本发明涉及生物工程和酶工程领域，具体而言，涉及一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法。
背景技术：
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1糖苷键结合的非还原性糖，它广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。海藻糖对细胞膜、蛋白质、核酸等生物大分子具有非特异性的保护作用，具有良好的吸水性、稳定、且不易焦糖化。外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质使其在食品、医药、化妆品、疫苗等领域有重要的应用。
海藻糖的生产方法主要有微生物提取法、发酵法和酶转化法。
微生物提取法是指乳酸菌、酵母、霉菌等为提取源，通过干燥、高渗等逆境处理使其积累海藻糖，然后经有机溶剂抽提、精制得到海藻糖。此方法海藻糖含量低，提取效率低，成本过高，不适合工业化生产。
发酵法一般是先经过诱变、细胞融合、基因重组等方法选育海藻糖的高产菌株，然后采用高浓度培养基及高渗条件发酵，并在发酵结束前进行饥饿处理，从而得到海藻糖较高的培养物。这些菌株包括节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微球菌属等。但是高产菌株选育困难，转化率低，副产物多，提取精制困难，因此也很难实现工业化生产。
酶法生产海藻糖根据底物来区分主要有三种：一是以葡萄糖为底物，二是以麦芽糖为底物，三是以淀粉为底物。
以葡萄糖为底物的反应如下：udp葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷合成酶的作用下生成海藻糖-6-磷酸，海藻糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸酯酶的作用下生成海藻糖，由于此方法中的需要以葡萄糖-6-磷酸为糖基受体，udp-葡萄糖、adp-葡萄糖、gdp-葡萄糖为糖基供体，需要反应体系提供很高的能量，因此难以工业化生产。
以麦芽糖为底物是在海藻糖合成酶的作用下将α-1，4-麦芽糖在分子内重组成α-1，1-海藻糖。以麦芽糖为底物：海藻糖合成酶具有较严格的底物专一性，只作用于麦芽糖生成海藻糖及海藻糖生成麦芽糖。此方法反应工艺简单，易于控制，底物麦芽糖价格便宜，耐热菌中的海藻糖合成酶热稳定性好，因而使用耐热菌可避免工业生产中杂菌的污染，这是较理想的工业生产途径。但海藻糖合成酶催化的是一个可逆反应，它既可以催化麦芽糖生成海藻糖，也可以催化海藻糖生成麦芽糖，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率达到70％以后难以再有提高。
以淀粉为底物的反应是在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)与麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)的作用下进行的。麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶，催化麦芽寡糖(淀粉液化液)还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α-1，4-葡萄糖苷键转化成α-1，1-葡萄糖苷键，生成麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α-1，4-糖苷键，以上两种酶联合作用，每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖，此方法已经用于海藻糖的工业化生产。
双酶法生产海藻糖主要成本是生产双酶的成本。现国内主要使用转基因大肠杆菌为出发菌种，通过高密度培养菌体积累生产所需酶，生长完成破碎菌体提取酶。所以高密度培养的菌体密度是生产成本的关键，单批菌体密度越高相对总生产成本越低。
高密度培养的关键是生产过程中的各种参数控制，转基因大肠杆菌发酵生长过程中需要控制溶氧(do)、ph、葡萄糖含量、转速、风量、温度等等条件，而且生长控制过程中调节一个参数相应会有几个参数发生改变需要调整，比如需要do提高，可以提高转速，但提高转速以后菌体生长速率改变葡萄糖含量会发生改变需要提高补糖速率，补糖速率增加，随着菌体生长消耗葡萄糖多do又会下降，所以需要几个因素不停调整，工人操作难度较大，菌生长不稳定影响最终得菌体密度和酶效价。所以需要一套成熟的控制工艺，使达到高密度发酵同时菌体生长稳定产酶效价较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，该方法以二氧化碳释放率作为发酵参数对其进行控制，进而实现对发酵过程中各种参数的有效控制，克服现有发酵技术过程反复不停地调节各种参数的缺陷，以实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的。
本发明的另一目的在于提供一种生产海藻糖的方法，该方法以上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物生产出海藻糖，该两种酶具有高酶活效价的特点，因此该方法具有操作简单、海藻糖收率高的特点。
本发明是这样实现的：
一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其包括：以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
一种生产海藻糖的方法，其包括：用上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，该方法通过控制二氧化碳释放率，实现对发酵过程中的其他参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的控制，克服现有发酵技术中需要不断地反复地调整多个参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的缺陷，实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的，以该方法所得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行双酶法生产海藻糖，具有提高海藻糖收率的特点，收率可达80％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的cer随发酵时间增加而上升的变化曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的及一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法进行具体说明。
一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其包括如下步骤：
(1)一级种子摇瓶(含液体lb培养基)接种能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌，接种量1％，37℃培养，培养8小时左右以后(od600值大于2)，得到一级种子活化液。
(2)将一级种子活化液接入二级种子罐(含液体lb培养基)，接种量4％，控制反应温度37℃，溶氧(do)大于10％，ph7.0(20％氨水调节)，培养10小时左右(od600值大于4)，得到二级种子活化液。
需要说明的是，重组工程菌是指转基因工程菌例如转基因大肠杆菌，该重组工程菌含有编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因，具有编码出麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的能力。只要是含有编码出麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的重组工程菌均可以应用到本发明的提供的生产方法中，其属于本发明的保护范围。
(3)将得到的二级种子活化液接入灭菌后的发酵罐(含发酵液)中进行发酵培养，接种量为10％，接种后氨水(20％)调节控制ph7.0，通风比为1:1，发酵罐罐压0.05mpa，do维持在15％-25％，在发酵过程中通过控制流加葡萄糖(500g/l)使发酵液中葡萄糖含量维持在1-3g/l。
其中，发酵液的配料比为：
kh2po4：28g/l，(nh4)2hpo4:12g/l，柠檬酸：8g/l，加入发酵罐灭菌；
七水硫酸镁7.6g/l，微量元素，卡那霉素单独灭菌后，接种前加入发酵罐；
葡萄糖浓度500g/l，发酵过程中流加；d-阿拉伯糖单独灭菌后，于诱导时加入。
(4)二氧化碳释放率(cer)反馈调节控制：
在发酵的过程中，以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对接入能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养。
重组工程菌例如转基因大肠杆菌生长过程中需要严格控制菌体生长速率，既要菌体正常生长(死亡率低)，又不能生长过快(生长过快容易使菌体内酶表达不好)，而原始的方法是不停取样检测葡萄糖含量、菌体浓度等等，该方法复杂、时效性差。cer与活菌菌浓成线性正相关，控制发酵过程中cer就是控制菌体生长速率。cer可以观察发酵曲线直接读取，比取样检测快速、方便、准确。
其中，控制二氧化碳释放率是指：调节所述二氧化碳释放率从初始值上升至289-303mmolco2/l·h(二氧化碳释放率是指：每升发酵液每小时释放的二氧化碳的量，单位为毫摩尔)。
进一步地，控制二氧化碳释放率是指：在发酵起始时至发酵第9.5-10.5小时的阶段，调节所述二氧化碳释放率从所述初始值上升至38-42mmolco2/l·h，然后用诱导剂进行诱导，调节所述二氧化碳释放率继续上升至289-303mmolco2/l·h。
具体地，诱导前，发酵时间从第0小时(接入重组工程菌时)至10小时左右，在此期间，控制二氧化碳释放率从初始值(通常是0.5mmolco2/l·h左右)上升至40mmolco2/l·h左右，优选地，二氧化碳释放率上升以尽量平滑的抛物线形式上升，如图1所示；
在发酵培养10小时左右后降温28℃，添加灭菌后的d-阿拉伯糖，进行诱导培养，此时，二氧化碳释放率会下降至25mmolco2/l·h左右，继续流加葡萄糖控制二氧化碳释放率上升至300左右，结束发酵培养。优选地，二氧化碳释放率上升以尽量平滑的抛物线形式上升，如图1所示。
二氧化碳释放率的调控步骤为：如果二氧化碳释放率需要上升→提高补糖速率→溶氧下降→提高转速(或理解为：需要提高二氧化碳释放率时，则提高补糖速率，如果溶氧下降，则提高转速)；如果二氧化碳释放率需要下降→降低补糖速率→溶氧上升→降低转速(需要降低二氧化碳释放率时，则降低补糖速率，如果溶氧上升，则降低转速)。
通过补糖速率的和转速两个参数的调节，实现二氧化碳释放率的上升效果。在此过程中，操作者仅需对溶氧、转速以及补糖速率这些参数调节，实现二氧化碳释放率上升的效果即可，而对这些参数溶氧、转速以及补糖速率具体调节到什么值可不作限定或设定。也就说发酵过程中发酵参数只控制二氧化碳释放率，使其按照预设的值上升即可，这大大地降低了操作难度，同时提高了菌体密度，保证了菌体生长的稳定性以及实现了酶活效价高的目的。
(5)发酵培养结束后，对发酵液离心、洗涤分离出菌体，菌体破碎得到含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶液。该酶液即可用于后续生产海藻糖使用，采用双酶法生产海藻糖，结合麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶高酶活效价，提高海藻糖的收率。
需要说明的是，在实际过程中，可根据需要选择性地生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶，仅需要选用不同类别的重组工程菌即可。
一种生产海藻糖的方法，其包括：将上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物，具体如下步骤：
(1)在反应罐中加入质量分数为30％的淀粉乳，控制ph5.4-5.6，加入高温淀粉酶后控制温度100-110℃，该高温淀粉酶的活力单位为5000-8000u/ml，用量为每1kg淀粉用2.5-3.0g高温淀粉酶，处理3-4h，将淀粉液化为de值5-7％的麦芽糊精，麦芽糊精作为后续麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶作用的底物。
(2)使用上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物。优选地，麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物进行反应的条件为：温度54-56℃、ph5.8-6.2。优选地，麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物进行反应的条件为：温度55℃、ph6.0。
具体地：麦芽糊精控制温度55℃，加入0.2mol/l磷酸和0.2mol/l氢氧化钠调ph6.0，同时加入普鲁兰酶、含麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶液和含麦芽寡糖海藻糖水解酶的酶液(该两种酶液由前述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到)。
其中，普鲁兰酶的活力单位为1000-1500u/ml，用量为0.5-1.0g普鲁兰酶/100g麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶的活力单位为100-150u/mg、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活力单位为350-400u/mg，用量分别为35-40g/100g麦芽糊精、15-20g/100g麦芽糊精，处理12小时。
(3)控制温度60℃，ph4.0-4.5，加入糖化酶反应4h，糖化结束。其中，糖化酶的活力单位为10万u/ml，用量为0.05g糖化酶/100g干物质。
(4)灭酶、脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色。
(5)过滤：板框过滤除杂质。
(6)离交：离交去除阴阳离子。
(7)分离：模拟移动床分离海藻糖和葡萄糖。
(8)浓缩、结晶：将分离出的海藻糖于105-115℃浓缩至70％以上含量，冷却结晶。
(9)分离、干燥：分离机将海藻糖晶体与液体分离，然后流化床干燥，得海藻糖成品，经计算，海藻糖收率可达80％以上。
(10)海藻糖包装(可选步骤)。
综上，本发明提供的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，该方法通过控制二氧化碳释放率，实现对发酵过程中的其他参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的控制，克服现有发酵技术中需要不断地反复地调整多个参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的缺陷，实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的，以该方法所得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行双酶法生产海藻糖，具有提高海藻糖收率的特点，收率可达80％以上。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法，包括如下步骤：
1.1按1％接种量将能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的转基因大肠杆菌接种至一级种子摇瓶(含液体lb培养基)中，置于37℃，220rpm，摇床培养8h，od600培养至2.1，得到一级种子活化液。
1.2将一级种子活化液按4％接种量转接15l二级种子罐(含lb液体培养基)，控制反应温度37℃，do大于10％，ph7.0(用20％氨水调节)，进行菌种培养，生长10.5小时，od600值大于4.4，得到二级种子活化液。
其中，lb液体培养基配方：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，ph7.0，121℃，灭菌20分钟。
1.3将得到的二级种子活化液按接种量为10％的比例接入灭菌后的50l发酵罐(blbio-50-fmt,上海百仑生物科技有限公司)(含26l发酵液)中，进行发酵培养，接种后氨水(20％)调节控制ph7.0，通风比为1:1，发酵罐罐压0.05mpa，do维持在15％-25％，在发酵过程中通过控制流加葡萄糖(500g/l)使发酵液中葡萄糖含量维持在1-3g/l。
其中，发酵液配方：kh2po4(28g/l)840g、(nh4)2hpo4(12g/l)360g、柠檬酸(8g/l)240g，用水溶解后加入发酵罐中体积26l，121℃灭菌20分钟；七水硫酸镁(7.6g/l)228g、微量元素(终浓度1.0ml/l)、卡那霉素(终浓度0.05g/l)单独灭菌后接种前加入发酵罐；葡萄糖浓度500g/l，发酵过程中流加；d-阿拉伯糖单独灭菌后，于诱导时加入。
1.4建立二氧化碳释放率反馈调控发酵机制
诱导前，发酵时间从0小时(接入重组工程菌时)至10小时左右，在此期间，控制二氧化碳释放率从初始值(0.7mmolco2/l·h左右)尽量以平滑的抛物线形式上升至42mmolco2/l·h左右，如图1所示；
在发酵培养10小时左右后降温28℃，添加灭菌后的d-阿拉伯糖(发酵液中浓度2g/l)，进行诱导培养，此时，二氧化碳释放率会下降至23.5mmolco2/l·h左右，继续流加葡萄糖控制二氧化碳释放率尽量以平滑的抛物线形式上升至300mmolco2/l·h左右，结束发酵培养，得含酶菌体。其中，二氧化碳释放率的上升过程控制可参考如图1所示的曲线。
二氧化碳释放率的调控步骤为：二氧化碳释放率需要上升→提高补糖速率→溶氧下降→提高转速(需要提高二氧化碳释放率时，则提高补糖速率，如果溶氧下降，则提高转速)；如果二氧化碳释放率需要下降→降低补糖速率→溶氧上升→降低转速(需要降低二氧化碳释放率时，则降低补糖速率，如果溶氧上升，则降低转速)。
通过补糖速率的和转速两个参数的调节，实现二氧化碳释放率的上升效果。在此过程中，操作者仅需对溶氧、转速以及补糖速率这些参数调节，实现二氧化碳释放率上升的效果即可，而对这些参数溶氧、转速以及补糖速率具体调节到什么值可不作限定或设定。也就说发酵过程中发酵参数只控制二氧化碳释放率，使其按照预设的值上升即可，这大大地降低了操作难度，同时提高了菌体密度，保证了菌体生长的稳定性以及实现了酶活效价高的目的。
取上述发酵液检测其od600值，结果显示本实施例得到发酵液的od600值为235，与其他发酵方法相比，例如自诱导发酵的最终发酵液od600值为16-20，普通高密度发酵(未采用二氧化碳释放率作为控制参数)的最终发酵液od600值为120-160。本实施例得到发酵液的od600值明显更高，由此可见，本发明通过对二氧化碳释放率的有效控制，大大地提高了菌体密度。
1.5发酵液离心、洗涤分离出菌体，菌体匀浆机破碎得到含麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液。
实施例2
本实施例提供的生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，与实施例1的方法基本相同，区别是用能够表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶的转基因大肠杆菌代替步骤1.1中的能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的转基因大肠杆菌，得到含麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。
实施例3
本实施例提供的生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
3.1在反应罐(blbio-50-fmt，上海百仑生物科技有限公司)中加入纯淀粉9kg，控制ph5.5，加入高温淀粉酶27g后控制温度105℃，处理3.6h，将淀粉液化为de5％的麦芽糊精。
其中，高温淀粉酶的活力单位为6500u/ml，其用量为：3.0g高温淀粉酶对应1.0kg淀粉。
3.2麦芽糊精控制温度55℃，使用0.2mol/l的磷酸和0.2mol/l的氢氧化钠调ph6.0，加入普鲁兰酶、由实施例1得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液，由实施例2得到的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液，处理12小时。
其中，普鲁兰酶的活力单位为1000-1500u/ml，用量为0.8g普鲁兰酶/100g麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液的酶活为145u/mg，用量为39g/100g麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液的酶活为355u/mg，用量为16g/100g麦芽糊精。
3.3控制温度60℃，ph4.2，加入糖化酶，进行糖化反应4h，糖化结束。其中，糖化酶的活力单位为10万u/ml，用量为0.05g糖化酶/100g干物质。
3.4灭酶、脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色。
3.5过滤：板框过滤除杂质。
3.6离交：离交去除阴阳离子。
3.7分离：模拟移动床分离海藻糖和葡萄糖。
3.8浓缩、结晶：将分离出的海藻糖105-115℃浓缩至70％以上含量，冷却结晶。
3.9分离、干燥：分离机将海藻糖晶体与液体分离，然后流化床干燥，得海藻糖成品。
4.0海藻糖包装。计算海藻糖的收率(得到的海藻糖总质量/加入的纯淀粉质量)到达81％。
综上，本发明提供的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，该方法通过控制二氧化碳释放率，实现对发酵过程中的其他参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的控制，克服现有发酵技术中需要不断地反复地调整多个参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的缺陷，实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的，以此方法所得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行双酶法生产海藻糖，具有提高海藻糖收率的特点，收率可达81％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。