成本，而且预处理过程会造成糖类损失。此外，所采用的菌种为大肠杆菌基因工程菌株，存在菌株不稳定性及发酵过程产生内毒素等缺点，限制了其应用范围。中国专利201010310881.0公开了一种利用农作物秸秆发酵生产丁二酸的方法，以秸秆酶解液和木糖母液的混合液作为碳源发酵生产丁二酸，由于秸秆酶解液制备需要经过碱煮、分离、酶解等步骤，工艺复杂，酶解时间长，成本高，而且木糖母液使用的量少，浓度低，木糖母液的利用率不高。中国专利200910089501.0公开了一种利用玉米芯生产丁二酸的方法，利用玉米芯水解分离得到的第一糖液、第二糖液或第一糖液的母液中的一种或多种，采用丁二酸生产菌株进行发酵得到丁二酸。当采用第一糖液的母液进行发酵时，丁二酸的产率仅为5.46％，产率极低，不能达到工业化生产的要求。技术实现要素：本发明的目的是针对现有丁二酸发酵生产中原料成本高、产量低、工艺复杂的问题，提供一种利用木糖母液发酵产丁二酸所用的菌株及其生产方法，本发明的方法成本低、产量高，工艺简单，丁二酸产量最高可达95g/L，丁二酸产率最高为85％。本发明通过以下技术方案实现：一种利用木糖母液发酵产丁二酸所用的菌株，该菌株为产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ，保藏编号为：CCTCCNO:M2016396。本发明产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ，保藏日期为2016年7月19日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016396。本发明还提供一种利用木糖母液发酵产丁二酸的方法，包括应用保藏编号为CCTCCNO:M2016396的产琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸。运用本发明得到的产琥珀酸放线杆菌，将木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中36-38℃培养16-20h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按5-15％(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满N2或CO2的环境中，转速100-200r/min，温度为36-38℃，分批发酵或分批补料发酵30-72h，即得丁二酸。作为本发明的进一步说明，所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。作为本发明的进一步说明，分批发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液总糖30-100g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，碳酸氢钠2-10g/L，氯化钙0.3-1.0g/L，氯化镁0.3-1.0g/L，所述木糖母液的总糖浓度为50-80％(W:V)。作为本发明的进一步说明，分批补料发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液初始总糖30-40g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，碳酸氢钠2-10g/L，氯化钙0.3-1.0g/L，氯化镁0.3-1.0g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为200-300g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为30-35g/L，所述木糖母液的总糖浓度为50-80％(W:V)。作为本发明的进一步说明，所述发酵培养基的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉中的一种或几种以任意比例混合。作为本发明的进一步说明，所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠中的一种或几种以任意比例混合，总浓度为20-80g/L。作为本发明的进一步说明，分批发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液总糖40g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾6g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.6g/L，氯化镁0.7g/L，所述木糖母液的总糖浓度为60％(W:V)。作为本发明的进一步说明，分批补料发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液初始总糖40g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为300g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为35g/L，所述木糖母液的总糖浓度为80％(W:V)。与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：1、本发明利用工业废弃物木糖母液代替昂贵的葡萄糖或者粮食作物作为碳源发酵生产丁二酸，一方面节约了大量的粮食，保障我国粮食安全，降低生产成本，另一方面实现了木糖母液高效资源化利用，对资源的优化和环境保护方面具有重要的意义。2、本发明以木糖母液为原料发酵生产丁二酸，不需要进行脱毒处理，也不需要配合其他碳源共同发酵，生产方法简单、高效，丁二酸产量最高可达95g/L，丁二酸产率最高为85％。附图说明图1为发酵培养基中不同氮源发酵产丁二酸及其副产物的产量图。具体实施方式以下是产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO:M2016396的选育、鉴定、利用木糖母液发酵生产丁二酸的具体实施例。实施例1产琥珀酸放线杆菌的选育和鉴定1、产琥珀酸放线杆菌的定向进化选育的方法为：先利用10g/L的甘油替换种子液的葡萄糖为碳源作为定向进行的培养基，接种后放置于厌氧培养箱，37℃培养12-18h进行传代，培养7-10天后甘油浓度增加至20g/L，依次类推，大约驯化90天后，培养基的甘油浓度可提高至80g/L，选育获得一株产琥珀酸放线杆菌PZ，该菌株可在甘油浓度80g/L培养集中生长良好。同时发现产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ可以在100g/L的木糖母液中生长较好，并可以发酵产高浓度丁二酸。2、将上述选育得到的产琥珀酸放线杆菌PZ进行16SrDNA基因鉴定，以及按照《伯杰式细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，鉴定结果为：产琥珀酸放线杆菌PZ与菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS137相似度为100％，与菌株产琥珀酸放线杆菌130Z相似度为99.5％。经过形态及生理、生化鉴定：产琥珀酸放线杆菌PZ属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧，细胞呈短杆状，无鞭毛，无芽孢，不运动，也不产生孢子，能利用常见的大多数碳源产丁二酸。由以上鉴定结果，可以认定产琥珀酸放线杆菌PZ属于巴斯德菌属科(Pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)。现已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016396，保藏日期为2016年7月19日。实施例2一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按5％(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满N2的环境中，转速100r/min，温度为36℃，分批发酵30h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液总糖30g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L，所述木糖母液的总糖浓度为50％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉以任意比例混合。所述pH调节剂为碱式碳酸镁和碳酸钠以任意比例混合，总浓度为20g/L。本实施例丁二酸的产量为22.73g/L，产率为75.77％。丁二酸产率(％)定义为：每消耗1g木糖所产生丁二酸的克数。本发明分析方法：样品处理：发酵液在室温下12000r/min，离心10min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液丁二酸及残还原糖浓度。有机酸测定：HPLC法，戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：RezexROA-organicacid300×7.8mm，流动相2.5mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。生物量测定：采用分光光度计(DU800UV/VISSpectrophotometer,Beckman,USA)在660nm进行测定，样品先用0.2MHCl进行处理，溶解所含的MgCO3，12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。实施例3一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按15％(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满CO2的环境中，转速200r/min，温度为38℃，分批发酵72h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液总糖100g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，所述木糖母液的总糖浓度为80％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。本实施例丁二酸的产量为33.65g/L，产率为33.65％。实施例4一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中36℃培养18h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按10％(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满CO2的环境中，转速200r/min，温度为37℃，分批发酵40h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液总糖40g/L，氮源12g/L，磷酸二氢钾6g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.6g/L，氯化镁0.7g/L，所述木糖母液的总糖浓度为60％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆。所述pH调节剂是碱式碳酸镁，总浓度为50g/L。本实施例丁二酸的产量为33.72g/L，产率为84.30％。实施例5一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按5％(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满N2的环境中，转速100r/min，温度为36℃，分批补料发酵30h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液初始总糖为30g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为200g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为30g/L，所述木糖母液的总糖浓度为50％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆和大豆粉以任意比例混合。所述pH调节剂为碱式碳酸镁和氢氧化镁以任意比例混合，总浓度为20g/L。本实施例丁二酸的产量为23.01g/L，产率为76.70％。实施例6一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按15％(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满CO2的环境中，转速200r/min，温度为37℃，分批补料发酵72h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液初始总糖为40g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为300g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为35g/L，最终发酵液的总糖浓度达到120g/L，所述木糖母液的总糖浓度为80％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉和花生饼粉以任意比例混合。所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。本实施例丁二酸的产量为94.34g/L，产率为78.62％。实施例7一种利用木糖母液发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中36℃培养18h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按10％(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满CO2的环境中，转速200r/min，温度为37℃，分批补料发酵70h，即得丁二酸。所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述发酵培养基的成分及浓度为：木糖母液初始总糖为35g/L，氮源12g/L，磷酸二氢钾6g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.8g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为250g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为35g/L，最终发酵液的总糖浓度达到100g/L，所述木糖母液的总糖浓度为65％(W:V)。所述发酵培养基的氮源为玉米浆、。所述pH调节剂是碱式碳酸镁，浓度为60g/L。本实施例丁二酸的产量为79.56g/L，产率为79.56％。实施例8产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO:M2016396木糖母液耐受性试验将不同编号的产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，再按照5％(V/V)接种量接入含不同浓度的木糖母液的种子培养基中，培养24h后，观察不同编号产琥珀酸放线杆菌的生长状况，结果如表1。表1不同产琥珀酸放线杆菌菌株木糖母液耐受性试验总糖(g/L)A.succinogenesPZA.succinogenesGXAS137A.succinogenes130Z30+++++++++40+++++++++50++++++++60++++++70++++-80+++--90++--100++--其中：+++表示生长良好，++表示生长较好，+表示略有生长，—表示无法生长。从表1可以看出：产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ对木糖母液的耐受性较好，在木糖母液初始总糖为100g/L时，仍生长较好，而菌株A.succinogenesGXAS137和A.succinogenes130Z无法生长。实施例9最适木糖母液初始总糖浓度试验将产琥珀酸放线杆菌PZ菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到液态种子。按8％(V/V)的接种量接入装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，分别添加不同总糖浓度的木糖母液，再添加酵母粉14g/L、磷酸二氢钾6g/L、碳酸氢钠6g/L、氯化钙0.7g/L、氯化镁0.8g/L，添加50g/L的碱式碳酸镁调节pH在6.5-7.0，置于培养箱中37℃分批发酵60h。实验结果如表2。表2不同总糖浓度的木糖母液对丁二酸产量的影响从表2可以看出：不同总糖浓度的木糖母液对分批发酵生产丁二酸产量影响较大，初始总糖浓度为70g/L时，丁二酸的产量最高，达到48.06g/L。实施例10不同氮源发酵试验按照实施例9中产琥珀酸放线杆菌PZ发酵木糖母液产丁二酸的方法，初始总糖浓度为70g/L，添加不同种类的氮源，总氮添加量为15g/L，对照不添加任何氮源，接种量为8％(V/V)，接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，置于培养箱中37℃分批发酵60h，丁二酸及主要副产物含量，结果见图1。由图1可以看出：木糖母液不添加氮源进行丁二酸发酵时，丁二酸产量只有2.36g/L，最适氮源为酵母粉和玉米浆，丁二酸产量分别为46.68g/L、45.37g/L，其次为蛋白胨产量为29.98g/L、牛肉膏产量为22.08g/L，尿素为氮源时效果较差，丁二酸产量只有2.57g/L。考虑到丁二酸生产成本及产业化生产等因素，选取玉米浆为氮源，与酵母粉为氮源相比，可显著降低丁二酸的生产成本。当前第1页1 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