一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用与流程

本发明属农业生物领域，特别涉及一种去除农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解菌固定化微球及其制备方法和应用。

背景技术：

邻苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，PAEs)是一类典型的内分泌干扰物，邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl Phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate，DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl Phthalate，DEHP)等6种邻苯二甲酸酯化合物被美国环保局和我国环境监测总站列为优先控制污染物。作为重要的化工产品，邻苯二甲酸酯在塑料制品生产过程被作为添加剂大量使用。我国设施农业的快速发展使塑料制品被广泛应用，随着塑料的老化邻苯二甲酸酯会缓慢释放并最终进入土壤，导致其成为农田土壤中最常被检出的有机污染物之一，尤其在北方设施菜地、南方菜园土壤中邻苯二甲酸酯含量甚至已经达到几十mg·kg^-1。其中，DBP和DEHP是土壤中检出率最高且含量较高的2种邻苯二甲酸酯类化合物，由于DBP的分子摩尔质量(278.4g·mol^-1)和logKow(4.45，Kow为辛醇-水分配系数)均小于DEHP(分别为390.6g·mol^-1、7.50)，而水溶解度(11.2mg·L^-1)高于DEHP(0.003mg·L^-1)，导致土壤中DBP的微生物利用率相对较高，降解速率高于DEHP，因此，去除土壤中残留的DEHP难度要大于DBP。大量研究表明，土壤邻苯二甲酸酯污染不仅会影响农作物的生长发育和产量品质，而且会造成农产品中邻苯二甲酸酯的累积从而通过食物链对人体健康造成潜在的危害，因此，修复农田土壤邻苯二甲酸酯污染对保护我国农田土壤质量，保障农产品安全、生态安全和人体健康具有十分重要的现实意义。

目前，农田土壤邻苯二甲酸酯污染修复技术研究仍处于起步阶段。现有的土壤有机污染修复主要采用物理修复、化学修复和生物修复的方法。其中，生物修复尤其是微生物修复技术由于具有安全、高效、无二次污染、经济效益好等优点，被人们认为是进行有机污染土壤修复最有效、最有前途的一种污染治理技术。国内外学者对邻苯二甲酸酯降解菌进行了筛选，具有一定的降解效果。在实际应用中，由于降解过程中污染物的成分更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大，游离菌表现出单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差等特点。采用微生物固定化技术对降解菌进行固定，可以避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，提高单位体积介质中微生物细胞密度。另外，降解菌固定化微球的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂的土壤环境中也可以稳定地发挥高效能。因此，通过吸附包埋等固定化方法将土壤中筛选出的邻苯二甲酸酯高效降解菌进行固定化后形成微球施用于污染土壤将会极大的提高农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解率，更好地发挥外源降解菌的作用。

专利201510418972.7公开了一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用，专利以海藻酸钠、膨润土、壳聚糖和氯化钙为固定化材料制备微球，修复效果为28天土壤中DBP降解率约80％。然而其仅是针对土壤DBP污染问题而且对土壤中DBP的降解效率较低，无法高效应用于DBP和DEHP复合污染土壤中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种去除农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解菌固定化微球及其制备方法，能够应对复合污染土壤，不仅能够高效去除DBP，还能有效去除更难降解的DEHP。

一种PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其具体步骤如下：

(1)菌悬液的制备：将PAEs降解菌培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD₆₀₀＝0.8-1.2；所述PAEs降解菌为恶臭假单胞菌RXX-01，分类名为Pseudomonas putida，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224；所述生理盐水为已灭菌的0.9％NaCl溶液；

(2)混合菌液的配备：用无菌水配制海藻酸钠溶液，将活性炭加入到海藻酸钠溶液中混匀得混合液，向混合液中加入步骤(1)的菌悬液混匀得混合菌液；各组份所占重量比分别为：菌悬液15-25％，海藻酸钠2-3％，活性炭2-4％；

(3)固定化微球的制备：用无菌水配制20-30g/L的氯化钙溶液，并将混合菌液逐滴滴入氯化钙溶液中，交联20-30h后制备得到固定化微球；混合菌液与氯化钙溶液的体积比为1:1.5～1:2。

海藻酸钠在水溶液中电解产生海藻酸阴离子，氯化钙产生二价钙离子，钙离子与海藻酸阴离子发生静电作用而吸引，交联形成不溶于水的海藻酸钙。

进一步地，混合菌液各组份所占重量比分别为：菌悬液20％，海藻酸钠3％，活性炭2％；用于制备固定化微球的氯化钙溶液的浓度为25g/L。

进一步地，所述海藻酸钠、活性炭、氯化钙均在使用前灭菌。

进一步地，所述步骤(1)中恶臭假单胞菌RXX-01的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组份为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL。

进一步地，所述步骤(1)中恶臭假单胞菌RXX-01的培养条件为：25-30℃、pH6.5-7.5、150-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选28℃、pH7.0、170r/min恒温震荡培养24h。

进一步地，所述步骤(1)中清洗菌体的方法为：将恶臭假单胞菌RXX-01的培养液于3500-4500rpm离心5-15min，弃上清液，用灭菌的生理盐水重悬沉淀后，重复离心及重悬沉淀的步骤1-3次。

进一步地，所述步骤(3)中采用蠕动泵将混合菌液滴入氯化钙溶液中，流量控制在6mL/min。

进一步地，所述步骤(3)制备好的固定化微球用无菌蒸馏水冲洗干净，4℃保存。

本发明还提供了以上述方法制备得到的PAEs降解菌的固定化微球。

此外，本发明还提供了所述PAEs降解菌的固定化微球在降解农田土壤邻苯二甲酸酯中的应用。

进一步地，所述PAEs降解菌的固定化微球在降解农田土壤中邻苯二甲酸酯时的用量为0.1-1kg/kg干土。

本发明的优点在于：

(1)本发明采用活性炭、海藻酸钠和氯化钙为原材料制备固定化微球，即以活性炭为载体材料，通过海藻酸钠进行包埋固定邻苯二甲酸酯高效降解菌制备得到微球，制备方法操作简单。

(2)降解菌的固定化效果好，对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效率高，适宜于大面积的农田土壤邻苯二甲酸酯污染原位修复。固定化微球培养10天后对土壤中DBP和DEHP的降解率分别达到94.0％和34.5％；相比之下，空白对照组DBP和DEHP的降解率分别为27.9％和5.8％，游离菌处理组介于两组之间，DBP和DEHP的降解率分别达到91.2％和25.4％。

附图说明

图1恶臭假单胞菌RXX-01的划线培养结果；

图2不同条件下制备的24种固定化微球对土壤中DBP和DEHP的降解率；

图3实施例4制备的固定化微球的形态图；

图4实施例4制备的固定化微球对土壤中DBP的降解率；

图5实施例4制备的固定化微球对土壤中DEHP的降解率。

生物材料样品保藏信息：

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)RXX-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月1日，保藏编号为CGMCC No.13224。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中所用到的培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL。

无机盐培养基：K₂HPO₄·3H₂O：1g，NaCl：1g，NH₄NO₃：0.5g，MgSO₄·7H₂O：0.4g，CaCl₂：0.1g，FeCl₃·6H₂O：0.01g，加水定容至1000mL。

实施例1邻苯二甲酸酯降解菌的筛选与鉴定

(1)邻苯二甲酸酯降解菌的筛选

在青岛市郊区的蔬菜大棚中采集一定量的土样，准确秤取10g新鲜土样，加入盛有90mL蒸馏水和10mL玻璃珠的三角瓶中，置于摇床中30℃、175rpm振荡混匀，静置待用。

按1％的接种量从以上混合液中取1mL，加入到100mL初始浓度为100mg/L邻苯二甲酸酯(DBP、DEHP均为50mg/L)的无机盐培养液中，置于摇床中30℃、175rpm避光条件下进行振荡培养7d。每次转接逐渐增加邻苯二甲酸酯浓度(包括200mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L)，每七天作为一个驯化周期转接一次，共经过6个驯化周期持续进行培养。

取100μL终期驯化液，涂布于2000mg/L邻苯二甲酸酯(DBP和DEHP均为1000mg/L)的无机盐固体平板上，然后置于30℃生化培养箱中静置培养。待长出肉眼可见菌落后，观察其生长特征，筛选出长势最好的菌株，挑取单菌落将其反复划线接种于新的无机盐固体培养基上，直至镜检纯化为止。

(2)邻苯二甲酸酯降解菌的鉴定

①对筛选到的单菌落RXX-01进行形态观察，其培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、隆起形状、透明度、颜色、迁移性、质地、形态、边缘特征及光泽度等。RXX-01菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养数天后，菌落呈圆形，橘红色，黏质不透明，边缘整齐，表面隆起，湿润光滑，直径一般在0.5～1.0mm(见图1)。

②将RXX-01菌种送往上海生工生物股份有限公司进行分子生物学鉴定，其16SrDNA序列如序列表中SEQ ID No.1所示，经序列比对，其与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(GenBank登录号AY647158)的同源性达到100％。综合菌株的形态特征及16SrDNA序列分析结果，初步鉴定菌株RXX-01为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

实施例2恶臭假单胞菌RXX-01对邻苯二甲酸酯降解能力检测

将RXX-01菌株的培养液按照1％的接种量，接种于DBP和DEHP浓度均为50mg/L的无机盐培养基(50mL)中，在25℃、150r/min的条件下振荡培养。培养3天后测定培养液中DBP与DEHP浓度，并计算DBP与DEHP的降解率。结果显示DBP的降解率为90.8％，DEHP的降解率为54.7％，表明RXX-01菌株对邻苯二甲酸酯具有较高的降解能力。

降解率计算公式：降解率(％)＝((邻苯二甲酸酯初始浓度—邻苯二甲酸酯残留浓度)/邻苯二甲酸酯初始浓度)×100％。

实施例3恶臭假单胞菌RXX-01固定化微球的制备方法

本实施例为了确定固定化材料的最优配比，选择了不同的菌液含量、海藻酸钠浓度、活性炭含量、氯化钙浓度为因素，以固定化微球对邻苯二甲酸酯的降解率为目标，优化固定化条件。

单因素实验共设置4个因素(菌悬液含量、海藻酸钠浓度、活性炭含量、氯化钙浓度)，每个因素设置6个浓度水平。其中所涉及的百分比均为质量百分比。所述的菌悬液指的是用生理盐水将菌体制成的OD₆₀₀＝1.0悬液。

在海藻酸钠浓度2％、活性炭含量3％、氯化钙浓度25g/L的条件下，设置菌悬液含量分别为0％、5％、10％、15％、20％、25％，制备不同类型的固定化微球。

在菌悬液含量15％、活性炭含量3％、氯化钙浓度25g/L的条件下，设置海藻酸钠浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％，制备不同类型的固定化微球。

在菌悬液含量15％、海藻酸钠浓度2％、氯化钙浓度25g/L的条件下，设置活性炭含量分别为0％、1％、2％、3％、4％、5％，制备不同类型的固定化微球。

在菌悬液含量15％、海藻酸钠浓度2％、活性炭含量3％的条件下，设置氯化钙浓度为10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L，制备不同类型的固定化微球。

设计好上述单因素试验后，按照以下步骤制备固定化微球：

(1)菌悬液的制备：将RXX-01菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，170r/min的条件下培养24h。取出液体培养基后，将液体分装于50mL的无菌离心管中，于4000rpm下离心10min。弃去上清液后，用灭菌后的生理盐水重悬后再次离心，清洗两次后，用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使其OD₆₀₀＝1.0。

(2)混合菌液的配备：用无菌水配制海藻酸钠溶液，将活性炭加入到海藻酸钠溶液中混匀得混合液，向混合液中加入步骤(1)的菌悬液混匀得混合菌液；

(3)固定化微球的制备：用无菌水配制氯化钙溶液，并用蠕动泵抽取混合菌液逐滴滴入氯化钙溶液中，混合菌液与氯化钙溶液的体积比为1:1.5，交联20-30h后制备得到固定化微球，用无菌蒸馏水冲洗干净，4℃保存备用。

将不同条件下制备的24种固定化微球在同等条件下分别施加到邻苯二甲酸酯污染土壤中(DBP和DEHP的含量分别为50mg/kg和50mg/kg)，固定化微球的施加量为0.5kg/kg干土，同等条件培养5天后，测定各固定化微球处理的土壤中邻苯二甲酸酯的残留量。不同条件下制备的固定化微球对土壤中DBP和DEHP的降解率如图2所示。

依据固定化微球对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果，确定菌悬液含量的最佳范围是15-25％，海藻酸钠浓度的最佳范围是2-3％，活性炭含量的最佳范围是2-4％，氯化钙浓度的最佳范围是20-30g/L。

利用单因素试验结果进一步进行正交试验确定降解菌固定化的最佳条件。固定化微球正交试验设计及其结果分别见表1和表2。

表1.固定化微球正交试验设计表

表2.固定化微球正交试验结果

由表2中极差R的值可知，各因素对实验结果的影响程度从大到小依次为因素B>因素C>因素A>因素D，确定制备固定化微球的最佳条件为A₂B₃C₁D₂，即菌悬液含量为20％，海藻酸钠浓度为3％，活性炭含量为2％，氯化钙浓度为25g/L，该条件下制备的固定化微球对PAEs的总降解率为63.1％。

实施例4固定化微球对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果

根据正交试验的结果得出固定化材料的最优配比及其制备过程，步骤如下：

(1)菌悬液的制备：将菌种RXX-01接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，170r/min的条件下培养24h。取出液体培养基后，将液体分装于50mL的无菌离心管中，于4000rpm下离心10min。弃去上清液后，用灭菌后的生理盐水重悬后再次离心，清洗两次后，用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使其OD₆₀₀＝1.0。

(2)混合菌液的配备：称取3g已灭菌的海藻酸钠溶于75mL无菌水中，搅拌均匀，得海藻酸钠溶液。称取2g已灭菌的活性炭于海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，得到混合液。将步骤(1)中所制备的菌悬液移取20mL于上述混合液中，搅拌均匀，得到混合菌液。

(3)固定化微球的制备：称取3.75g已灭菌的氯化钙溶于150mL无菌水中，制备成25g/L的氯化钙溶液。用蠕动泵抽取步骤(2)中所得的混合菌液，将其缓慢滴入到氯化钙溶液中，交联24h后制备得到固定化微球，用蒸馏水冲洗干净，将其放入4℃的冰箱中备用。

固定化微球成球效果好，形态均匀，照片如图3所示，全部用于下面的降解实验。

分别测试游离的菌悬液及本实施例中制备的固定化微球对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果，设空白对照。

每份称取200g污染土壤样品(邻苯二甲酸酯为DBP和DEHP，DBP和DEHP的含量分别为100mg/kg和100mg/kg)于棕色样品瓶中。游离菌组：向土壤样品中加入OD600＝1.0的菌悬液20mL(菌悬液接种量为10％)；固定化微球组：向土壤样品中加入上述制备得到的所有的固定化微球；空白对照组：不添加游离菌和固定化微球。再向各组中加入灭菌去离子水，使土壤含水量为田间最大持水量的60％，封口后放入25℃生化培养箱中暗培养，分别在培养到第3、5、10天时取样进行分析。

经过10天的室内培养，在施加固定化微球处理组中，DBP和DEHP的降解率分别达到94.0％和34.5％；相比之下，空白对照组DBP和DEHP的降解率分别为27.9％和5.8％，游离菌处理组介于两组之间，DBP和DEHP的降解率分别达到91.2％和25.4％(图4～图5)。说明本发明的固定化微球能够显著提高对PAEs的降解率，特别是对DEHP的降解率。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学、宁夏大学

<120> 一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 1

ggcctacaca tgcaagtcga gcggatgacg ggagcttgct ccttgattca gcggcggacg 60

ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggaca acgtttcgaa aggaacgcta 120

ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga 180

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gttaagttgg atgtgaaagc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa actggcaagc 600

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agagatggat tggtgccttc gggaactctg acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag 1080

cacgttatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca 1200

gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tctcacaaaa ccgatcgtag tccggatcgc 1260

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agaagtagct agtctaacct tcgggaggac ggttaccacg gtgtgattca tgactggggt 1440

gaagtcg 1447