抗虫性能增强的植物和涉及昆虫抗性基因的构建体和方法与流程

本
技术领域：
：涉及植物育种和基因学，并且具体地涉及用于赋予植物抗虫害性能的重组dna构建体和植物虫害的防治方法。发明背景许多昆虫品种是玉米、大豆、豌豆、棉花、水稻和类似的粮食以及纤维作物等农作物的重要害虫，害虫的侵扰每年可以导致诸如作物损失或购买控制害虫的昂贵杀虫剂等巨大的经济损失。在过去的几个世纪中，控制这些害虫的主要方法是使用化学合成的杀虫化合物，然而由于化合物非选择性以及昆虫对化学制品的抗药性的产生，化学化合物的广泛应用造成了许多环境问题。近几十年来生物技术的发展为通过基因工程控制害虫提供了机遇，特别是植物遗传学的发展，再加上昆虫生长因子和自然发生的植物防御化合物或试剂的鉴定，为创造能够产生这些防御试剂的转基因作物提供了机遇，从此保护植物免受昆虫攻击。已知芽孢杆菌属(bacillus)微生物的某些种对一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)害虫以及其他害虫。苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)(bt)和日本金龟子芽孢杆菌(bacilluspopilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(b.larvae)、缓病芽孢杆菌(b.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(b.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(b.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂，特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。编码苏云金芽孢杆菌(bt)内毒素或植物蛋白酶抑制剂(pis)基因的转基因植物能够抵抗特定害虫，例如能够产生苏云金芽胞杆菌菌株的杀虫蛋白的玉米和棉花已通过遗传工程获得，这些遗传转化的作物目前广泛用于农业，并为农民提供了环境友好和商业吸引力的替代传统昆虫控制的方法。通常来说，与传统广谱的化学杀虫剂相比，生物杀虫剂的污染和环境危害风险较低，且生物杀虫剂具有较好的目标特异性。另外，生物杀虫剂生产成本低，因此提高了各种作物的经济产量。生物杀虫剂已被证明是非常成功的商业化，这些转基因抗虫作物只对一个狭窄的范围内的重要经济害虫具有抗性。在某些情况下，昆虫对不同的杀虫化合物产生抗性，这就需要鉴定出控制害虫的可替代性生物控制试剂。仍然需要对昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对鳞翅目和半翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述多种昆虫包括但不限于对现有杀虫剂已产生抗性的昆虫害虫。发明概述一方面，本发明包括过量表达提高植物抗虫性的多核苷酸，所述多核苷酸,包含：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：4和12的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：5和13的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：6和14的序列一致性至少为90％；或(d)(a)、(b)或(c)核苷酸序列的全长互补序列。核苷酸序列包含seqidno：4、seqidno：5、seqidno：12或seqidno：13；多肽的氨基酸序列包含seqidno：6或seqidno：14。另一方面，本发明包括重组dna构建体，其包含可操作连接至少一个调控序列的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列与seqidno：4、5、12或13序列一致性至少为85％的多核苷酸；(b)编码多肽的氨基酸序列与seqidno：6或14的序列一致性至少为90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)的核苷酸序列的全长互补序列；所述至少一个调控序列为植物中有功能的启动子。另一方面，本发明包括一种包含重组dna构建体的植物或种子，所述重组dna构建体包含可操作连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列与seqidno：4、5、12或13序列一致性至少为85％的多核苷酸；(b)编码多肽的氨基酸序列与seqidno：6或14的序列一致性至少为90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)核苷酸序列的全长互补序列。另一方面，本发明包括基因组内包含重组dna构建体的植物，所述重组dna构建体包含可操作连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)核苷酸序列与seqidno：4、5、12或13序列一致性为85％的多核苷酸；(b)编码多肽的氨基酸序列与seqidno：6或14的序列一致性至少为90％的多核苷酸；或(c)(a)或(b)核苷酸序列的全长互补序列；对照植物相比，所述转基因植物显示增强的抗虫性。在另一个实施方案中，本发明包括本文中任意的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。在另一个实施方案中，本发明包括增强了抗虫性，其中，所述抗虫性针对选自下列目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、禽虱目、同翅目、半翅目、缨尾目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目和毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。在另一实施方案中，提供了提高植物抗虫性的方法，其包括：(a)向可再生植物细胞导入重组dna构建体，所述重组dna构建体包含可操作连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与seqidno：6或14序列一致性至少为50％；(b)由步骤(a)后的可再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组dna构建体；和(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组dna构建体，与不包含重组dna构建体的对照植物相比，所述子代转基因植物显示增强的抗虫性能。在另一个实施方案中，提供了评估植物抗虫性的方法，其包括：(a)向可再生植物细胞导入重组dna构建体，所述重组dna构建体包含可操作连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：6或14的序列一致性至少为50％；(b)由步骤(a)的可再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组dna构建体；(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中子代植物的基因组中包含重组dna构建体；和(d)以不包含重组dna构建体的对照植物为对照，评估子代植物的抗虫性能。在另一个实施方案中，本发明涉及一个重组dna构建体，其包含本发明中任意分离的多聚核苷酸，并与至少一个调控序列可操作连接；以及包含重组dna构建体的细胞、植物和种子。所述细胞包括真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，如细菌。附图简述和序列表根据以下的发明详述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的发明详述和附图以及序列表形成本申请的一部分。图1为实时pcr分析测定的不同转基因株系叶片中oscrk6基因的相对表达水平。zh11-tc叶片中基因的表达水平设置为1.00，每个转基因株系表达量柱上面的数字表示与zh11-tc相比的变化倍数。zh11-tc为组织培养获得的zh11，dp0158代表转空载体的zh11。图2为实时pcr分析测定的不同转基因株系叶片中osmfs6基因的相对表达水平。zh11-tc叶片中基因的表达水平设置为1.00，每个转基因株系表达量柱上面的数字表示与zh11-tc相比的变化倍数。zh11-tc为组织培养获得的zh11，dp0158代表转空载体的zh11。表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列编号表2.玉米螟及粘虫试验打分的分级标准表3.ah43610幼苗在实验室条件下的亚洲玉米螟试验表4.ah29691幼苗在实验室条件下的亚洲玉米螟试验表5.实验室条件下ah43610和ah29691幼苗的粘虫试验表6.实验室条件下ah43610和ah29691幼苗水稻二化螟试验表7.克隆抗虫基因的引物表8.pcr反应混合液表9.克隆抗虫基因的pcr循环状况表10.oscrk6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)表11.oscrk6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)表12.oscrk6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(载体水平，第一次试验)表13.oscrk6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(载体水平，第二次试验)表14.oscrk6转基因水稻在温室条件下的水稻二化螟试验(转基因株系水平)表15.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)表16.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)表17.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的粘虫试验(转基因株系水平，第一次试验)表18.osmfs5转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第二次试验)表19.osmfs5转基因水稻在温室中的水稻二化螟试验(枯心率)表20.osmfs5转基因水稻在温室中的水稻二化螟试验(水稻死亡率)表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列编号序列描述以及关联的序列表遵循如37c.f.r.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照iupac-iubmb标准所定义的，该标准在nucleicacidsres.13：3021-3030(1985)以及在biochemicalj.219(no.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37c.f.r.§1.822中列出的规则。seqidno：1为ah43610株系中t-dna右侧(rb)侧翼序列的核苷酸序列。seqidno：2为ah43610株系中t-dna左侧(lb)侧翼序列的核苷酸序列。seqidno：3为载体dp0158的核苷酸序列。seqidno：4为oscrk6基因cdna的核苷酸序列。seqidno：5为oscrk6基因cds的核苷酸序列。seqidno：6为oscrk6的氨基酸序列。seqidno：7为克隆oscrk6基因cdna的正向引物。seqidno：8为克隆oscrk6基因cdna的反向引物。seqidno：9为oscrk6基因的实时rt-pcr的正向引物。seqidno：10为oscrk6基因的实时rt-pcr的反向引物。seqidno：11为ah29691株系t-dna右侧(rb)侧翼序列的核苷酸序列。seqidno：12为osmfs5基因cdna的核苷酸序列。seqidno：13为osmfs5基因cds的核苷酸序列。seqidno：14为osmfs5的氨基酸序列。seqidno：15为克隆osmfs5基因cdna的正向引物。seqidno：16为克隆osmfs5基因cdna的反向引物。seqidno：17为osmfs5基因实时rt-pcr分析的正向引物。seqidno：18为osmfs5基因实时rt-pcr分析的反向引物。发明详述本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。如本文所用：“oscrk6”是半胱氨酸丰富的受体样蛋白激酶6，涉及水稻基因loc_os03g16960.1编码的能够提高水稻耐虫性的多肽。“crk6多肽”此处涉及oscrk6多肽和来源于其他植物的同源物。oscrk6多肽(seqidno:6)是水稻基因位点loc_os03g16960.1的编码序列(cds)(seqidno：5)和核酸序列(seqidno：4)编码的氨基酸序列。tigr(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)中，该多肽的注释为“半胱氨酸丰富的重复分泌蛋白55前提，推测，表达”，但是没有在先的功能介绍。“osmfs5”是主要协助转运蛋白超家族5，涉及水稻基因位点loc_os09g36600.1编码的能够提高水稻耐虫性的多肽。“mfs5多肽”此处涉及osmfs5多肽和来源于其他植物的同源物。osmfs5多肽(seqidno:14)是水稻基因位点loc_os09g36600.1的编码序列(cds)(seqidno：13)和核酸序列(seqidno：12)编码的氨基酸序列。tigr(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)中，该多肽的注释为“根瘤素，推测，表达”，但是没有在先的功能介绍。如本文所用，“耐虫蛋白”和“抗虫蛋白”是指能够抑制、阻碍害虫的生长和/或能够杀死害虫的多肽，包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目的害虫。本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。“表达序列标签”(“est”)是得自cdna文库的dna序列，并且因此是已经被转录的序列。est通常通过cdna插入序列单程测序获取。将完整的cdna插入序列称为“全长插入序列”(“fis”)。“重叠群”序列是由选自但不限于est、fis和pcr序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“cgs”)，该序列可得自fis或重叠群。“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因组作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。本发明中，zh11-tc和空载体植物指对照植物。zh11-tc代表通过组织培养zhonghua11获得的水稻植株，空载体代表转化空载dp0158获得水稻植株。“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体dna，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器dna。“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“子代”包括植物的任何后续世代。“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。t0植物直接源于转化和再生过程，t0植物的子代为t1代(第一个子代)，t2代(第二个子代)等。针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。“信使rna(mrna)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的rna。“cdna”指与mrna模板互补并且利用逆转录酶从mrna模板合成的dna。cdna可为单链的或者可用dna聚合成酶i的klenow片段转化成双链形式。“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mrna的翻译初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。“非基因组核酸序列”、“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”指与天然或基因组核酸序列相比，存在一处或多处核酸序列改变的核酸分子。在某些实施方案中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性而产生的核酸序列变化；植物表达的核酸序列密码子优化；与天然或基因组序列相比，至少一个氨基酸的替代、插入、删除和/或添加而引起的核酸序列的变化；与基因组核酸序列相连的一个或多个内含子的移除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相连一个或多个上游或下游调控区域的删除，一个或多个异源上游或下游调控区域的插入；与基因组核酸序列相连的5’和/或3’非翻译区的删除；一个异源5’和/或3’非翻译区的插入；和多聚腺苷酸位点的修饰。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是cdna。在一些实施方案中，非基因组核酸分子为合成的核酸序列。“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。有关将核酸片段(例如重组dna构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体dna)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mrna)。“转化细胞”是将核酸片段(如重组dna构建体)导入其中的任何细胞。本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含dna的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或翻译蛋白的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官的氨基酸序列(chrispeels，m.(1991)ann.rev.plantphys.plantmol.biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(raikhel(1992)plantphys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是引导前体蛋白进入线粒体的氨基酸序列(zhang和glaser(2002)trendsplantsci7：14-21)。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(inc.，madison，wi)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用clustalv比对方法(higgins和sharp，1989，cabios.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用clustalv方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为ktuple＝1、空位罚分(gappenalty)＝3、窗口(window)＝5并且diagonalssaved＝5。而对于核酸，这些参数为ktuple＝2，空位罚分＝5，窗口＝4并且diagonalssaved＝4。用clustalv程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。本文使用的标准重组dna和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文称为“sambrook”)。现在转向实施方案：实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐虫害dna构建体、包含这些重组dna构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组dna构建体的方法。分离的多核苷酸和多肽：本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：在一些实施方案中，多核苷酸编码crk6或mfs5多肽。在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列在与seqidno：6或14进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中全长互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组dna构建体。在一些实施方案中，分离的多肽，其氨基酸序列在与seqidno：6或14进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽优选地为抗虫多肽crk6或mfs5。在一些实施方案中，分离的多核苷酸，其包括：(i)核酸序列，所述核酸序列在与seqidno：4、5、12或13进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组dna构建体。分离的多核苷酸优选地编码抗虫蛋白。过表达抗虫多肽增加了植物对害虫的抗性。重组dna构建体在一方面，本发明包括重组dna构建体。在一个实施方案中，重组dna构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列编码的氨基酸序列与seqidno：6或者14进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。在另一个实施方案中，重组dna构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列在与seqidno：4、5、12或13进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。在另一实施方案中，重组dna构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码crk6或mfs5。这些多肽具有抗虫害的活性，并可来自，例如水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、阔叶稻(oryzalatifolia)、长雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、药用野生稻(oryzaofficinalis)、斑点野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(红稻)、印度野生稻(oryzanivara)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、烟豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短绒野大豆(glycinetomentella)。应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的n-末端和c-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。“抑制dna构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组dna构建体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mrna或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不特指机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于rnai的方法以及基于小rnai的方法。抑制dna构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。抑制dna构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链rna的构建体，以及更通常的是，rnai(rna干扰)构建体和小rna构建体，例如sirna(短干扰rna)构建体和mirna(微rna)构建体。“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义rna转录物。“反义rna”指与靶初级转录物或mrna的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的rna转录物(美国专利号5,107,065)。反义rna可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义rna转录物。“有义”rna指包括mrna并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的rna转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mrna具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有rna减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见vaucheret等人，plantj.，16：651-659(1998)；以及gura，nature404：804-808(2000))。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mrna编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的pct公开wo98/36083)。rna干扰(rnai)是指由短干扰性rna(sirna)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(fire等人，nature391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(ptgs)或rna沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(fire等人，trendsgenet.15：358(1999))。小rna在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小rna控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小rna的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。小rna似乎是通过与互补rna或dna靶序列碱基配对来行使功能的。当与rna结合时，小rna或者引发靶序列的rna裂解或者引发翻译抑制。当与dna靶序列结合时，据信小rna可介导靶序列的dna甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。微rna(mirna)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码rna(lagos-quintana等人，science294：853-8582001，lagos-quintana等人，curr.biol.12：735-739(2002)；lau等人，science294：858-862(2001)；lee和ambros，science294：862-864(2001)；llave等人，plantcell14：1605-1619(2002)；mourelatos等人，genes.dev.16：720-728(2002)；park等人，curr.biol.12：1484-1495(2002)；reinhart等人，genes.dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70至200nt较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。微rna(mirna)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。看起来有可能mirna可进入至少两条靶基因调控途径：(1)翻译抑制；和(2)rna裂解。进入rna裂解途径的微rna类似于在动物中的rna干涉作用(rnai)和植物中的转录后基因沉默(ptgs)期间生成的21-25nt的短干涉rna(sirnsirna)，并且可能掺入了rna诱导沉默复合物(risc)，该复合物与rnai相似或相同。调控序列：本发明的重组dna构建体可包含至少一种调控序列。调控序列可为启动子或增强子。多种启动子可用于本发明的重组dna构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35s或ubi启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留抗虫性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(kasuga等人(1999)naturebiotechnol.17：287-91)。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)rsyn7启动子的核心启动子和在wo99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；camv35s核心启动子(odell等人，nature313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(mcelroy等人，plantcell2：163-171(1990))；泛素启动子(christensen)等人，plantmol.biol.12：619-632(1989)和christensen等人，plantmol.biol.18：675-689(1992))；pemu(last等人，theor.appl.genet.81：581-588(1991))；mas(velten等人，emboj.3：2723-2730(1984))；als启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调节启动子。组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的dna序列，其调节dna序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种dna序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti3，jofuku和goldberg，plantcell1：1079-1093(1989))、patatin(马铃薯块茎)(rocha-sosa，m.等人，1989，emboj.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)rerie，w.g.等人，1991，mol.gen.genet.259：149-157；newbigin，e.j.等人，1990，planta180：461-470；higgins，t.j.v.等人，1988，plant.mol.biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等人，1988，emboj.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(segupta-gopalan，c.等人，1985，proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(voelker，t.等人，1987，emboj.6：3571-3577)、b-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(chen，z-l等人，1988，emboj.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.等人，1988，plantmol.biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.等人，1987，emboj.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(hattori，t.等人，1990，plantmol.biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(brassicanapus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2s种子储藏蛋白基因启动子(vanderkerckhove等人，bio/technology7：l929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(riggs等人，plantsci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(colot等人，emboj6：3559-3564(1987))。可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的dna序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型rd29a启动子(kasuga等人，1999，naturebiotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子b22e；b22e的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。klemsdal，s.s.等人，mol.gen.genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子，zag2(“identificationandmolecularcharacterizationofzag1，themaizehomologofthearabidopsisfloralhomeoticgeneagamous”，schmidt，r.j.等人，plantcell5(7)：729-737(1993)；“structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofagamous-likemads-boxgenesfrommaize”，theissen等人，gene156(2)：155-166(1995)；ncbigenbank登录号x80206))。zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(dap)7至8天被检测到，并且引导ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特殊的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右。在籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；最终的成熟期起始于授粉后大约40天到收获，籽粒发育的这一过程中，籽粒开始休眠，变干。本发明中的“早期籽粒/胚乳启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的aba偶联的序列和期望的表型选择启动子。早期籽粒/胚胎启动子包括，cim1，授粉后第5天活跃在特定组织中(wo00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，在授粉后7-10天表达，和end2，授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(wo00/12733)。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米esr启动子(美国专利号7,276,596)；玉米zap启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子adf4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿s2a启动子(genbank登录号ef030816；abrahams等(1995)plantmol.biol.27：513-528)和s2b启动子(genbank登录号ef030817)和类似的启动子。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的dna片段。用于本发明的启动子包括：rip2、mlip15、zmcor1、rab17、camv35s、rd29a、b22e、zag2、sam合成酶、泛素、camv19s、nos、adh、蔗糖合成酶、r-等位基因、维管组织优选启动子s2a(genbank登录号ef030816)和s2b(genbank登录号ef030817)及来自玉米的组成型启动子gos2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米nas2启动子、玉米cyclo启动子(us2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米rootmet2启动子(wo05063998，公开于2005年7月14日)、crlbio启动子(wo06055487，公开于2006年5月26日)、crwaq81(wo05035770，公开于2005年4月21日)和玉米zrp2.47启动子(ncbi登录号：u38790；gino.1063664)。本发明的重组dna构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组dna构建体还包括增强子或沉默子。内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mrna和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见buchman和berg，mol.cellbiol.8：4395-4405(1988)；callis等人，genesdev.1：1183-1200(1987)。增强子或增强子元件指的是一个顺式作用的转录调控元件，即顺式元件，它可调控多核苷酸序列整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动转录可操作连接的多核苷酸序列。分离的增强子元件可以与一个启动子融合形成一个嵌合的启动子顺式元件，从而调节基因表达。本领域的技术人员均知道增强子，增强子包括sv40增强子区域、camv35s增强子元件等。一些增强子也可以改变普通调控元件的表达模式，例如，当没有增强子时，导致调控元件组成型表达，当存在增强子时，同一调控元件在某一特定组织或某些特定组织表达。camv35s启动子重复上游区域显示出大约增强10倍的表达量(kay,r.etal.,(1987)science236：1299-1302)。本发明中使用的增强子包括camv35s(benfey,etal.,(1990)emboj.9：1685-96)、4xb3p-camv.35增强子区域—四拷贝串联b3区域(208到155)(美国专利号5,097,025)、4xas-1p—camv35s增强子区域-四拷贝串联激活序列(83到62)(美国专利号5,097,025)、2xb1-b2p-camv35s增强子区域—二拷贝串联b1-b2区域(148到90)(美国专利号5,097,025)、2xa1-b3p-camv35s增强子区域—二拷贝串联a1-b3区域(208到46)(美国专利号5,097,025)、2xb1-b5p-camv35s增强子区域—二拷贝b1-b5区域(343到90)(美国专利号5,097,025)、欧米伽增强子或欧米伽基本增强子(gallie等(1989)molecularbiologyofrnaed.cech(liss,newyork)237-256和gallie等(1987)gene60:217-25)、美国专利号7,803,992的增强子和甘蔗棒状病毒(scbv)增强子元件(wo2013130813)。任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组dna构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、加拿大油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。组合物：本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组dna构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组dna构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组dna构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子或水稻种子。植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。重组dna构建体可稳定地整合进植物的基因组中。实施方案包括但不限于以下实施方案：1.在基因组中包含重组dna构建体的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组dna构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与seqidno：6或14进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性并且其中所述植物在与不包含所述重组dna构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐虫害性。2.实施方案1的转基因植物，其中多聚核苷酸编码crk6或mfs5多肽，所述crk6或mfs5多肽可来自水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、阔叶稻(oryzalatifolia)、长雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、药用野生稻(oryzaofficinalis)、斑点野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(红稻)、印度野生稻(oryzanivara)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、鹰嘴豆(cicerarietinum)、马铃薯(solanumtuberosum)、甘蓝(brassicaoleracea)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、烟豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短绒野大豆(glycinetomentella)。3.实施方案1或2中任意转基因植物，其中转基因植物进一步包括至少一种编码杀虫多肽的多核苷酸。4.实施方案1或2中任意转基因植物，其中转基因植物进一步包括至少一种编码关注的多肽的重组多核苷酸5.实施方案1-4中所述任意植物的子代，实施方案1-4中所述任意植物的种子，实施方案1-4中所述任意植物子代的种子，和来源于实施方案1-4中任意植物和所述植物子代的细胞。前述实施方案1-5中的任意一项或本发明公开的其他实施方案中，重组dna构建体还包括至少一个异源的在植物中有功能的启动子作为调控序列。此处所用“杀虫蛋白”指一种对一种或多种害虫有毒害作用的多肽或其同源蛋白，所述害虫包括但不限于，鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目成员或线虫动物门。杀虫蛋白分离自有机体包括，例如，芽孢杆菌属(bacillussp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、发光杆菌属(photorhabdussp.)、致病杆菌属(xenorhabdussp.)双酶杆菌属(clostridiumbifermentans)和日本金龟子芽孢杆菌属(paenibacilluspopilliae)。杀虫蛋白包括但不限于来源于假单胞菌属(pseudomonassp.)的杀虫蛋白，如pseen3174(monalysin；(2011)plospathogens7：1-13)、源于假单胞菌属(pseudomonasprotegens)的菌株cha0和pf-5(previouslyfluorescens)的杀虫蛋白(pechy-tarr，(2008)environmentalmicrobiology10：2368-2386；genbank登录号eu400157)、源于黄山假单胞菌(pseudomonastaiwanensis)的杀虫蛋白(liu等(2010)j.agric.foodchem.,58：12343-12349)和源于假单胞产碱菌属(pseudomonaspseudoalcligenes)的杀虫蛋白(zhang等(2009)annalsofmicrobiology59：45-50andli等(2007)plantcelltiss.organcult.89：159-168)；来源于发光杆菌属(photorhabdussp.)和致病杆菌(xenorhabdussp.)的杀虫蛋白(hinchliffe等(2010)theopentoxicologyjournal,3：101-118andmorgan,等(2001)appliedandenvir.micro.67：2062-2069)；美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946，美国公开号us2014008054的pip-1多肽，美国系列号13/800233的afip-1a和/或afip-1b多肽，美国系列号13/839702的phi-4多肽和δ-内毒素。所述δ-内毒素包括但不限于，δ-内毒素基因的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10、cry11、cry12、cry13、cry14、cry15、cry16、cry17、cry18、cry19、cry20、cry21、cry22、cry23、cry24、cry25、cry26、cry27、cry28、cry29、cry30、cry31、cry32、cry33、cry34、cry35、cry36、cry37、cry38、cry39、cry40、cry41、cry42、cry43、cry44、cry45、cry46、cry47、cry49、cry51、cry55、cry56、cry57、cry58、cry59、cry60、cry61、cry62、cry63、cry64、cry65、cry66、cry67、cry68、cry69、cry70、cry71和cry72类，和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)细胞溶解的cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的成员包括，但不限于cry1aa1(登录号aaa22353)、cry1aa2(登录号aaa22552)、cry1aa3(登录号baa00257)、cry1aa4(登录号caa31886)、cry1aa5(登录号baa04468)、cry1aa6(登录号aaa86265)、cry1aa7(登录号aad46139)、cry1aa8(登录号i26149)、cry1aa9(登录号baa77213)、cry1aa10(登录号aad55382)、cry1aa11(登录号caa70856)、cry1aa12(登录号aap80146)、cry1aa13(登录号aam44305)、cry1aa14(登录号aap40639)、cry1aa15(登录号aay66993)、cry1aa16(登录号hq439776)、cry1aa17(登录号hq439788)、cry1aa18(登录号hq439790)、cry1aa19(登录号hq685121)、cry1aa20(登录号jf340156)、cry1aa21(登录号jn651496)、cry1aa22(登录号kc158223)、cry1ab1(登录号aaa22330)、cry1ab2(登录号aaa22613)、cry1ab3(登录号aaa22561)、cry1ab4(登录号baa00071)、cry1ab5(登录号caa28405)、cry1ab6(登录号aaa22420)、cry1ab7(登录号caa31620)、cry1ab8(登录号aaa22551)、cry1ab9(登录号caa38701)、cry1ab10(登录号a29125)、cry1ab11(登录号i12419)、cry1ab12(登录号aac64003)、cry1ab13(登录号aan76494)、cry1ab14(登录号aag16877)、cry1ab15(登录号aao13302)、cry1ab16(登录号aak55546)、cry1ab17(登录号aat46415)、cry1ab18(登录号aaq88259)、cry1ab19(登录号aaw31761)、cry1ab20(登录号abb72460)、cry1ab21(登录号abs18384)、cry1ab22(登录号abw87320)、cry1ab23(登录号hq439777)、cry1ab24(登录号hq439778)、cry1ab25(登录号hq685122)、cry1ab26(登录号hq847729)、cry1ab27(登录号jn135249)、cry1ab28(登录号jn135250)、cry1ab29(登录号jn135251)、cry1ab30(登录号jn135252)、cry1ab31(登录号jn135253)、cry1ab32(登录号jn135254)、cry1ab33(登录号aas93798)、cry1ab34(登录号kc156668)、cry1ab-like(登录号aak14336)、cry1ab-like(登录号aak14337)、cry1ab-like(登录号aak14338)、cry1ab-like(登录号abg88858)、cry1ac1(登录号aaa22331)、cry1ac2(登录号aaa22338)、cry1ac3(登录号caa38098)、cry1ac4(登录号aaa73077)、cry1ac5(登录号aaa22339)、cry1ac6(登录号aaa8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8；美国专利号8,236,757中axmi-027、axmi-036和axmi-038；美国专利号7,923,602中axmi-031、axmi-039、axmi-040、axmi-049；wo2006/083891中axmi-018、axmi-020和axmi-021；wo2005/038032中axmi-010；wo2005/021585中axmi-003；美国专利申请公开号2004/0250311中axmi-008；美国专利申请公开号2004/0216186中axmi-006；美国专利申请公开号2004/0210965中axmi-007；美国专利申请号2004/0210964中axmi-009；美国专利申请公开号2004/0197917中axmi-014；美国专利申请公开号2004/0197916中axmi-004；wo2006/119457中axmi-028和axmi-029；wo2004/074462中axmi-007、axmi-008、axmi-0080rf2、axmi-009、axmi-014和axmi-004；us专利号8,084,416中axmi-150；美国专利申请公开号2011/0023184中axmi-205；美国专利申请公开号2011/0263488中axmi-011、axmi-012、axmi-013、axmi-015、axmi-019、axmi-044、axmi-037、axmi-043、axmi-033、axmi-034、axmi-022、axmi-023、axmi-041、axmi-063和axmi-064；美国专利申请公开号2010/0197592中axmi-r1和相关蛋白；wo2011/103248中axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo2011/103247中axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美国专利号8,334,431中axmi-115、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184；美国专利申请公开号2010/0298211中axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045；美国专利申请公开号2009/0144852中axmi-066和axmi-076；美国专利号8,318,900中axmi128、axmi130、axmi131、axmi133、axmi140、axmi141、axmi142、axmi143、axmi144、axmi146、axmi148、axmi149、axmi152、axmi153、axmi154、axmi155、axmi156、axmi157、axmi158、axmi162、axmi165、axmi166、axmi167、axmi168、axmi169、axmi170、axmi171、axmi172、axmi173、axmi174、axmi175、axmi176、axmi177、axmi178、axmi179、axmi180、axmi181、axmi182、axmi185、axmi186、axmi187、axmi188、axmi189；美国专利申请公开号2010/0005543中axmi079、axmi080、axmi081、axmi082、axmi091、axmi092、axmi096、axmi097、axmi098、axmi099、axmi100、axmi101、axmi102、axmi103、axmi104、axmi107、axmi108、axmi109、axmi110、axmi111、axmi112、axmi114、axmi116、axmi117、axmi118、axmi119、axmi120、axmi121、axmi122、axmi123、axmi124、axmi1257、axmi1268、axmi127、axmi129、axmi164、axmi151、axmi161、axmi183、axmi132、axmi138、axmi137；美国专利申请公开号201400962281中axmi232、axmi233和axmi249；美国专利号8,319,019中cry蛋白例如具有修饰蛋白水解位点的cry1a和cry3a；美国专利申请公开号2011/0064710中源于苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)菌株vbts2528的cry1ac、cry2aa和cry1ca毒素蛋白。本领域技术人员熟知的其他cry蛋白(见crickmore等“苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)毒素系统命名法”(2011),atwww.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/)。本领域技术人员熟知cry蛋白的杀虫活性(详见综述，vanfrannkenhuyzen,(2009)j.invert.path.101:1-16)。本领域技术人员熟知cry蛋白作为转基因植物性状，cry-转基因植物已经得到调控许可，这些转基因植物包括但不限于表达cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、cry1fa2、cry1f+cry1ac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、cry9c和cbi-bt的植物(详见sanahuja,(2011)plantbiotechjournal9:283-300和转基因作物数据库中心的环境风险评估gmcropdatabasecenterforenvironmentalriskassessment(2010)(cera),ilsi研究基金会,华盛顿特区www.cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database)。本领域技术人员熟知的在植物中表达的杀虫蛋白包括，例如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)，cry1be&cry1f(us2012/0311746)，cry1ca&cry1ab(us2012/0311745)，cry1&cryca(us2012/0317681)，cry1da&cry1be(us2012/0331590)，cry1da&cry1fa(us2012/0331589)，cry1ab&cry1be(us2012/0324606)，cry1fa&cry2aa和cry1i&cry1e(us2012/0324605)，cry34ab/35ab和cry6aa(us20130167269)，cry34ab/vcry35ab&cry3aa(us20130167268)，和cry3a和cry1ab或vip3aa(us20130116170)。杀虫蛋白也包括杀虫脂肪酶，其包括美国专利号7,491,869的脂酰基水解酶,和诸如源于链霉菌的胆固醇氧化酶(purcell等(1993)biochembiophysrescommun15：1406-1413)。杀虫蛋白也包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686、8,237,020等的vip(vegetativeinsecticidalprotein，植物杀虫蛋白)毒素。本领域技术人员熟知的其他vip蛋白见lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/vip.html。杀虫蛋白也包括源于嗜线虫致病杆菌属(xenorhabdus)、初生型发光杆菌属(photorhabdus)和类芽孢杆菌(paenibacillus)的毒素复合物(toxincomplex(tc))(见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些tc蛋白具有“独立”的杀昆虫活性，其他tc蛋白增强了同一给定有机体产生的独立tc蛋白的活性，“独立”tc蛋白的活性(例如，源于发光杆菌、致病杆菌或芽孢杆菌)能够被一种或多种来源不同种属有机体tc蛋白“增强剂”所增强。主要有三种类型tc蛋白，此处所指的是类型a蛋白(“蛋白质a”)是单体毒素。类型b蛋白(“蛋白质b”)和类型c蛋白(“蛋白质c”)增强类型a蛋白的毒性。类型a蛋白的例子有tcba、tcda、xpta1和xpta2，类型b蛋白的例子有tcac、tcdb、xptb1xb和xptc1wi，类型c蛋白的例子有tccc、xptc1xb和xptb1wi。杀虫蛋白也包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。下面的例子描述了一些代表性的方法和技术用于模拟植物昆虫饲喂条件和/或评估植物在该条件下的抗性状况。1.转化的植物的子代，该转化的植物对于重组dna构建体来说是半合子的，该子代分离成包含或不包含该dna构建体的植株：包含该重组dna构建体的子代将通常相对于不包含该重组dna构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组dna构建体的子代是对照或参照植物)。2.重组dna构建体基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组dna构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。4.包含重组dna构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组dna构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组dna构建体的植株相比较，该遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(rflps)、随机扩增多态性dna(rapds)、任何引物聚合成酶链式反应(ap-pcr)、dna扩增指纹(daf)、序列特异扩增区域(scars)、扩增片段长度多态性()和也称为微卫星的简单序列重复(ssrs)。此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评价或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫类、螨、虱等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、禽虱、同翅目、半翅目、直翅目、缨尾目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。本领域技术人员认识到，并非所有的化合物都能有效的对付所有害虫，本实施例的化合物能够对付昆虫害虫，这些害虫包括经济重要的农业、林业、温室、苗圃花卉、食品和纤维、公众和动物健康、家庭和商业结构、家庭和仓储害虫。鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothine：秋粘虫(spodopterafrugiperdajesmith，fallarmyworm)；甜菜夜蛾(s.exiguahübner，beetarmyworm)；斜纹夜蛾(s.liturafabhcius，tobaccocutworm，clustercaterpillar)；蓓带夜蛾(mamestraconfiguratawalker，berthaarmyworm)；甘蓝夜蛾(m.brassicaelinnaeus，cabbagemoth)；黑切根虫(agrotisipsilonhufnagel，blackcutworm)；西部切根虫(a.orthogoniamorrison，westerncutworm)；颗粒夜蛾(a.subterraneafabricius，granulatecutworm)，木棉虫(alabamaargillaceahübner，cottonleafworm)；粉纹夜蛾(trichoplusianihübner，cabbagelooper)；大豆夜蛾(pseudoplusiaincludenswalker，soybeanlooper)；黧豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner，velvetbeancaterpillar)；苜蓿绿夜蛾(hypenascabrafabricius，greencloverworm)；烟芽夜蛾(heliothisvirescensfabricius，tobaccobudworm)；一星粘虫(pseudaletiaunipunctahaworth,armyworm)；粗皮夜蛾(athetismindarabarnesandmcdunnough，roughskinnedcutworm)；暗缘地老虎(euxoamessoriaharris，darksidedcutworm)；埃及金钢钻(eariasinsulanaboisduval，spinybollworm)；翠纹金钢钻(e.vittellafabricius，spottedbollworm)；美洲棉铃虫(helicoverpaarmigerahübner，americanbollworm)；谷实夜蛾(h.zeaboddie，cornearworm或cottonbollworm)；纹蝶毛虫(melanchrapictaharris，zebracaterpillar)；柑橘夜蛾(egira(xylomyges)curialisgrote，citruscutworm)；mythimnaseparate(orientalarmyworm)；草螟科(crambidae)的钻蛀虫、鞘蛾幼虫、结网毛虫、球果蛾以及草蛾：亚洲玉米螟(ostriniafurnacalis，asiancornborer)；欧洲玉米螟(ostrinianubilalis，europeancornborer)和；螟蛾科(pyralidae)欧洲玉米螟(ostrinianubilalishübner，europeancornborer)的食叶虫(skeletonizers)；脐橙螟(amyeloistransitellawalker，navalorangeworm)；地中海粉斑螟(anagastakuehniellazeller，mediterraneanflourmoth)；干果斑螟(cadracautellawalker，almondmoth)；二化螟(chilosuppressaliswalker，ricestemborer)；斑禾草螟(c.partellus，sorghumborer)；米蛾(corcyracephalonicastainton，ricemoth)；玉米根结网毛虫(crambuscaliginosellusclemens，cornrootwebworm)；蓝草结网毛虫(c.teterrelluszincken，bluegrasswebworm)；稻纵卷叶野螟(cnaphalocrocismedinalisguenee，riceleafroller)；葡萄卷叶虫(desmiafuneralishübner，grapeleaffolder)；甜瓜野螟(diaphaniahyalinatalinnaeus，melonworm)；泡菜虫(d.nitidalisstoll，pickleworm)；西南玉米螟(diatraeagrandioselladyar，southwesterncornborer)；小蔗螟(d.saccharalisfabricius，surgarcaneborer)；墨西哥水稻螟(eoreumaloftinidyar，mexicanriceborer)；烟草粉螟(ephestiaelutellahübner，tobacco(cacao)moth)；蜡螟(galleriamellonellalinnaeus，greaterwaxmoth)；野螟(herpetogrammalicarsisaliswalker，sodwebworm)；向日葵斑螟(homoeosomaelectellumhulst，sunflowermoth)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignoselluszeller，lessercornstalkborer)；小蜡螟(achroiagrisellafabricius，lesserwaxmoth)；草地螟(loxostegesticticalislinnaeus，beetwebworm)；茶树螟(orthagathyrisaliswalker，teatreewebmoth)；豆野螟(marucatestulalisgeyer，beanpodborer)；印度谷螟(plodiainterpunctellahübner，indianmealmoth)；三化螟(scirpophagaincertulaswalker，yellowstemborer)；温室螟(udearubigalisguenee，celeryleaftier)；以及卷蛾科(tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫：黑头卷叶蛾(aclerisgloveranawalsingham，westernblackheadedbudworm)；黑头长翅卷蛾(a.varianafernald，easternblackheadedbudworm)；果树黄卷蛾(archipsargyrospilawalker，fruittreeleafroller)；欧洲卷叶蛾(a.rosanalinnaeus，europeanleafroller)；以及其他的黄卷蛾属(archips)物种：棉褐带卷蛾(adoxophyesoranafischervonsummerfruittortrixmoth)；条纹向日葵螟(cochylishospeswalsingham，bandedsunflowermoth)；榛小卷蛾(cydialatiferreanawalsingham，filbertworm)；苹果蠹蛾(c.pomonellalinnaeus，codingmoth)；杂色卷叶蛾(platynotaflavedanaclemens，variegatedleafroller)；荷兰石竹小卷蛾(p.stultanawalsingham，omnivorousleafroller)；欧洲葡萄小卷叶蛾(lobesiabotranadenis&schiffermüller，europeangrapevinemoth)；苹白小卷蛾(spilonotaocellanadenis&schiffermüller，eyespottedbudmoth)；萄果实蛀虫(endopizaviteanaclemens，grapeberrymoth)；女贞细卷蛾(eupoeciliaambiguellahübner，vinemoth)；巴西苹果卷叶蛾(bonagotasalubricolameyrick，brazilianappleleafroller)；梨小食心虫(grapholitamolestabusck，orientalfruitmoth)；向日葵芽蛾(suleimahelianthanariley，sunflowerbudmoth)；条卷蛾(argyrotaeniaspp.)；尾蛱蝶(choristoneuraspp.)。鳞翅目的所选其它农艺害虫包括但不限于：秋星尺蠖(alsophilapometariaharris，fallcankerworm)；桃枝麦蛾(anarsialineatellazeller，peachtwigborer)；犀额蛾(anisotasenatoriaj.e.smith，orangestripedoakworm)；柞蚕(antheraeapernyiguerin-meneville，chineseoaktussahmoth)；家蚕(bombyxmorilinnaeus，silkworm)；棉潜蛾(bucculatrixthurberiellabusck，cottonleafperforator)；苜蓿黄蝶(coliaseurythemeboisduval，alfalfacaterpillar)；胡桃黄蝶(datanaintegerrimagrote&robinson，walnutcaterpillar)；落叶松毛虫(dendrolimussibiricustschetwerikov，siberiansilkmoth)；白尺蠖(ennomossubsignariahübner，elmspanworm)；菩提尺蠖(erannistiliariaharris，lindenlooper)；黄毒蛾(euproctischrysorrhoealinnaeus，browntailmoth)；黑拟蛉蛾(harrisinaamericanaguerin-meneville，grapeleafskeletonizer)；范围毛虫飞蛾(hemileucaoliviaecockrell，rangecaterpillar)；美国白蛾(hyphantriacuneadrury，fallwebworm)；番茄蠹蛾(keiferialycopersicellawalsingham，tomatopinworm)；二尾蛱蝶(lambdinafiscellariafiscellariahulst，easternhemlocklooper)；西部铁杉尺蠖(l.fiscellarialugubrosahulst，westernhemlocklooper)；柳毒蛾(leucomasalicislinnaeus，satinmoth)；舞毒蛾(lymantriadisparlinnaeus，gypsymoth)；番茄天蛾(manducaquinquemaculatahaworth，fivespottedhawkmoth，tomatohornworm)；烟草天蛾(m.sextahaworth，tomatohornworm，tobaccohornworm)；冬尺蠖(operophterabrumatalinnaeus，wintermoth)；春尺蠖(paleacritavernatapeck，springcankerworm)；大凤蝶(papiliocresphontescramer，giantswallowtail，orangedog)；加州株虫(phryganidiacalifornicapackard，californiaoakworm)；柑橘潜叶蛾(phyllocnistiscitrellastainton，citrusleafminer)；斑幕潜叶蛾(phyllonorycterblancardellafabricius，spottedtentiformleafminer)；大菜粉蝶(pierisbrassicaelinnaeus，largewhitebutterfly)；小菜粉蝶(p.rapaelinnaeus，smallwhitebutterfly)；暗脉菜粉蝶(p.napilinnaeus，greenveinedwhitebutterfly)；洋蓟羽蛾(platyptiliacarduidactylariley，artichokeplumemoth)；菱斑饿(plutellaxylostellalinnaeus，diamondbackmoth)；棉红铃虫(pectinophoragossypiellasaunders，pinkbollworm)；南方菜蛾(pontiaprotodiceboisduval&leconte，southerncabbageworm)；杂食尺蠖(sabulodesaegrotataguenee，omnivorouslooper)；康辛蠊(schizuraconcinnaj.e.smith，redhumpedcaterpillar)；麦蛾(sitotrogacerealellaolivier，angoumoisgrainmoth)；松异带蛾(thaumetopoeapityocampaschiffermuller，pineprocessionarycaterpillar)；结网衣蛾(tineolabisselliellahummel，webbingclothesmoth)；番茄斑潜蝇(tutaabsolutameyrick，tomatoleafminer)；苹果巢蛾(yponomeutapadellalinnaeus，erminemoth)；heliothissubflexaguenee；天幕毛虫(malacosomaspp)；以及毒蛾(orgyiaspp)。鞘翅目的幼虫和成虫包括长角象鼻虫科(anthribidae)、豆象科(bruchidae)以及象甲科(curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：棉铃象甲(anthonomusgrandisboheman，bollweevil)；稻水象甲(lissorhoptrusoryzophiluskuschel，ricewaterweevil)；谷象(sitophilusgranariuslinnaeus，granaryweevil)；米象(s.oryzaelinnaeus，riceweevil)；车轴草叶象虫(hyperapunctatafabricius，cloverleafweevil)；向日葵茎象甲(cylindrocopturusadspersusleconte，sunflowerstemweevil)；红色葵花籽象甲虫(smicronyxfulvusleconte，redsunflowerseedweevil)；灰色葵花籽象甲虫(s.sordidusleconte，graysunflowerseedweevil)；玉米象虫(sphenophorusmaidischittenden，maizebillbug)；叶甲科(chrysomelidae)的跳骚甲虫、黄瓜叶甲虫、根虫、叶甲虫、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：科罗拉多州马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineatasay，coloradopotatobeetle)；玉米根萤叶甲(diabroticavirgiferavirgiferaleconte，westerncornrootworm)；巴氏根叶甲(d.barberismith&lawrence，northerncornrootworm)；南方玉米根虫(d.undecimpunctatahowardibarber，southerncornrootworm)；玉米跳甲(chaetocnemapulicariamelsheimer，cornfleabeetle)；十字花科蔬菜跳甲(phyllotretacruciferaegoeze，cruciferfleabeetle)；黄曲条跳甲(phyllotretastriolata，strippedfleabeetle)；葡萄肖叶甲(colaspisbrunneafabricius，grapecolaspis)；黑角负泥虫(oulemamelanopuslinnaeus，cerealleafbeetle)；向日葵叶甲(zygogrammaexclamationisfabricius，sunflowerbeetle))；瓢虫科(coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(epilachnavarivestismulsant，mexicanbeanbeetle)；蜣螂科(scarabaeidae)的金龟子和其他的甲虫(包括但不限于：日本金龟子(popilliajaponicanewman，japanesebeetle)；北方圆头犀金龟(cyclocephalaborealisarrow，northernmaskedchafer，whitegrub)；南方圆头犀金龟(c.immaculataolivier，southernmaskedchafer，whitegrub)；欧洲金龟(rhizotrogusmajalisrazoumowsky，europeanchafer)；蛴螬(phyllophagacrinitaburmeister，whitegrub)；胡萝卜甲虫(ligyrusgibbosusdegeer，carrotbeetle))；皮蠹科(dermestidae)的地毯圆皮蠹；叩甲科(elateridae)的线虫：伪金针虫(eleodesspp.)、梳抓叩头虫(melanotusspp.)、单叶叩甲(conoderusspp.)、金针虫(limoniusspp.)、锥尾叩甲(agriotesspp.)、叩甲属(cteniceraspp.)、aeolusspp.；小蠹科(scolytidae)的小蠹虫以及拟步甲科(tenebrionidae)的甲虫。双翅目的成虫和幼虫包括：诸如玉米斑潜叶蝇(agromyzaparvicornisloew，cornblotchleafminer)的潜叶蝇；蚊(包括但不限于：高粱瘿蚊(contariniasorghicolacoquillett，sorghummidge)；黑森瘿蚊(mayetioladestructorsay，hessianfly)；麦红吸浆虫(sitodiplosismosellanagehin，wheatmidge)；葵花籽蚊(neolasiopteramurtfeldtianafelt，sunflowerseedmidge))；果蝇(实蝇科(tephritidae))，瑞典秆蝇(oscinellafritlinnaeus，fritflies)；蛆(包括但不限于：灰地种蝇(deliaplaturameigen，seedcornmaggot)；麦种蝇(d.coarctatafallen，wheatbulbfly)；以及其它地种蝇(deliaspp.)，美洲秆蝇(meromyzaamericanafitch，wheatstemmaggot)；舍蝇(muscadomesticalinnaeus，houseflies)；夏厕蝇(fanniacanicularislinnaeus)，小舍蝇(f.femoralisstein，lesserhouseflies)；厩螫蝇(stomoxyscalcitranslinnaeus，stableflies))；秋家蝇、角蝇、丽蝇、金蝇(chrysomyaspp.)；伏蝇(phormiaspp.)；以及其他的苔藓蝇害虫，马蝇，虻(tabanusspp.)；胃蝇(gastrophilusspp.)；狂蝇(oestrusspp.)；牛蛆蝇(hypodermaspp.)；斑虻(chrysopsspp.)；绵羊虱蝇(melophagusovinuslinnaeus，keds)；以及其他的短角亚目(brachycera)，蚊子，伊蚊(aedesspp.)；按蚊(anophelesspp.)；库蚊(culexspp.)；黑蝇，原蚋(prosimuliumspp.)；蚋(simuliumspp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(nematocera)。半翅目和同翅目的成虫和若虫包括昆虫，诸如但不限于：球蚜科(adelgidae)的球蚜、盲蝽科(miridae)的盲蝽、蝉科(cicadidae)的蝉、叶蝉科(cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉(empoascaspp.)；大叶禅科(cicadellidae)的大叶青禅，菱飞虱科(cixiidae)、蛾蜡蝉科(flatidae)、蜡蝉总科(fulgoroidea)、圆飞虱科(issidae)以及稻虱科(delphacidae)的飞虱；角蝉科(membracidae)的角蝉；木虱科(psyllidae)的木虱；粉虱科(aleyrodidae)的粉虱；蚜科(aphididae)的蚜虫；根瘤蚜科(phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(pseudococcidae)的粉蚧；链介壳虫科(asterolecanidae)、软介壳虫科(coccidae)、洋红蚧科(dactylopiidae)、盾介壳虫科(diaspididae)、绒蚧科(eriococcidae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、刺葵介壳虫科(phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(margarodidae)的介壳虫；纲蝽科(tingidae)的网蝽；蝽科(pentatomidae)的九香虫；长蝽科(lygaeidae)的麦长蝽，长椿(blissusspp.)；以及其他的蝽类(seedbugs)，沫蝉科(cercopidae)的沫蝉、缘蝽科(coreidae)的南瓜缘蝽、以及红蝽科(pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。同翅目中农艺上重要的成员还包括但不限于：豌豆蚜(acyrthisiphonpisumharris，peaaphid)；豇豆蚜(aphiscraccivorakoch，cowpeaaphid)；黑豆蚜(a.fabaescopoli，blackbeanaphid)；棉蚜(a.gossypiiglover，cottonaphid，melonaphid)；玉米根蚜(a.maidiradicisforbes，cornrootaphid)；苹果黄蚜(a.pomidegeer，appleaphid)；绣线菊蚜(a.spiraecolapatch，spireaaphid)；茄沟无网蚜(aulacorthumsolanikaltenbach，foxgloveaphid)；草莓钉蚜(chaetosiphonfragaefoliicockerell，strawberryaphid)；麦双尾蚜(diuraphisnoxiakurdjumov/mordvilko，russianwheataphid)；玫瑰苹果蚜(dysaphisplantagineapaaserini，rosyappleaphid)；苹果绵蚜(eriosomalanigerumhausmann，woollyappleaphid)；甘蓝蚜(brevicorynebrassicaelinnaeus，cabbageaphid)；桃粉大尾蚜(hyalopterusprunigeoffroy，mealyplumaphid)；萝卜蚜(lipaphiserysimikaltenbach，turnipaphid)；麦无网长管蚜(metopolophiumdirrhodumwalker，cerealaphid)；大戟长管蚜(macrosiphumeuphorbiaethomas，potatoaphid)；烟桃蚜(myzuspersicaesulzer，peach-potatoaphid，greenpeachaphid)；莴苣蚜(nasonoviaribisnigrimosley，lettuceaphid)；瘿绵蚜(pemphigusspp.，rootaphids和gallaphids)；玉米蚜(rhopalosiphummaidisfitch，cornleafaphid)；禾谷缢管蚜(r.padilinnaeus，birdcherry-oataphid)；麦二叉蚜(schizaphisgraminumrondani，greenbug)；黄色甘蔗蚜(siphaflavaforbes，yellowsugarcaneaphid)；麦长管蚜(sitobionavenaefabricius，englishgrainaphid)；苜蓿斑蚜(therioaphismaculatabuckton,spottedalfalfaaphid)；黑色柑橘蚜(toxopteraaurantiiboyerdefonscolombe,blackcitrusaphid)以及褐色桔蚜(t.citricidakirkaldy,browncitrusaphid)；球蚜(adelgesspp.,adelgids)；长山核桃根瘤蚜(phylloxeradevastatrixpergande,pecanphylloxera)；甘薯粉虱(bemisiatabacigennadius,tobaccowhitefly,sweetpotatowhitefly)；银叶粉虱(b.argentifoliibellows&perring,silverleafwhitefly)；柑桔粉虱(dialeurodescitriashmead,citruswhitefly)；烟粉虱(trialeurodesabutiloneus,bandedwingedwhitefly)以及温室白粉虱(t.vaporariorumwestwood,greenhousewhitefly)；马铃薯小绿叶蝉(empoascafabaeharris,potatoleafhopper)；灰飞虱(laodelphaxstriatellusfallen,smallerbrownplanthopper)；紫菀叶蝉(macrolestesquadrilineatusforbes,asterleafhopper)；黑尾叶蝉(nephotettixcinticepsuhler,greenleafhopper)；二条黑尾叶蝉(n.nigropictusstal,riceleafhopper)；褐飞虱(nilaparvatalugensstal,brownplanthopper)；玉米飞虱(peregrinusmaidisashmead,cornplanthopper)；白背飞虱(sogatellafurciferahorvath,white-backedplanthopper)；稻飞虱(sogatodesorizicolamuir,ricedelphacid)；苹果白叶蝉(typhlocybapomariamcatee,whiteappleleafhopper)；葡萄叶蝉(erythroneouraspp.,grapeleafhoppers)；十七年蝉(magicicadaseptendecimlinnaeus,periodicalcicada)；吹绵蚧(iceryapurchasimaskell,cottonycushionscale)；梨园盾蚧(quadraspidiotusperniciosuscomstock,sanjosescale)；柑桔臀纹粉蚧(planococcuscitririsso,citrusmealybug)；粉蚧的种(pseudococcusspp.)(其他的粉蚧系群)；梨木虱(cacopsyllapyricolafoerster,pearpsylla)；柿木虱(triozadiospyriashmead,persimmonpsylla)。半翅目中农艺上重要的物种包括但不限于：稻绿蝽(acrosternumhilaresay,greenstinkbug)；南瓜缘蝽(anasatristisdegeer,squashbug)；麦长蝽(blissusleucopterusleucopterussay,chinchbug)；方翅网蝽(corythucagossypiifabricius,cottonlacebug)；番茄蝽(cyrtopeltismodestadistant,tomatobug)；棉蝽(dysdercussuturellusherrich-schaffer,cottonstainer)；褐臭蝽(euschistusservussay,brownstinkbug)；一斑臭蝽(e.variolariuspalisotdebeauvois,one-spottedstinkbug)；长蝽(graptostethusspp.)(果实蝽系群(complexofseedbugs))；松叶根蝽(leptoglossuscorculussay,leaf-footedpineseedbug)；美国牧草盲蝽(lyguslineolarispalisotdebeauvois,tarnishedplantbug)；豆荚草盲蝽(l.hesperusknight,westerntarnishedplantbug)；牧草盲蝽(l.pratensislinnaeus,commonmeadowbug)；长毛草盲蝽(l.rugulipennispoppius,europeantarnishedplantbug)；长绿盲蝽(lygocorispabulinuslinnaeus,commongreencapsid)；水稻稻绿蝽(nezaraviridulalinnaeus,southerngreenstinkbug)；稻蝽(oebaluspugnaxfabricius,ricestinkbug)；突角长蝽(oncopeltusfasciatusdallas,largemilkweedbug)；棉盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter,cottonfleahopper)。半翅目中包括的害虫包括：草莓蝽(calocorisnorvegicusgmelin,strawberrybug)；orthopscampestrislinnaeus；苹盲蝽(plesiocorisrugicollisfallen,applecapsid)；番茄蝽(cyrtopeltismodestusdistant,tomatobug)；烟草小盲蝽(cyrtopeltisnotatusdistant,suckfly)；白斑盲蝽(spanagonicusalbofasciatusreuter,whitemarkedfleahopper)；皂荚蝽(diaphnocorischlorionissay,honeylocustplantbug)；洋葱蝽(labopidicolaalliiknight,onionplantbug)；棉盲蝽(pseudatomoscelisseriatusreuter,cottonfleahopper)；苜蓿褐盲蝽(adelphocorisrapidussay,rapidplantbug)；四线盲蝽(poecilocapsuslineatusfabricius,four-linedplantbug)；拟麦长蝽(nysiusericaeschilling,falsechinchbug)；茶黄蓟马(nysiusraphanushoward,falsechinchbug)；稻青蝽(nezaraviridulalinnaeus,southerngreenstinkbug)；扁盾蝽(eurygasterspp.)；缘蝽(coreidaespp.)；红蝽(pyrrhocoridaespp.)；谷蛾(tinidaespp.)；负子蝽(blostomatidaespp.)；猎蝽(reduviidaespp.)；以及臭蝽(cimicidaespp.)。螨(acari)(螨(mites)目的成虫和幼虫包括：小麦卷叶螨(aceriatosichellakeifer,wheatcurlmite)；褐色小麦螨(petrobialatensmüller,brownwheatmite)；叶螨科(tetranychidae)的蛛螨和恙螨，欧洲叶螨(panonychusulmikoch,europeanredmite)；二斑叶螨(tetranychusurticaekoch,twospottedspidermite)；迈叶螨(t.mcdanielimcgregor,mcdanielmite)；朱砂叶螨(t.cinnabarinusboisduval,carminespidermite)；土耳其斯坦叶螨(t.turkestaniugarov&nikolski,strawberryspidermite)；细须螨科(tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短须螨(brevipalpuslewisimcgregor,citrusflatmite)；瘿螨科(eriophyidae)的锈螨和芽廮螨以及其他的食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即蜻科(epidermoptidae)中的锈螨，蠕形螨科(demodicidae)中的毛囊虫，食甜螨科(glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(ixodidae)的扁虱，黑脚硬蜱(ixodesscapularissay,deertick)；全环硬蜱(i.holocyclusneumann,australianparalysistick)；美国狗壁虱(dermacentorvariabilissay,americandogtick)；美洲壁虱(amblyommaamericanumlinnaeus,lonestartick)；以及痒螨科(psoroptidae)、蒲螨科(pyemotidae)和疥螨科(sarcoptidae)的痒螨和疥螨。缨尾目(thysanura)中的昆虫害虫是值得关注的，诸如西洋衣鱼(lepismasaccharinalinnaeus,silverfish)；小灶衣鱼(thermobiadomesticapackard,firebrat)。所涵盖的其他节肢害虫包括蜘蛛目(araneae)中的蜘蛛，如棕色隐遁蜘蛛(loxoscelesreclusagertsch&mulaik,brownreclusespider)；和黑寡妇蜘蛛(latrodectusmactansfabricius,blackwidowspider)；和蚰蜒目(scutigeromorpha)的蜈蚣，如蚰蜒(scutigeracoleoptratalinnaeus,housecentipede)。所关注的昆虫害虫包括蝽象总科和其他相关昆虫的总科，包括但不限于蝽象科(稻绿蝽(nezaraviridula),茶翅蝽(halyomorphahalys),璧蝽(piezodorusguildini),褐臭蝽(euschistusservus),拟缘蝽(acrosternumhilare),大豆褐蝽(euschistusheros),euschistustristigmus,dichelopsfurcatus,dichelopsmelacanthus,and菘蝽(bagradahilaris))、龟蝽科(筛豆龟蝽-豆圆蝽(megacoptacribraria-beanplataspid)和土蝽科(根椿象(scaptocoriscastanea-rootstinkbug))的物种；以及鳞翅目的物种，包括但不限于菜蛾(diamond-backmoth)，如美洲棉铃虫(helicoverpazeaboddie)；大豆尺蠖(soybeanlooper)，如大豆夜蛾；以及黧豆毛虫(velvetbeancaterpillar)，如黧豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)。线虫包括寄生性线虫，例如根结、胞囊和病变线虫，包括胞囊线虫属物种(heteroderaspp.)、根结线虫属物种(meloidogynespp.)和球异皮线虫属物种(globoderaspp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于，大豆胞囊线虫(heteroderaglycines，soybeancystnematode)；甜菜胞囊线虫(heteroderaschachtii，beetcystnematode)；禾谷胞囊线虫(heteroderaavenae，cerealcystnematode)以及马铃薯金线虫(globoderarostochiensis)和马铃薯白线虫(globoderapailida，potatocystnematodes)。病变线虫包括短体线虫属物种(pratylenchusspp.)。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如，czaplaandlang，(1990)j.econ.entomol.83：2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252：199-206；marrone等，(1985)j.ofeconomicentomology78：290-293以及美国专利号5,743,477，所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般来讲，将蛋白混合并用于摄食测定。参见例如marrone等(1985)j.ofeconomicentomology78：290-293。此类测定法可包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。如本文所用，“杀虫活性”是指生物体或物质(诸如，例如蛋白)的活性，不管生物体活物质是有有毒或抑制，其测量可以通过但不限于，害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性(repellency)、害虫生长发育迟缓以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。因而，具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响至少一种可测量的害虫健康参数。同样，“杀昆虫活性”是指害虫是昆虫时的“杀虫活性”。“阻碍生长发育”是指大于50％按重量的生长抑制。例如，“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。监测杀昆虫活性的一般程序包括将试验性化合物或生物体添加到密封容器中的食物来源中。评价杀虫活性的试验是本领域熟知的。参见例如美国专利号6,570,005和6,339,144，文献全文以引用方式并入本文。所关注的昆虫用于测试杀昆虫活性的最佳发育阶段是幼虫或不成熟的昆虫。昆虫可以在完全黑暗、20～30℃和30％～70％的相对湿度下饲养。生物测定可以根据czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83(6)：2480-2485的描述进行操作。饲养昆虫幼虫的方法和生物测定的方法是本领域的普通技术人员熟知的。杀昆虫蛋白的毒性和抑制作用包括但不限于，与取食野生植物相比，取食转基因植物阻碍幼虫生长发育、杀死虫卵或者幼虫、减轻成虫或者幼虫的体重；诱导昆虫取食、筑巢或育种的回避行为。植物的抗昆虫性可以有将编码杀昆虫蛋白的核酸序列引入有机体或对有机体(如植物或植物的一部分)施用杀昆虫物质而赋予，其中杀昆虫物质包括但不限于杀昆虫蛋白。正如本文所用，“控制害虫群体”或“控制害虫”指限制害虫造成的损害的对害虫的任意影响。控制害虫包括但不限于，杀死害虫、抑制害虫发育、改变害虫的育性或发育以致害虫对植物产生更小的损害，减少害虫产生后代的数量、产生发育不良的害虫，产生的害虫更容易受到捕食者攻击或阻止害虫取食植物。方法：方法包括但不限于：用于增强植物抗虫性的方法、用于评价植物抗虫性的方法、用于控制昆虫种群的方法，用于杀死昆虫种群的方法，用于控制昆虫种群对杀昆虫多肽抗性的方法，和用于制备种子的方法。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米、拟南芥或大豆植物。植物还可以是向日葵、高梁、加拿大油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦或黍。所述种子可为水稻、玉米、拟南芥或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。方法包括但不限于如下方法：转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞例如细菌细胞。产生转基因植物的方法，其包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组dna构建体来转化植物细胞并由转化的植物细胞再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组dna构建体，所述重组dna构建体包含本发明的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组dna构建体表达的条件下生长。改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组dna构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组dna构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组dna构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。增强植物抗虫性的方法，包括(a)将重组dna构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组dna构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述所述多肽具有的氨基酸序列在与seqidno：6或14进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组dna构建体并且在与不包含所述重组dna构建体的对照植物进行比较时表现出增强的抗虫性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组dna构建体并且在与不包含所述重组dna构建体的对照植物进行比较时表现出增强的抗虫性。增强植物抗虫性的方法，包括(a)将重组dna构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组dna构建体包含可操作地连接至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有抗虫活性的多肽crk6或mfs5；和(b)由步骤(a)的再生植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含dna构建体，转基因植物中crk6或mfs5多肽的表达增加，并且当与不包含dna构建体的对照植物相比时显示增强的抗虫性。该方法还进一步包括(c)获得源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含dna构建体，具有表达量增加的crk6或mfs5多肽，并且与不含dna构建体的对照植物相比显示增加的抗虫性。在一些实施方案中，控制害虫的方法包括在植物中过表达crk6或mfs5多肽，在一些实施方案中，控制害虫的方法包括用本发明的dna构建体转化植物或植物细胞。在一些实施方案中，杀死害虫的方法包括在植物中过表达crk6或mfs5多肽。在一些实施方案中，杀死害虫的方法包括用本发明的dna构建体转化植物或植物细胞。评估植物抗虫性的方法包括：(a)将重组dna构建体导入到可再生植物细胞中，所述重组dna构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(例如植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列在与seqidno：6或14比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组dna构建体；和(c)与不包含dna构建体的对照植物相比评估转基因植物抗虫性。该方法可进一步包括(d)获得源于转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组dna构建体；和(e)与不包含重组dna构建体的对照植物相比评估子代植物的抗虫性。产生种子的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组dna构建体。在一些实施方案中，本发明中的种子在其基因组中包含本发明的重组dna构建体种子处理：为了保护并提高产率产量和性状技术，种子处理剂选项可提供另外的作物计划灵活性以及对于昆虫、杂草和病害的有效成本控制。可用一种或多种本文批露的杀昆虫蛋白或多肽处理种子材料，例如用上述种子处理剂应用于种子，该种子含有转基因性状的转基因玉米、大豆、芸苔、棉花或水稻。将本文披露的一种或多种杀昆虫蛋白或多肽与其他传统色种子处理剂组合是预期的。可用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物，对种子材料进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与在配制领域中惯常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起配制。包衣可以通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿或干制剂涂覆来实施。可用作种子处理剂的各种类型化合物的例子在由英国农作物保护委员会(britishcropproductioncouncil)出版的thepesticidemanual：aworldcompendium，c.d.s.tomlined.(《杀虫剂手册：世界纲要》，c.d.s.tomlin编辑)中提供，该文献据此以引用方式并入。可用于作物种子上的一些种子处理剂包括但不限于如下的一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-s-甲基、阿维菌素、杀草强、氧环唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(bradyrhizobiumspp.)(包括甜菜慢生根瘤菌、加那利慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、辽宁慢生根瘤菌、地瓜慢生根瘤菌和/或圆明园慢生根瘤菌中的一种或多种)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、氰虫酰胺、苯醚甲环唑、土菌灵(etidiazole)、氟虫腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮(isoflavenoids)、脂壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、pcnb、戊苯吡菌胺、青霉属、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫酰胺、s-异丙甲草胺、皂草苷、环苯吡菌胺、tcmtb、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。pcnb种子包衣是指epa注册号00293500419，含有五氯硝基苯和依得利。tcmtb是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。可测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪种种子处理剂选项和施用速率可补充此类品种和转基因性状以提高产量。例如，具有良好产量潜力但存在丝黑穗病易感性的品种可受益于提供防丝黑穗病的保护的种子处理剂的使用，具有良好产量潜力但存在胞囊线虫易感性的品种可受益于提供防胞囊线虫的保护的种子处理剂的使用，以此类推。同样地，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂所赋予的第二作用模式，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂和增强植物对该除草剂的抗性的安全剂，等等。此外，由种子处理剂的适当使用所引起的良好根系建成和提早出苗可使得在与种子处理剂结合时包含特定性状的一个品种或多个品种更有效地使用氮、抵御干旱的能力更佳、以及产量潜力总体增加。在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中确定转基因植物农艺性状改变的步骤，如果适当，可包括确定在可变的环境条件下，与不包含重组dna构建体的对照植物相比，转基因植物是否显示至少一种农艺性状的变化。在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中确定转基因子代植物农艺性状改变的步骤，如果适当，可包括确定在可变的环境条件下，与不包含重组dna构建体的对照植物相比，转基因子代植物是否显示至少一种农艺性状的变化。在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于近交玉米植株。在前述任意方法或本文披露的其他实施方案中的任意方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。在前述任意方法或本文披露的其他实施方案的任意方法中，存在将重组dna构建体导入再生植物细胞的可替代方法，所述重组dna构建体包含可操作地与至少一个调节序列连接的多核苷酸。例如，将调控序列(诸如一个或多个增强子、可作为转座元件的一部分)导入再生植物细胞中，然后筛选调控序列可操作地与即时披露的编码多肽的内源基因连接的转基因事件。将本文披露的重组dna构建导入植物的适当的技术，包括，但不限于直接dna吸收、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、转染、载体介导dna转移、轰击、或农杆菌介导的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号wo2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。另外，也有修饰或改变宿主内源基因组dna的方法，包括改变宿主天然dna序列或调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如wo2009/114321；gao等(2010)plantjournal1：176-187)。其他的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如urnov等(2010)natrevgenet.11(9)：636-46；shukla等(2009)nature459(7245)：437-41)。转录激活因子类似-dna修饰酶(transcriptionactivator-likeeffector-dnamodifyingenzyme，tale或talen)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如us20110145940,cermak等(2011)nucleicacidsres.39(12)和boch等(2009),science326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌ii型crispr(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/cas(crispr关联蛋白，crispr-associated)系统，参考例如belhaj等(2013),plantmethods9:39.crispr/cas系统可以允许可定制的小的非编码rna引导的基因组dna靶向切割。本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。转基因植物中性状的堆叠转基因植物可包含本文所公开的一个或多个杀昆虫多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含所关注多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本文所公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的两种或更多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。实施例本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。实施例1.水稻激活标签突变体库的构建本研究使用含有4xcamv35s增强子的t-dna插入双元载体，采用林拥军和张启发描述的农杆菌介导法转化中花11号水稻(oryzasatival.)(linandzhang((2005)plantcellrep.23:540-547)，构建水稻激活标签突变体库。中花11号水稻是中国农业科学院作物研究所培育的，我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子。使用t-dna插入双元载体转化中花11号水稻胚诱导的愈伤组织，产生转基因株系苗，收获的转基因种子构成突变体库。实施例2.筛选以鉴定实验室条件下亚洲玉米螟(ostriniafurnacalis)抗性增强的幼苗株系亚洲玉米螟(acb，ostriniafurnacalis(guenée))是亚洲玉米的重要昆虫害虫，分布在中国大陆、澳大利亚以及所罗门岛屿。在其北部区域，每年蛾会产生一到几代，在热带区域，世代之间是连续并重叠的。毛虫通过损害籽粒和取食穗、叶和茎导致玉米产量损失严重，毛虫主要在植物的生殖器官部分存活和生长。其它受为害的经济作物包括辣椒、生姜和高粱。近来，亚洲玉米螟似乎已成为棉花的重要害虫，一些野生杂草也成为亚洲玉米螟的宿主(d.m.nafusa和i.h.schreinera.2012.reviewofthebiologyandcontroloftheasiancornborer,ostriniafurnacalis(lep：pyralidae)tropicalpestmanagement.37:41-56)。亚洲玉米螟被用于鉴定可以抑制幼虫发育的水稻atl，acb饲养种群来自中国农科院植物保护研究所室内饲养种群，在室内温度25～27℃，相对湿度60％～80％，光周期16l:8d条件下饲养10代以上。幼虫用人工饲料饲养(周大荣,叶志华,王振营，1995)，成虫产卵后，将卵纸保存于27℃培养箱中孵化，以初孵幼虫作为试虫。除其他说明外，t2代转基因种子(在绿色荧光灯下发红光的种子)被用于昆虫抗性试验。每个激活标签株系(atl)取150粒种子，于32℃800ppm多菌灵消毒8h后，冲洗3～5次，然后将种子置于铺上一层湿纱布的培养皿中(12x12cm)。发芽的种子用蒸馏水在28℃培养10天时，苗高8～10cm即可用于试验。筛选方法：以32孔板(每孔4cmx4cmx2cm，pitman,n.j.usa-609-582-2392)作为实验器材，在每孔中加入1％的琼脂保湿，琼脂量约为1/3孔体积。32-孔板分成8个区域，每个区域4个孔，插入同一个atl幼苗。20株水稻幼苗去除根和种子后插入到每个孔的琼脂中，然后使用毛笔将6头玉米螟初孵幼虫接入幼苗中，盖上特殊的膜盖(pitman,n.j.usa-609-582-2392)。zh11-tc(组织培养的zh11)用作对照，对照水稻苗随机置于32孔板的不同区域。将装有水稻幼苗和亚洲玉米螟幼虫的32孔板，放置于27℃，相对湿度60％的环境下培养，从第二天开始每天将32-孔板旋转90度。5天后，目测观察acb的发育状态，并计算抗性值。5天后，每株系每孔取3头最大的幼虫，和对照zh11-tc孔中幼虫相比，根据表2给出抗性值。如果对照孔发育至三龄，atl孔中幼虫发育状态正常，那么atl的抗性值为0；如果atl孔中发育至二龄，幼虫比对照幼虫比较小，那么atl的抗性值为1；如果atl孔中幼虫发育至一龄，atl孔中幼虫很小，那么atl的抗性值为2。幼虫生长抑制率是亚洲玉米螟抗性试验的一个指标，是指抑制数除以统计总虫数的百分比，其中抑制数是将4个孔中12头试虫的观测值相加的总和；统计总虫数是指观察到的所有虫的数量与一龄幼虫的数量相加的总和。使用卡方测验进行统计学分析，p<0.01时记为亚洲玉米螟抗性阳性。表2.玉米螟及粘虫试验打分的分级标准第一轮筛选中亚洲玉米螟抗性阳性株系会进一步筛选(第二轮筛选和第三轮筛选)，每轮两次重复，三次筛选为阳性的atls被认为是亚洲玉米螟抗性株系。筛选结果：1)ah43610幼苗亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗5天后，zh11-tc幼苗明显被acb损害，而ah43610幼苗被损害的程度较轻，且取食ah43610幼苗的幼虫比取食zh11-tc的幼虫小。如表3所示，在第一轮筛选中，取食ah43610株系水稻幼苗的玉米螟中10头发育到二龄期，幼虫生长受到抑制，幼虫生长抑制率为83.33％；而对照zh11-tc抑制率为8.33％。ah43610的幼虫生长抑制率显著大于对照(p<0.01)，这些结果表明ah43610幼苗抑制了亚洲玉米螟幼虫的发育。二筛做了两次重复，ah43610幼苗第一次重复的幼虫生长抑制率为41.67％，第二次的生长抑制率为66.67％，而对照的幼虫生长抑制率均为0，因此ah43610中幼虫生长抑制率显著高于对照zh11-tc幼苗。三筛的一次重复中，ah43610显示了同样的趋势，在另一个重复中ah43610幼苗显示稍高的幼虫生长抑制率。综上所述，ah43610幼苗阻碍了亚洲玉米螟幼虫向成虫的发育。表3.ah43610幼苗在实验室条件下的亚洲玉米螟试验2)ah29691幼苗亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗5天后，zh11-tc幼苗明显被亚洲玉米螟损害，而ah29691幼苗被损害的程度较轻，且取食ah29691幼苗的幼虫比取食zh11-tc的幼虫小。表4展示了ah29691幼苗三轮试验的筛选结果，在第一轮筛选中，取食ah29691水稻幼苗的玉米螟中6头发育到二龄期，而取食zh11-tc幼苗的12头幼虫正常发育到三龄期。ah29691幼苗(50％)的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc幼苗(p<0.01)。结果表明ah29691幼苗抑制了亚洲玉米螟幼虫的发育。第二轮筛选中，两次重复中ah29691的幼虫生长抑制率分别为50％和66.67％，显著高于相应对照zh11-tc幼虫生长抑制率。第三轮试验中，ah29691幼苗在两次重复中的幼虫生长抑制率均显著高于相应的对照zh11-tc幼苗。上述结果清楚一致的表明，ah29691幼苗能够阻碍亚洲玉米螟幼虫的发育，ah29691是亚洲玉米螟抗性株系。表4.ah29691幼苗在实验室条件下的亚洲玉米螟试验实施例3.实验室条件下粘虫(mythimnaseparata)交叉验证亚洲玉米螟抗性的atl株系粘虫(oaw，mythimnaseparata)用于杀昆虫活性的交叉验证试验。oaw属于鳞翅目夜蛾科的杂食性昆虫害虫。粘虫虫卵购自中国农科院植物保护研究所，在27℃培养箱中孵化，以初孵幼虫作为试虫。atl水稻植株的培养方法和实验设计参见实施例2。5天后，取出所有存活的幼虫，并目测观察，根据表2给出相应的抗性值。幼虫生长抑制率作为抗性试验的一个参数，指抑制数除以统计总虫数的百分比，其中，抑制数是指一次重复中所有4个孔中观测到的抗性值的总和，统计总虫数是指观测到的总虫数和处于一龄期虫数的总和。采用卡方统计原始数据，p<0.01时，认为测定的株系为粘虫抗性阳性株系。筛选结果：表5展示来了ah43610和ah29691幼苗的粘虫筛选结果。在ah43610幼苗的孔中，所有观察到的22头幼虫均没有发育到三龄期，其中15头幼虫发育到二龄期，7头幼虫发育到一龄期；而取食zh11-tc的幼虫中，9头正常发育到三龄期，34头发育到二龄期，2头发育到一龄期。ah43610幼苗的幼虫生长抑制率为100％，显著高于zh11-tc对照(80.85％)。取食ah29691幼苗的粘虫幼虫中，找到了17头幼虫，其中1头发育到了一龄期，10头发育到二龄期；而取食zh11-tc幼苗的幼虫，1头发育到一龄期，20头发育到二龄期，ah29691幼苗的幼虫生长抑制率稍高于zh11-tc幼苗。上述结果表明ah43610幼苗能够抑制粘虫幼虫的生长发育，ah29691幼苗也显示了对粘虫幼虫一定程度的抗性。表5.实验室条件下ah43610和ah29691幼苗的粘虫试验实施例4.实验室条件下水稻二化螟交叉验证亚洲玉米螟抗性株系水稻二化螟(rsb，chilosuppressalis)属于鳞翅目螟蛾科，是非常重要的水稻害虫，寄生于幼苗到成熟期的植物中。虽然广泛分布在世界各地，水稻二化螟在亚洲、中东和地中海地区特别具有危害性。水稻二化螟的虫卵购自中国农科院植物保护研究所养虫室，在27℃培养箱中孵化，初孵幼虫作为试虫。atl幼苗培养于温室中，温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000～20,000lx，阴天时为6,000～10,000lx；温室相对湿度为30％～90％，温度为20～35℃。改良的irri营养液培养40天后的分蘖幼苗用于本试验中。筛选方法：40日龄的每个atl或者zh11-tc植株取两株，将主茎剪成7-8cm长的2段，插入带有琼脂的100ml三角瓶中，然后用毛笔将10头二化螟初孵幼虫接到茎顶端，盖好封口膜。放入27.5℃，rh70％的培养箱中培养。zh11-tc的主茎用作对照，本试验设置六次重复。二化螟接种7天后，调查死亡率和幼虫生长抑制率。死亡率指死亡幼虫数除以接种总虫数的百分比，幼虫生长抑制率是指死亡虫数、一龄虫数和二龄虫数的总和除以接种的总虫数的百分比。采用卡方分析原始数据，当p<0.01时，测试的株系被认为是二化螟抗性阳性株系。筛选结果：1)ah43610主茎取食ah43610主茎的30头二化螟幼虫中，14头死亡，5头幼虫发育至一龄期，6头幼虫发育至二龄期，而取食zh11-tc主茎的幼虫中，6头死亡，15头发育到二龄期，6头发育到一龄期；取食另一对照，ah43610分离的不发光种子(ah43610-n)主茎的幼虫中，2头死亡，4头发育到二龄期，5头发育到三龄期。ah43610主茎导致的幼虫死亡率为46.67％，幼虫生长抑制率为83.33％；zh11-tc对照主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率分别为15％和60％；ah43610-n对照主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率分别为6.67％和36.67％。上述结果清楚的表明ah43610能够显著抑制二化螟幼虫的生长发育。2)ah29691主茎取食ah29691主茎的二化螟幼虫中，17头死亡，2头发育到一龄期，7头发育到二龄期；而取食对照zh11-tc主茎的幼虫中，8头死亡，5头发育到二龄期。ah29691主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长发育抑制率高于zh11-tc主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率，表明ah29691幼苗能够抑制二化螟幼虫的生长。表6.实验室条件下ah43610和ah29691幼苗水稻二化螟试验ah43610和ah29691幼苗能够显著抑制亚洲玉米螟、粘虫和水稻二化螟的生长发育，表明这两个株系幼苗具有潜在的广谱的杀昆虫活性。根据上述结果，分离了能够提高ah43610和ah29691幼苗抗虫性基因。实施例5.激活标签基因的鉴定本研究使用如下标准程序鉴定抗虫性ah43610和ah29691水稻株系中t-dna插入位点侧翼基因，(1)质粒拯救法(friedrichj.behringer和junei.medford.(1992)，plantmolecularbiologyreportervol.10，2：190-198)和(2)反向pcr法(m.j.mcpherson和philipquirke.(1991)pcr：apracticalapproach，137-146)。对于复杂和多聚t-dna插入的株系，质粒拯救和反向pcr不能有效鉴定候选基因，这种情况下，其它的程序如tailpcr(liu等(1995)，plantj.8：457-463)可以鉴定t-dna插入位点附近的候选基因。成功的测序结果是其中单个dna片段含有t-dna边界序列和水稻侧翼基因组序列，一旦获得t-dna插入位点的侧翼基因组序列标签，可以通过与公开的水稻基因组序列比对，鉴定候选基因。具体的讲，最靠近camv35s增强子元件/t-dnarb的注释基因是激活的候选基因。为了证实鉴定的基因确实是邻近t-dna，并排除dna片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个t-dna中寡核苷酸和一个基因组dna特异的寡核苷酸片段对基因组dna进行诊断pcr分析。可以扩增产生pcr产物的基因组样品被认为有t-dna的插入。这个分析也可以确认同一个株系中含有不止一个t-dna插入位点的状况。例如，质粒拯救和/或反向pcr分析鉴定是否有多个不同的基因组片段。采用ctab法(murray，m.g.和w.f.thompson.(1980)nucleicacidsres.8：4321-4326)从ah43610和ah29691水稻株系叶片中提取基因组dna。t-dna插入位点侧翼序列通过分子技术获得。ah43610水稻中，串联t-dna插入3号染色体9419566-9419587bp之间(msu7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，ah43610中t-dna右侧和左侧的侧翼序列的核苷酸序列如seqidno：1或2所示。ah29691水稻中，t-dna插入9号染色体的21101049bp附近(msu7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，ah29691中t-dna右侧侧翼序列的核苷酸序列如seqidno：11所示。oscrk6基因邻近ah43610水稻株系的t-dna插入位点，osmfs5基因邻近ah29691水稻株系的t-dna插入位点，因此该两个基因被克隆，并验证其功能是否为提高抗虫性和其他农艺性状。实施例6.抗虫基因的克隆和过表达载体的构建根据基因idloc_os03g16960.1和loc_os09g36600.1的序列信息，设计引物，并克隆水稻抗虫基因。表7展示了引物序列和期望的扩增基因的长度。以超优1号水稻叶、茎和根混合的cdna库为模板克隆oscrk6cdna，以zh11水稻叶、茎和根混合的cdna库为模板克隆osmfs5cdna。pcr反应混合液和pcr程序如表8和9所示。表7.克隆抗虫基因的引物表8.pcr反应混合液表9.克隆抗虫基因的pcr循环状况pcr扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与ta克隆载体连接。通过测序确定pcr产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将基因克隆到植物双元载体dp0158(pcambia1300-dsred，seqidno:3)中。dp0482载体中克隆的核苷酸序列和oscrk6的编码序列如seqidno：4和5所示，oscrk6的氨基酸序列如seqidno：6所示；dp1191载体中克隆的核苷酸序列和osmfs5的编码序列如seqidno：12和13所示，osmfs5的氨基酸序列如seqidno：14所示。实施例7.转化获得转基因水稻过表达载体和空载体(dp0158)采用林拥军和张启发((2005)plantcellrep.23:540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。转化实验室获得的t0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得t1种子，t1和t2代种子储藏在4℃冷库中。过表达载体含有dsred和hyg基因，t1和t2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列抗虫试验。转基因水稻植株中基因表达分析：采用标准的实时rt-pcr程序诸如源于的反转录试剂盒和实时rt-pcr(sybrrpremixextaqtm,宝生物)分析转基因水稻植株中基因的表达水平。ef1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。ef1αmrna水平用于规范基因表达量。dp0428水稻植株中oscrk6基因表达水平采用下面的引物测定，如图1所示，zh11-tc水稻中基因的表达水平设置为1.00，dp0158对照水稻中基因的表达水平与zh11-tc水稻中类似，oscrk6基因在所有12个转基因株系中过量表达。dp0482-f1：5'-gccactaccgacatgacaaag-3'(seqidno：9)dp0482-r1：5'-gcatgcacatcaccatgtatg-3'(seqidno：10)dp1191水稻植株中osmfs5基因表达水平采用下面的引物测定，如图2所示，zh11-tc水稻中基因的表达水平设置为1.00，dp0158对照水稻中基因的表达水平与zh11-tc水稻中类似，osmfs5基因在所有12个转基因株系中过量表达。dp1191-f1：5'-gttcggtttggatgtcttgc-3'(seqidno：17)dp1191-r1：5'-ctctgcctcttgctctcatg-3'(seqidno：18)实施例8oscrk6转基因水稻植株在实验室条件下的亚洲玉米螟试验为了调查oscrk6转基因水稻能否重现ah43610t-dna插入突变体的抗虫性状，oscrk6转基因水稻首先用于亚洲玉米螟试验。玉米螟的饲养方法如实施例2所述。dp0482载体产生的t2代植株用于该试验，进行三次试验，每次4个重复，zh11-tc和dp0158幼苗用作对照。本试验验证12个转基因株系，每个株系取450粒种子，参照实施例2水培养10天。重现试验采用随机区组设计，每个株系的幼苗插入32-孔板的两个孔中，zh11-tc和dp0158幼苗插入同一板的四个不同孔中。玉米螟抗性试验的的一个指标为幼虫生长抑制率,指幼虫的抑制数除以幼虫统计数的百分比，其中幼虫抑制数指8个孔中抗性值的总和，幼虫统计数指所观测到的幼虫数和一龄期幼虫的总和。本试验采用随机区组设计，同一构建体的12个转基因株系在一个试验单元中进行验证，通过sasprocglimmix考虑载体、转基因株系和环境效应评价基因功能。如果转基因水稻植株的幼虫生长抑制率在载体水平和转基因株系水平显著高于对照(p<0.05)，则该基因被认为具有亚洲玉米螟抗性功能。亚洲玉米螟筛选结果：1)第一次验证试验的结果亚洲玉米螟初孵幼虫接种水稻幼苗5天后，zh11-tc和dp0158水稻幼苗明显受玉米螟损害，而oscrk6转基因幼苗受损较轻，与取食zh11-tc和dp0158对照幼苗的幼虫相比，取食oscrk6转基因株系幼苗的幼虫相对较小。12个oscrk6转基因株系放置在一个32-孔板上，同时进行四次重复。oscrk6转基因水稻幼苗共接种了576头玉米螟初孵幼虫，共培养5天后，观测到414头幼虫，其中14头处于一龄期，171头处于二龄期；zh11-tc幼苗的孔中，观测到69头幼虫，其中2头处于一龄期，23头处于二龄期；dp0158幼苗获得类似的结果，观测到的79头幼虫中，3头处于一龄期，17头处于二龄期。oscrk6转基因水稻、zh11-tc对照和dp0158对照的幼虫生长抑制率分别为46.50％、38.03％和28.05％。oscrk6转基因水稻的幼虫生长抑制率高于zh11-tc对照(p值＝0.1617)并显著高于dp0158对照(p值＝0.0032)。这些结果表明过量表达oscrk6可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。转基因株系水平进一步的分析结果展示在表10中。与zh11-tc和dp0158对照相比，10个转基因株系显示出较高的幼虫生长抑制率，6个株系的幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照幼苗。这些结果进一步表明与对照相比oscrk6能够在转基因株系水平提高水稻玉米螟抗性。表10.oscrk6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)2)第二次验证试验的结果同样的12个oscrk6转基因株系用于第二次验证验证中，dp0158幼苗用作对照。初孵幼虫接种后，共培养5天，oscrk6转基因水稻的孔中，共观测到504头幼虫，其中6头处于一龄期，223头处于二龄期；dp0158幼苗孔中，共观测到88头幼虫，其中2头处于一龄期，21头幼虫处于二龄期。oscrk6转基因水稻和dp0158的幼虫生长抑制率分别为46.08％和27.78％，oscrk6转基因水稻幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照(p值＝0.0026)，这些结果表明在水稻中过量表达oscrk6能够提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。转基因株系水平的分析结果展示在表11中，11个转基因株系的幼虫生长抑制率高于dp0158幼苗对照，且其中9个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。dp0482.38的幼虫生长抑制率为65％。本次试验的结果与第一次验证试验的结果趋势相同。这些结果进一步表明与对照相比，oscrk6在提高水稻玉米螟抗性中起作用。表11.oscrk6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)实施例9oscrk6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验oscrk6转基因水稻的粘虫试验参照实施例3的描述进行。幼虫生长抑制率作为粘虫抗性试验的一个参数，指幼虫抑制数除以幼虫统计数的百分比，其中幼虫抑制数指八个孔中所观测到的抗性值的总和，幼虫统计数指所观测到的所有幼虫和一龄期幼虫数的总和。粘虫筛选结果：用于亚洲玉米螟试验的12个转基因株系用于本试验，这12个株系放置在一个32-孔板中，同时进行四次重复。接种粘虫并共培养5天后，取食oscrk6转基因水稻的488头幼虫中，3头发育到一龄期，113头发育到二龄期，oscrk6转基因水稻的粘虫幼虫生长抑制率为24.24％；取食zh11-tc的90头幼虫中，1头发育到一龄期，20头发育到二龄期，zh11-tc幼苗的幼虫生长抑制率为24.18％；取食dp0158幼苗的90头幼虫中，1头发育到一龄期，15头发育到二龄期，dp0158幼苗的幼虫生长抑制率为18.68％。oscrk6转基因水稻的幼虫生长抑制率高于zh11-tc和dp0158对照，但差别没有达到显著水平。表12.oscrk6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(载体水平，第一次试验)第二次粘虫试验的结果如表13所示，粘虫接种并共培养5天后，oscrk6转基因水稻孔中的449头幼虫中，31头发育到一龄期，88头幼虫发育到二龄期，粘虫幼虫生长抑制率为31.25％；而zh11-tc幼苗孔中，检测到88头幼虫，其中6头发育到一龄期，15头幼虫发育到二龄期，zh11-tc幼苗的幼虫生长抑制率为28.72％；dp0158幼苗的孔中，共观测到84头幼虫，其中4头发育到一龄期，18头发育到二龄期，dp0158幼苗的幼虫生长抑制率为29.55％。结果表明oscrk6转基因水稻的粘虫幼虫生长抑制率高于zh11-tc和dp0158对照。表13.oscrk6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(载体水平，第二次试验)实施例10oscrk6转基因水稻在温室条件下的水稻二化螟试验水稻二化螟试验用于调查oscrk6基因是否有水稻二化螟抗性功能。二化螟虫卵购自中国农科院植物保护研究所养虫室，卵在27℃培养箱中孵化，以初孵幼虫作为试虫。5个在亚洲玉米螟试验中表现较好抗性的oscrk6转基因株系用于二化螟试验，在温室中培养。温室中提供比例为1：1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光源放置在苗床上部约1.5米处，光照时间为16h/8h白天/黑夜；晴天时，苗床上部30cm处光强度为10,000～20,000lx，阴天时的光照强度为6,000～10,000lx，温室的相对湿度为30％～90％，温度为20～35℃。实验材料在温室使用irri营养液培养40天，分蘖的材料待用。筛选方法：每个转基因株系的96株材料用于测试，培养40天时，每棵水稻植株的新叶上接种一头二化螟初孵幼虫，用纱网笼罩上，避免蛾进入温室中。30～35℃培养28天后,统计水稻苗的枯心率。采用一维方差分析(anova)进行统计学分析，p≤0.05时，转基因水稻记为二化螟抗性阳性材料。枯心的水稻植株被认为是受水稻二化螟破坏的植株。枯心率是指受破坏枯心的植株数除以总植株数的百分比。筛选结果：5个转基因株系用于该试验，经过水稻二化螟28天的取食后，对照zh11-tc有63株水稻枯心。如表14所示，5个转基因株系水稻的枯心率均低于对照zh11-tc的枯心率，且两个株系的枯心率显著低于zh11-tc。由此推测oscrk6d转基因水稻有一定的二化螟抗虫功能。表14.oscrk6转基因水稻在温室条件下的水稻二化螟试验(转基因株系水平)综上所述，oscrk6转基因水稻能够抑制亚洲玉米螟和粘虫幼虫的生长发育，已获得了亚洲玉米螟和粘虫抗性；oscrk6转基因水稻也能够提高水稻二化螟的抗性。这些结果表明oscrk6转基因水稻能够显著抑制亚洲玉米螟、粘虫和水稻二化螟的生长发育，进一步表明oscrk6具有潜在的广谱杀昆虫活性。实施例11osmfs5转基因水稻植株在实验室条件下的亚洲玉米螟试验为了调查osmfs5转基因水稻能否重现ah29691t-dna插入株系的抗虫性状，osmfs5转基因水稻用于亚洲玉米螟的抗虫试验中，试验方法如实施例8中描述。亚洲玉米螟验证结果：1)第一次验证试验的结果将亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗上5天后，可以发现zh11-tc和dp0158幼苗被亚洲玉米螟幼虫明显的破坏，而osmfs5转基因水稻幼苗的破坏程度较轻，且取食osmfs5转基因水稻幼苗的acb与取食zh11-tc和dp0158对照幼苗的acb相比较小。将12个osmfs5转基因株系放置在一个32-孔板中，同时进行六次重复。osmfs5转基因水稻接种玉米螟初孵幼虫培养5天后，观测到551头幼虫，其中一龄幼虫17头，二龄幼虫252头，osmfs5转基因水稻的玉米螟生长抑制率为50.35％；zh11-tc幼苗中，检测到117头幼虫，其中3头幼虫处于一龄期，41头幼虫处于二龄期；dp0158对照水稻幼苗中，检测到98头幼虫，其中4头处于一龄期，44幼虫处于二龄期，zh11-tc幼苗和dp0158幼苗的幼虫生长抑制率分别为为39.17％和50.98％。osmfs5转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照(p值＝0.0080)。上述结果表明，过表达osmfs5增强了转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。转基因株系水平的分析结果展示在表15中，其中两个转基因株系的幼虫生长抑制率大于70％，显著高于zh11-tc和dp0158幼苗的幼虫生长抑制率，4个株系显示出比zh11-tc显著高且比dp0158稍高的幼虫生长抑制率。这些结果一致表明osmfs5转基因水稻显示了对玉米螟生长的抑制作用，osmfs5可在载体水平和株系水平增强转基因水稻幼苗的玉米螟抗性。表15.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)2)第二次验证试验结果同样的12个osmfs5转基因株系放置在一个32-孔板上，同时进行六次重复。osmfs5转基因水稻的孔中共观测到691头幼虫，其中一龄幼虫1头，二龄幼虫308头，osmfs5转基因水稻的玉米螟生长抑制率为44.80％；插入zh11-tc幼苗的孔中，检测到127头幼虫，其中43头幼虫处于二龄期，zh11-tc幼苗的幼虫生长抑制率为33.86％。osmfs5转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照(p值＝0.0147)。这些结果表明过表达osmfs5在载体水平上增强了转基因水稻的玉米螟抗虫性。转基因株系水平的分析结果展示在表16中，10个转基因株系的幼虫生长抑制率高于zh11-tc对照；3个株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照。其中两个株系(dp1191.03和dp1191.06)在两次试验中展示出最高的幼虫生长抑制率。第三次实验结果显示相同的趋势。上述结果表明osmfs5转基因水稻抑制玉米螟的acb生长，且osmfs5可在载体水平和株系水平增强转基因水稻幼苗的玉米螟抗性。表16.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)实施例12osmfs5转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验osmfs5转基因水稻的粘虫试验按照实施例9的描述进行操作，试验结果如下。用于亚洲玉米螟试验的12个osmfs5转基因水稻株系用于粘虫试验。12个转基因株系放置在一个32-孔板上，同时进行四次重复。粘虫接种5天后，osmfs5转基因水稻的孔中，检测到452头幼虫，其中一龄幼虫2头，二龄幼虫169头；而取食zh11-tc的85头幼虫中，22头幼虫处于二龄期；取食dp0158对照水稻的83头幼虫中，31幼虫处于二龄期。osmfs5转基因水稻、zh11-tc幼苗和dp0158对照幼苗的幼虫生长抑制率分别为38.11％、25.88％和37.35％。osmfs5转基因水稻的粘虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照(p值＝0.0452)。表17为转基因株系分析结果。7个株系的幼虫生长抑制高于zh11-tc和dp0158两个对照，3个株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照。上述结果表明与zh11-tc对照相比，osmfs5转基因水稻提高了幼苗期粘虫抗性。表17.osmfs5转基因水稻在实验室条件下的粘虫试验(转基因株系水平，第一次试验)osmfs5转基因水稻再次进行粘虫试验的验证，在第二次试验中，粘虫初孵幼虫接种到水稻苗，共培养5天后，osmfs5转基因水稻的孔中，共观测到336头幼虫，其中一龄幼虫11头，二龄幼虫182头，osmfs5转基因水稻的粘虫幼虫生长抑制率为58.79％；而zh11-tc幼苗的孔中，检测到54头幼虫，其中1头幼虫处于一龄期，29头幼虫处于二龄期；dp0158转基因水稻中，检测到62头幼虫，其中23幼虫处于二龄期。osmfs5转基因水稻的幼虫生长抑制率稍高于zh11-tc对照，显著高于dp0158对照(p值＝0.0032)。这些结果表明osmfs5转基因水稻在载体水平显示粘虫幼虫抗性。转基因株系水平的分析显示4个株系的幼虫生长抑制率大于60％，显著高于dp0158对照，第三次试验显示类似的趋势。上述这些结果进一步确认过量表达osmfs5提高了转基因水稻的粘虫抗性，osmfs5可以增加粘虫抗性。表18.osmfs5转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第二次试验)实施例13osmfs5转基因水稻植株在温室条件下的水稻二化螟试验osmfs5转基因水稻的水稻二化螟试验按照实施例10的描述进行操作，试验结果如下。5个在亚洲玉米螟和粘虫试验中表现较好抗性的株系用于水稻二化螟试验。水稻二化螟幼虫接种28天后，98株dp0158水稻植株中，有66株已经枯心，而96株dp1191.02的转基因水稻中，只有34株表现出枯心。所有5个osmfs5转基因株系的枯心率均低于dp0158对照的枯心率(表19)。继续培养12天后，即接种幼虫40天后，计算了水稻植株的死亡率。如表20所示，5个转基因株系表现出比dp0158低的水稻植株死亡率，且3个水稻株系的水稻植株死亡率显著低于对照植株。上述结果一致表明osmfs5转基因水稻已获得提高的水稻二化螟抗性。表19.osmfs5转基因水稻在温室中的水稻二化螟试验(枯心率)表20.osmfs5转基因水稻在温室中的水稻二化螟试验(水稻死亡率)osmfs5转基因水稻植株抑制亚洲玉米螟和粘虫幼虫的生长，且osmfs5提高了转基因水稻幼苗的亚洲玉米螟和粘虫抗性；osmfs5转基因水稻植株也显示了对水稻二化螟的抗性提高。上述结果表明osmfs5转基因水稻对亚洲玉米螟、粘虫和水稻二化螟昆虫的生长发育显示显著的抑制作用，表明osmfs5具有潜在的广谱杀昆虫活性。sequencelisting<110>未名生物农业集团有限公司先锋海外公司<120>抗虫性能增强的植物和涉及昆虫抗性基因的构建体和方法<130>rts22593a<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>649<212>dna<213>水稻<400>1gccttcggaggccatgacactcgcctgctgaggtttgtcacgtacggcctgaagacgacg60cttgtgttgtgcagtgcagtgttcggtctttcctggagcccacgagctcccatttgtgcg120tgcgggcgcagccgccagagtcggcagaccggggaggtggcgcgcatgcacgcggtgacc180actcctcctgcctccacgtacgtttgcctctggctttccctgctcattgctcatcgtcat240cgtcatcggtgaggatgtctccggccggttcgggccgagcaagcagcaggttgcacggcc300cacacatgtaaggcctgtcacgtatgggctcggagaacggtttctttagcaggccgaata360tccaggccctttttcactttttgccaaacactcaactgggccgcagcatcctcaactgca420gctgcaagggtgaacatctgacctagctagatagatgctgccatagtgccatggcatatt480ggcatggagtcgacgggatgaggtcaagatagtggacgtcgttggctcgttgcaagttgc540aactggccaatcgtgctatagaaatcggtgctgattgggcggtatatccggttggatcgc600tcctaactccgaaattttgttaggtatgtcacgtcgtttccgcaactag649<210>2<211>683<212>dna<213>水稻<400>2ctacaccgtcgtctacgtcaaggacgtcgccaagtcggccgccttctactccgccgcgtt60cggctacaccgtccgccgcctcgaccaatcccacaagtaaaccatcctcggttaatattt120tttttccccgtcttaaatttttaactggctgcttgaaagtacttcctgatgcgtgtgacg180tgtaatgaattataaggtgggcggagctggagagcgggacgacgacgatcgcgttcacgc240cgctgcaccagagggagacggacgcgctgacgggcgcggtgcagctgccggactcggccg300gcgagcgggggcccgtggagatctgcttcgactacgcggacgtcgacgcggcgtaccggc360gggccgtggacagcggcgccgtgccggtgagcccgccggagcagaagagctggggccaga420aggtcgggtacgtcagggacatcgacgggatcatcgtgcgcatgggcagccacgtccgcg480cgtagcggccatgcgcctgctcggttgggggattttagccgtgtatgttcaataatgtga540actgttctccactgatctgttgatatatggaataaaactgtgatctcgttggttgtggtc600tgtactccaaagtccaaacgagaaaaaatggccatgtttgatgtatgatgtgttcaatca660tgaatcacatgggtaaggatagg683<210>3<211>11934<212>dna<213>合成序列<220><223>载体dp0158的核苷酸序列<400>3gaattctctagtcccgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagt60ttgcgcgctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatca120taaaaacccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgt180aattcaacagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaaga240aacgcggccgcttcagttgtggcccagcttggaggtcgactcgcgaggatctctgcagag300agatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaact360tccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtc420agtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttc480cacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttg540aacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctac600tgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatat660taccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatatt720cttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttcacatcaatccacttgctttgaag780acgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgg840gaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatt900tgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaat960ggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggt1020cttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgt1080tgccaagctgctctaagctttggcggccgcattcgcaaaacacacctagactagatttgt1140tttgctaacccaattgatattaattatatatgattaatatttatatgtatatggatttgg1200ttaatgaaatgcatctggttcatcaaagaattataaagacacgtgacattcatttaggat1260aagaaatatggatgatctctttctcttttattcagataactagtaattacacataacaca1320caactttgatgcccacattatagtgattagcatgtcactatgtgtgcatccttttatttc1380atacattaattaagttggccaatccagaagatggacaagtctaggttaaccatgtggtac1440ctacgcgttcgaatatccatgggccgctacaggaacaggtggtggcggccctcggtgcgc1500tcgtactgctccacgatggtgtagtcctcgttgtgggaggtgatgtccagcttggcgtcc1560acgtagtagtagccgggcagctgcacgggcttcttggccatgtagatggacttgaactcc1620accaggtagtggccgccgtccttcagcttcagggccttgtgggtctcgcccttcagcacg1680ccgtcgcgggggtacaggcgctcggtggaggcctcccagcccatggtcttcttctgcatc1740acggggccgtcggaggggaagttcacgccgatgaacttcaccttgtagatgaagcagccg1800tcctgcagggaggagtcctgggtcacggtcgccacgccgccgtcctcgaagttcatcacg1860cgctcccacttgaagccctcggggaaggacagcttcttgtagtcggggatgtcggcgggg1920tgcttcacgtacaccttggagccgtactggaactggggggacaggatgtcccaggcgaag1980ggcagggggccgcccttcgtcaccttcagcttcacggtgttgtggccctcgtaggggcgg2040ccctcgccctcgccctcgatctcgaactcgtggccgttcacggtgccctccatgcgcacc2100ttgaagcgcatgaactcggtgatgacgttctcggaggaggccatggtggcgaggatctac2160tcggctacactcacacgctcgctctcgcagttgcaggtgtaagtttctagctagggcact2220cacggggtacgtatttgtagccagccacgcacggtctgagctcgccatgtgccgccatgc2280atgcgggggcacgtcgccagcgtacgcggccatcgtcgctgacgaaggtagcgcattcaa2340gtccggtcggtagaggtcagctgggtcgttcgccgatggtagttgccgcccggactcagt2400gggcggtaggcgaaggctagcaagcagacgactccattcatgcgcatcatccaaaggtga2460tgcaaagccttccaaacgcgattgtctcatgatgtttccgtctcttgttacgaggagtac2520aattttttcttatacacgaacgttactttatgtcacatttccatgccatgaacaccttgg2580cttcaaataagtgagtgttttttttcacattctgtggcataaacagaatttctagagtgg2640catttgtgatacattgtgaaagctaagagtggtaaaagtaaaataaaattgttttgcttt2700tgccgcggaatggaaattatttgtcaaaacctaagagtggcaaaactgaaatgtcaaaac2760ctagagtgacataaacaaaatttacccatcactaaatgagcacaaaatatttcaccacaa2820tggaggtatgtgaggtccgatgtactactagagctcatcggaaaagc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