一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法与流程

本发明涉及一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法，属于分子标记技术领域。

背景技术：

绿绒蒿属是罂粟科(Papavevaceae)中绿绒蒿属(MeconpsisVig.)植物的总称，为一年生或多年生草本植物。中国产38种，约占全属总数的80％，主要分布于四川西南部、云南西北部、西藏东南部和东喜马拉雅南坡，其中西藏和云南分布种类最多，资源十分丰富。绿绒蒿属植物花大、且颜色丰富，是著名而有巨大育种潜力的高山野生花卉，为云南八大名花之一，名扬海内外。同时也是传统藏医药用植物，有清热解毒、利尿、消炎、止痛等功效。我国西南高山及喜马拉雅山山脉为绿绒蒿属植物的分布中心，种内分化剧烈，遗传多样性丰富。但该属内种的划分仍存在争议，结论存在不一致。属内亲缘关系比较混乱。因此，该属植物SSR引物的开发，将为其遗传多样性、品种鉴定，亲缘关系，以及完善该属植物的分类系统，种质资源收集、保存和利用等奠定基础。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。常用于遗传多样性研究的分子标记主要有等位酶、随机扩增多态DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)、简单重复序列区间(ISSR)、PCR特异扩增ITS序列和扩增片段长度多态性(AFLP)等技术。简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强、操作便利、并在基因组中分散分布等优点已成为最受人们欢迎的分子标记之一，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。在许多领域广泛应用。但SSR标记的主要缺点是首先要从该物种中获取重复序列两侧的序列信息，并设计引物，而后才能被利用。

SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)，EST-SSR标记源于基因的转录区，与gSSR标记相比，其多态性可能与基因功能直接相关，因此，比gSSR标记具有更高通用性，更经济，更高效率。随着转录组测序技术的日益成熟和测序成本的下降，利用二代测序技术可以对全基因组范围内的转录本进行大规模的高通量测序，并能产生较之EST测序更为海量的转录组数据，这为功能基因组SSR标记的开发提供了更丰富和极有价值的可利用资源，也是快速、高效的获得SSR引物的最便捷的途径。

目前绿绒蒿属尚无全基因组序列信息，已开发的SSR引物数量较少。对于无参考基因组的转录组分析，可先将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本为参考序列，进行后续分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法，利用第二代高通量测序技术获得绿绒蒿转录组序列信息，批量开发SSR引物，将会对绿绒蒿植物重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法，具体步骤如下：

(1)构建转录组文库：采用Trizol提取绿绒蒿花瓣总RNA，按照“TruSeq RNA Sample Preparation Guide”对纯化后的总RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成，利用AMPure XP beads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库；所建测序文库经0Fluorometer和Agilent2100系统检测合格后，在IlluminaHiSeq2000测序仪上完成双端测序；

(2)测序完成后，利用软件Trinity将测序序列拼接成一个完整的转录组，取每条基因最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析；

(3)采用软件MISA1.0对上述Unigene进行SSR检测，进行单碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复SSR位点和混合SSR位点搜索；

(4)采用软件Primer3进行SSR引物设计，并鉴定引物的多态性。SSR引物设计使用的参数为：引物长度18-22bp，GC含量为30％-70％，退火温度为50-70°C，Tm55-65℃，产物大小100-300bp。

(5)SSR引物对采集自不同地理位置的8种绿绒蒿的DNA多态性进行鉴定。

(6)从开发的13356对SSR引物中合成适合扩增，且不重复的96对SSR引物。

(7)选取特定样品进行第一轮引物筛选，具体为：

(7a)选取差异性大的样品8个，分别是全缘叶绿绒蒿、多刺绿绒蒿、总状绿绒蒿、大花绿绒蒿、绿绒蒿蓝花铃蔻、绿绒蒿紫花铃蔻、秀丽叶绿绒蒿和横断山绿绒蒿；用选取的不同引物进行扩增，体系如下：酶mix：7.5ul；正向引物加接头：1ul，浓度10P；反向引物：1ul，浓度10P；DNA模板：1ul；ddH2O：4.5ul；扩增条件：94℃5min，94℃30S，63℃30S，共30个循环；72℃20S，72℃10min，4℃；

(7b)将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用2ul样品+6ul溴酚蓝，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图；

(7c)根据胶图确定是否扩增出目的DNA片段，选取了21对扩增条带较好的引物准备二次扩增。

(8)二次扩增及二次筛选：用带荧光的接头引物和反向引物对一次扩增的产物进行二次扩增，扩增体系及条件与一次相同；将上步获得的PCR产物进行电泳鉴定，获取鉴定胶图；通过胶图确定模板浓度，加水稀释到电泳所需浓度；上机毛细管电泳及结果获取：(8a)将HiDi与500bp的内标按130：1混合，配成mix；(8b)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ulmix；(8c)对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000rpm即停；(8d)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；(8e)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀；(8f)上3730测序仪进行毛线管电泳；(8g)获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点。

(9)位点分析和筛选：共筛选出21对引物，分别如下：

该发明的有益效果在于：本发明通过获得的转录组序列，极大地增加了用于引物开发的原始数据；采用生物信息学途径可以大批量开发SSR标记，大大提高了开发的效率，而且本发明所提供的SSR标记引物是稳定存在的新标记，可直接用于绿绒蒿属植物的相关研究，解决了绿绒蒿属SSR引物少问题，为利用SSR分子标记进行绿绒蒿属遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。

附图说明

图1、本发明实施例中的不同种绿绒蒿的DNA胶图。

图2、本发明实施例中的第一轮引物筛选的鉴定胶图。

图3、本发明实施例中的第二轮引物筛选的鉴定胶图。

图4、本发明实施例中的94号引物对4种绿绒蒿的毛细管电泳检测图。

图5、本发明实施例中的52号引物对3种绿绒蒿的毛细管电泳检测图。

图6、本发明实施例中的部分引物对不同绿绒蒿的相关分析数据。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。

实施例

本实施例中的基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法，具体步骤如下：

(1)构建转录组文库：采用Trizol提取绿绒蒿花瓣总RNA，按照“TruSeq RNA Sample Preparation Guide”对纯化后的总RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成，利用AMPureXP beads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXP beads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库；所建测序文库经0Fluorometer和Agilent2100系统检测合格后，在IlluminaHiSeq2000测序仪上完成双端测序；共检测出6，614个SSR分布于17，311个Unigene中。

(2)测序完成后，利用软件Trinity将测序序列拼接成一个完整的转录组，取每条基因最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析；

(3)采用软件MISA1.0对上述Unigene进行SSR检测，进行单碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复SSR位点和混合SSR位点进行搜索；

(4)采用软件Primer3进行SSR引物设计，并鉴定引物的多态性。SSR引物设计使用的参数为：引物长度18-22bp，GC含量为30％-70％，退火温度为50-70°C，Tm55-65℃，产物大小100-300bp。

(5)SSR引物对采集自不同地理位置的8种绿绒蒿的DNA多态性进行鉴定。图1为不同种绿绒蒿的DNA胶图。

(6)从开发的13356对SSR引物中合成适合扩增，且不重复的96对SSR引物。

(7)选取特定样品进行第一轮引物筛选，具体为：

(7a)选取差异性大的样品8个，分别是全缘叶绿绒蒿、多刺绿绒蒿、总状绿绒蒿、大花绿绒蒿、绿绒蒿蓝花铃蔻、绿绒蒿紫花铃蔻、秀丽叶绿绒蒿和横断山绿绒蒿；用选取的不同引物进行扩增，体系如下：酶mix：7.5ul；正向引物加接头：1ul，浓度10P；反向引物：1ul，浓度10P；DNA模板：1ul；ddH2O：4.5ul；扩增条件：94℃5min，94℃30S，63℃30S，共30个循环；72℃20S，72℃10min，4℃；

(7b)将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用2ul样品+6ul溴酚蓝，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图；图2为第一轮引物筛选的鉴定胶图。

(7c)根据胶图确定是否扩增出目的DNA片段，选取了21对扩增条带较好的引物准备二次扩增。图3为第二轮引物筛选的鉴定胶图。

(8)二次扩增及二次筛选：用带荧光的接头引物和反向引物对一次扩增的产物进行二次扩增，扩增体系及条件与一次相同；将上步获得的PCR产物进行电泳鉴定，获取鉴定胶图；通过胶图确定模板浓度，加水稀释到电泳所需浓度；上机毛细管电泳及结果获取：(8a)将HiDi与500bp的内标按130：1混合，配成mix；(8b)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ulmix；(8c)对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000rpm即停；(8d)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；(8e)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀；(8f)上3730测序仪进行毛线管电泳；(8g)获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点。

4位点分析和筛选：(1)图4为94号引物对4种绿绒蒿的毛细管电泳检测图，4种绿绒蒿分别为大花绿绒蒿(M.grandis)，横断山绿绒蒿(M.pseudointegrifolia)，全缘叶绿绒蒿(M.integrifolia)，绿绒蒿蓝花铃蔻(M.‘lingholm’)。图示特异性高，多态性好，则该位点可用。(2)图5为52号引物对3种绿绒蒿的毛细管电泳检测图，3种绿绒蒿分别为全缘叶绿绒蒿(M.integrifolia)，绿绒蒿紫花铃蔻(M.lingholm‘purple’)，多刺绿绒蒿(M.horridula)。图示，若结果只有一种片段大小，则引物的多态性不理想。该引物舍弃。

(9)根据上述方法，共筛选出21对引物。每对引物单独分析并分析出数据，表格如下。Allele1表示该样品该位点的第一个片段，Allele2表示第二个片段。其余数据为位点的附带数据，可作为判断位置指导。图6为部分引物对不同绿绒蒿的相关分析数据截图。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。