一种螺环化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种螺环化合物及其制备方法和应用，属于甾族化合物技术领域。

背景技术：

甾体类药物广泛用于医药工业领域，具有多种药理活性。雄烯二酮类衍生物属于芳香酶抑制剂中的甾体类药物，该类药物与芳香化酶内源性作用底物雄烯二酮和睾酮结构相似，通过共价键形式与其不可逆结合，引起酶永久性的失活，从而抑制雌激素的合成，依西美坦、阿那曲唑等是目前主要的临床用药。依西美坦(ⅵ，exemestane)化学名为6-亚甲基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，是由意大利公司pharmacia&upjoin研究开发的一种不可逆的芳香酶抑制剂，1999年首次在英国上市。其分子式为c20h24o2，结构式如式ⅵ所示：

其依靠与甾体芳香酶自然底物—雄烯二酮的相似结构，不可逆的结合其活性部位，使之永久灭活，从而使体内激素水平迅速、持续地降低，以达到治疗目的。us4808616报道了6-亚烷基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮衍生物的制备方法及其在药物化学方面的应用。cn101312743a公开了(s)-6-甲基氧杂烷基依西美坦化合物用于抑制癌细胞或者肿瘤细胞生长的方法。

可以预见，具有雄烯二酮类似结构的化合物很可能具有药理活性，进一步研发新型有效的治疗药物具有重大的意义。

基于此，做出本申请。

技术实现要素：

针对现有抗肿瘤技术中所存在的上述缺陷，本申请首先提供一种新的螺环化合物，该化合物作为雄烯二酮类的衍生物，具有抗肿瘤活性。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

一种螺环化合物，该螺环化合物为雄烯二酮衍生物及其水合物、前药以及药学上可接受的盐，其结构式为：

为方便下文描述，将其记作ⅰ。

体外抗肿瘤试验表明：该螺环化合物具有明显的抑制肿瘤的效果。试验所用的细胞株为国际通用的肿瘤细胞株—人肝癌细胞hepg2，人卵巢癌细胞sk-ov-3。

同时，本申请还提供了一种前述螺环化合物的制备方法，将6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮(iv)溶解后，滴加到浓盐酸中，在低于15℃下反应2小时，然后过滤得到粗品，粗品可通过柱层析等方法提纯得到精品螺环化合物(ⅰ)。

上述反应过程可表示为：

进一步的，作为优选：

所述的溶剂为乙醇，反应中所用的乙醇量为1500-2000毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。更优选的，所述的乙醇量为1600-1800毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。

所述的浓盐酸浓度≥20％，优选的，所述的浓盐酸浓度为36％，工业品。

所述的浓盐酸用量为500-1000ml/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，优选的，所述的浓盐酸用量为600-700毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。

所述的滴加时温度为0-20℃，反应温度为0-20℃，更优选的，所述的滴加温度为5-15℃，反应温度为5-15℃；滴完后反应时间为1-3小时，更优选的，所述的滴加后反应时间为2-3h。

本申请所提供的螺环化合物具有明显的抑制肿瘤的效果，实验方法采用国际通用的mtt法进行。

本申请还提供了一种药物组合物，包括作为活性成分的螺环化合物和/或其水合物、前药以及药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。上述螺环化合物配以药用辅料以及药学上或生理学上可接受的载体，以常规的制备工艺制备成药剂学上的任何一种剂型。

本发明化合物具有较强的抑制癌细胞的能力，为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，具有重要意义。

附图说明

图1为本申请的实施例1制备条件下的产物液质联用图；

图2为本申请实施例1制备条件下产物的核磁图(氢谱)；

图3为本申请实施例1制备条件下产物的核磁图(碳谱)；

图4为本申请实施例1制备条件下产物的核磁图(碳谱，局部放大)；

图5为本申请实施例1制备条件下产物的核磁图(dept135)；

图6为本申请实施例1制备条件下产物的核磁图(dept135，局部放大)。

具体实施方式

实施例中使用的分析仪器与设备：液质联用，thermolcq-fleet，柱子：hypersilgold150*2.1，电喷雾电离源(esi)；核磁共振仪，avancedmxⅱⅰ400m(tms内标，bruker公司)；高效液相色谱仪：agilenttechnologies1200series；红外光谱仪，nicolet360ft-ir(美国尼高力仪器公司)。

本实施例中，原料6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮(iv)的制备方法可以参照曹瑞伟等人的专利(cn105017370)，其反应合成过程可描述如下：

实施例1：螺环化合物ⅰ的制备

将40.7克化合物iv(0.1摩尔)溶解在170毫升乙醇中，于0-5℃下滴加到80毫升36％浓盐酸中，滴完后在5-10℃反应2小时，过滤得到土黄色固体，烘干后23.5克，收率78.9％。粗品可通过柱层析(流动相：乙酸乙酯：石油醚＝1：3)等方法提纯得到精品，提纯后为黄色固体，熔点180-183℃。

产物结构表征：

ms：596

¹³cnmr(δ,ppm,100mhz,cdcl3)：

220.66，220.26(c17，c17’)；199.86，196.15(c1’，c1)；182.12，166.60(c3’，c3)；137.41，122.68(c2，c2’)；

55.25(ch，c10’)；50.98(ch，c10)；50.41(ch，c14’)；48.47(ch，c14)；47.50，47.33(ch0，c13,13’)。

42.74(ch0，c7’，螺环碳)：

40.22(ch0，c4)；38.59(ch0，c4’)；38.31(ch2)；37.48(ch2)；36.22(ch2)；35.78(两个ch2，c5,5’)；35.34(ch)；34.75(ch2)；34.32，34.27(两个ch2，c16,16’)；33.65(一个ch和一个ch2叠加，c6’)；31.23(ch2，c12’)；31.10(ch2，c12)；30.27(ch)；24.82(ch2)；22.25(ch3，c18’)；21.73，21.66(两个ch2，c15,15’)；20.40，20.33(两个ch2，c11,11’)；18.22(ch3，c18)；13.71(两个ch3，c19,19’)。

实施例2：不同条件下的反应制备式(i)所示螺环化合物

将40.7克化合物iv(0.1摩尔)溶解在一定量乙醇中，于一定温度下滴加到一定量的36％浓盐酸中，滴完后一定温度范围内反应一定时间，过滤得到产物，烘干后称重，计算产率，结果如表1。

表1不同制备条件下的产物收率

上述实施例2中各序号所对应条件下所得到的产品核磁数据与实施例1相同。

对上述表1的收率、物料比、合成条件进行综合考量，结论如下：

(1)乙醇添加量的影响：本申请中，乙醇作为溶剂，将直接影响产品的反应效率和反应速率。相同条件下，对乙醇添加量进行测试，结果表明，当乙醇添加量低于1500ml/mol原料(化合物iv，即：6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，下同)，由于有机溶剂量过低，导致反应体系中有机物的溶解不充分，无法满足反应的需求，因而收率低于30％(具体参见表1中序号1-2)；随着乙醇添加量的增加，当其添加量超过1500ml/mol原料时，反应逐渐趋于充分，尤其是当乙醇添加量介于1500-2000ml/mol原料，特别是在1600-1800ml/mol原料时，由于原料可以实现充分溶解，因此反应得以充分进行，产物的稳定性也逐渐增加，产品品质良好，收率可到达56％以上(具体参见表1中序号3-14)；继续增加乙醇的添加量，虽然确保了原料的完全溶解，但当乙醇添加量大于2000ml/mol原料时，由于体系浓度较低，导致收率反而下降(具体参见表1中序号15-16)。因此，乙醇添加量适宜控制在1500-2000ml/mol原料，尤其是当乙醇添加量控制在1600-1800ml/mol原料时，反应效率最佳。

(2)浓盐酸添加量的影响：反应过程中，浓盐酸是反应原料之一，相同条件下，对浓盐酸添加量进行测试，结果表明，当浓盐酸添加量低于500ml/mol原料(化合物iv，即：6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，下同)，由于酸量不够，导致反应不充分，因而收率低于40％(具体参见表1中序号17)；随着浓盐酸添加量的增加，当其添加量超过500ml/mol原料时，反应逐渐趋于充分，尤其是当浓盐酸添加量介于600-800ml/mol原料时，收率较好％(具体参见表1中序号18-22)；继续增加浓盐酸的添加量，虽然酸量得到满足，但由于体系总体积增大，原料浓度降低，导致收率下降(具体参见表1中序号23-24)。因此，浓盐酸添加量适宜控制在500-1000ml/mol原料，尤其是当浓盐酸添加量控制在600-800ml/mol原料时，反应效率最佳。

(3)滴定温度和反应温度的影响：反应过程中，滴定温度影响了选择性，反应温度则会对反应活性造成影响。相同条件下，对滴定温度和反应温度进行测试，结果表明，当滴定温度低于0℃时，由于温度过低，导致反应缓慢，因而收率低于40％(具体参见表1中序号25-28)；随着滴定温度的增加，当其超过0℃时，反应逐渐趋于稳定，尤其是当滴定温度介于5-15℃时，收率较稳定(具体参见表1中序号29-35)；继续提高滴定温度，高于20℃时杂质增多，收率降低(具体参见表1中序号36-39)。

同时通过表1中的平行实验还可以看出，为方便实验条件的控制，适宜将反应温度与滴定温度相同，滴定温度适宜控制在0-20℃，反应温度适宜控制在0-20℃，尤其是当滴定温度适宜控制在5-15℃、反应温度适宜控制在5-15℃时，反应效果最佳。

(4)反应时间的影响：反应时间是反应充分与否的一个关键因素。相同条件下，对反应时间进行测试，结果表明，当反应时间低于1h时，反应不完全，收率较低(具体参见表1中序号40)；随着反应时间的增加，当其超过1h时，反应逐渐趋于充分，尤其是当反应时间介于1.5-3h时，收率较稳定(具体参见表1中序号41-44)；继续延长反应时间，收率并不增加，结果并不理想(具体参见表1中序号45-46)

实施例3：盐酸浓度对成品的影响

将40.7克化合物iv(0.1摩尔)溶解在170ml乙醇中，于10℃下滴加到60ml不同质量浓度的浓盐酸中，滴完后在10℃内反应2h，过滤得到产物，烘干后称重，对成品进行测试，结果如表2。

表2不同浓度浓盐酸对产物的影响

从表2可以看出，相同制备条件下，浓度≥20％时，制备得到成品螺环化合物，然而，对于浓度低于35％，尤其是当浓度在20-35％之间时，由于酸度不足，酸量不够的原因，导致收率较低；浓度高于37℃时，虽然收率较好，但考虑到来源困难，较难实现；而工业品盐酸浓度为36％左右，来源方便，价廉，且盐酸浓度介于35-37％时，尤其是当盐酸浓度为36％时，产品的各项指标达到最佳。

实施例4：螺环化合物的应用

体外抗肿瘤活性测定实验：

实验采用国际通用的mtt法进行，对螺环化合物ⅰ进行体外肿瘤细胞抑制活性实验：首先，在96孔细胞板上接种2×10⁴个对数生长期的人肝癌细胞hepg2或人卵巢癌细胞sk-ov-3，5个复孔，细胞贴壁后，再加入不同浓度待测样品，共设置7个药物浓度梯度(单位ug/ml)，浓度分别为：1.0，5.0，10，20，30，40和50的化合物ⅰ样品组；72小时后，于96孔板对应孔中加入5mg/ml的mtt溶液20ul，继续培养3小时，弃去孔板中上清液，加入150ul的dmso溶解，使用酶标仪检测490nm波长下的吸光值并计算待测样品对细胞生长的半数抑制浓度ic50。实验结果表明，该化合物对两种肿瘤细胞株均有明显的抑制作用，为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，具有重要意义。

人肝癌细胞hepg2的ic50为11.45ug/ml；人卵巢癌细胞sk-ov-3的ic50为18.65ug/ml。

上述结果表明：螺环化合物ⅰ对这两种人肿瘤细胞株具有抑制作用。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。