一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物及其应用的制作方法

本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。

背景技术：

登革病毒在分类上属黄病毒科、黄病毒属的病毒，是流行范围最广、发病人数最多、危害性较大的一种虫媒传播的病毒，其主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。登革病毒感染是一种蚊媒传播疾病，多在热带与亚热带地区流行暴发，根据临床表现严重程度的不同，可分为登革热(DF)、登革出血热(DHF)、登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)三种临床类型，登革热主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白血球减少，此类疾病传播迅速，可引起较大规模的流行，病死率较低，一般将这种病型称为古典型登革热。而登革出血热是以高热、出血、休克、和高病死率为特征，是较为严重的一种临床类型，伴有休克综合征倾向的称为登革出血热、登革休克综合征。据世界卫生组织统计，全球每年有50万人感染登革热，死亡约2.5万人，大约有25-30亿人口处于登革病毒的威胁之下。2014年广州省发生大规模的暴发流行，据报道病例总数累计报告登革热病例45171例，累计报告死亡病例6例。2015年在云南的西双版纳，广东潮州，台湾地区也发生了登革热流行，最为严重的要数台湾，截止到2015年11月，累积病例数就超过了3万，累计报告死亡病例141例。

目前，国内外对登革病毒的诊断方法，主要还是依靠病毒培养、血清学试验、常规的PCR检测及实时荧光定量PCR，其中，血清学试验、组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而常规PCR也存在容易污染、耗时长的不足，实时荧光PCR技术因为其仪器设备昂贵，不利于一般检测机构的检测及大样本量检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，该引物用于登革病毒的检测具有特异性和敏感性好的优点。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，其特征在于，该不对称PCR扩增引物为一对特异性扩增登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的引物，其序列为：

非限制性引物序列为：5’-GGTTAGAGGAGACCCCTCCC-3’(SEQ NO.1)，

限制性引物序列为：5’-GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT-3’(SEQ NO.2)；

本发明还提供一种使用上述不对称PCR扩增引物检测登革病毒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取寨卡病毒，先提取其核酸，再以所到的核酸为模板进行RT-PCR扩增，获得逆转录产物；然后，

(2)以逆转录产物为模板，采用上述不对称PCR扩增引物扩增出登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的单链DNA(ssDNA)；

(3)根据所述的单链DNA的序列设计出胶体金检测试纸条，该胶体金检测试纸条包括PVC支撑片、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫五部分，其中，

所述的结合垫上包被有胶体金标记的如下检测探针：

5’-AGACCAGAGATCCTGCTGTCTCAAAAAAAAAA–巯基-3’(SEQ NO.3)；

所述的聚酯纤维素膜上设有检测线和控制线，其中，

所述的检测线的位置喷涂有如下捕获探针：

5’–生物素-AAACAGCATATTGACGCTGGGA-3’(SEQ NO.4)；

所述的控制线的位置喷涂有如下捕获探针：

5’-TTTTTGAGACAGCAGGATCTCTGGTCT–生物素-3’(SEQ NO.5)；

(4)将步骤(2)所得到的单链DNA滴于步骤(3)所述的样品垫上，补加适量4×SSC杂交缓冲液，使刚好完全浸湿结合垫；约5min后采用4×SSC杂交缓冲液清洗所述的胶体金检测试纸条以降低背景；10min内观察检测线和控制线是否显色，按以下方法进行定性判断：若检测线与控制线同时显色，结果为阳性；若检测线不显色，而控制线显色，则结果为阴性；若控制线不显色说明试纸条无效。

登革病毒NS5蛋白10589-10754bp编码区的165bp的区域，具有4种血清型登革病毒共有的保守序列而其他病毒不具有的特异序列，在这个区域可以设计引物和探针针对登革病毒进行特异性检测。更进一步地，本发明将胶体金技术与杂交介导的探针捕获检测技术结合在一起形成胶体金检测试纸条可以在十分钟内对扩增的产物进行可视化的检测，可准确、特异、灵敏、稳定检测登革病毒NS5基因片段所扩增的单链DNA。

附图说明

图1为本发明所述单链核酸片段扩增原理图。

图2为本发明所述胶体金检测试纸条的特异性效果图。

图3为本发明所述胶体金检测试纸条的灵敏度效果图。

图4和5是本发明所述胶体金检测试纸条的结构示意图，其中图4为主视图，图5为俯视图。其中：1-PVC支撑片，2-样品垫，3-结合垫，铺有胶体金和检测探针，4-硝酸纤维素膜，5-吸水垫，6-capture probe T和链霉亲和素，喷涂于硝酸纤维素膜,形成检测线T，7-capture probe C和链霉亲和素,喷涂于硝酸纤维素膜，形成质控线C。

具体实施方式

实施例1(引物的设计与合成)

分别从GenBank中获取四种不同血清型的登革热病毒NS5基因全序列进行分析和实验研究，最后选定登革病毒NS5蛋白10589-10754bp编码区的165bp的基因片为目标区域，采用primer 5软件设计出不对称PCR扩增引物，其中非限制性引物如SEQ NO.1所示，限制性引物如SEQ NO.2所示。然后，委托北京六合华大生物科技有限公司公司合成。

实施例2(胶体金检测试纸条的制备)

根据采用实施例1所述引物不对称扩增出单链DNA的序列设计出胶体金检测试纸条，该试纸条的结构如图4和5所示。参见图4和5，所述的胶体金检测试纸条(简称试纸条)包括条状的PVC支撑片7，该支撑片7的上表面自一头至另一头依次设有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4。其中，所述的硝酸纤维素膜3上分布检测线5和控制线6，其中检测线5是在硝酸纤维素膜3上喷涂如SEQ NO.4所示的捕获探针形成，控制线6是在硝酸纤维素膜3上喷涂如SEQ NO.5所示的捕获探针形成；所述的结合垫2上包被有胶体金标记的如SEQ NO.3所示的检测探针。

上述试纸条的具体制备方法如下：

1、胶体金的制备

(1)制备王水：HCl：HNO3＝3：1于烧杯中。(王水必须现用现配，不能储存在密闭容器中，以免引起爆炸。)此步操作应在通风橱中进行。

(2)取200ml双颈圆底烧瓶，磁力搅拌棒，塞子(橡皮塞)和冷凝管放入王水中至少浸泡15min，然后依次用大量的去离子水和双蒸水冲洗这些玻璃器皿，100℃以上干燥。

(3)配制100ml 1mM HAuCl4：在双颈瓶中加入98ml双蒸水和2ml 50mM HAuCl4，或称取0.03938g HAuCl4溶于100ml双蒸水中。

(4)在双颈瓶的两个口上分别接上冷凝管和塞子，加入磁力搅拌器并加热，此时应确保冷凝管中已通入流动水。

(5)当观察到反应液充分沸腾，冷凝管中的冷凝水开始回流时(1drop/s)，取出塞子，快速加入10ml 38.8mM柠檬酸钠，并重新塞上塞子。这是溶液的颜色会发生快速的变化，其顺序应为：淡黄色→无色→黑色→紫色→深红色。继续加热回流15～20min。

(6)停止加热，但持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温(23～25℃)，此过程大概需要2～4h。若冷凝过夜，冷凝管中的冷暖水流应关掉。

(7)将冷凝好的溶液用孔径0.45um的醋酸滤膜过滤。

(8)测定最大吸收峰：以双蒸水作为空白，将500ul的纳米金溶液稀释至1ml，测定其在520nm的吸光度。标准的13nm金粒子溶液应在519nm左右有最大等离子吸收峰并且峰宽50nm，最大吸光度约为2.4。

(9)用电子显微镜(TEM)进一步观察，粒子应为圆形。

(10)制备好的纳米金粒子溶液可室温下储存在干净的棕色玻璃瓶或塑料瓶中，切勿冷藏，以防凝聚。

2、巯基的活化与金标探针的标记

(1)三β—氯乙基磷酸酯(TCEP)活化巯基：将合成的探针DNA离心5min(7500r)，用超纯水稀释为浓度100μM，每10μLDNA探针加入0.33μL醋酸buffer(浓度为500μM)，0.5μL TCEP(浓度为10μM)，震荡并离心甩下管壁上的液体，避光活化1h。

(2)纳米金探针的标记：活化后的巯基每10μL加入到1mL的纳米金当中，600r，25℃震荡16h，加入10μL Tris醋酸缓冲液(500mM)，100μL Nacl(1M)，600r，25℃震荡24h。标记后12500r离心15min，去上清用重悬液(20mM Na₃PO₄，5％BSA，0.25％Tween，10％蔗糖)重悬。

(3)纳米金垫的制备：取适量标记好的纳米金滴于玻璃纤维素膜上，晾干，温室干燥保存，用作结合垫。

3、试纸条的制备

(1)样品垫的处理：样品垫是由玻璃纤维素膜构成，预先用适量的4×SSC饱和处理，用以提供适宜的杂交条件，室温自然晾干备用。

(2)结合垫的处理：结合垫在纳米金修饰完成后进行铺金处理，待检验样品在结合垫上与检测探针孵育结合。

(3)硝酸纤维素膜处理：取50μL浓度为100μM的生物素化修饰捕获探针(capture probe T和capture probe C)与150μL链霉亲和素(1mg/mL)室温孵育1h，用ZX两维化膜喷金仪(HM3020)划在硝酸纤维素膜的不同位置，分别作为检测线和控制线，其间距约为4mm。室温自然晾干备用。

(4)吸水垫的处理：用滚动式裁纸刀将吸水垫裁剪成适宜大小，用以提供毛细作用力使待检样品流动。

(5)试纸条的组装：将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，它们按顺序粘在PVC板上，相邻各部分之间重叠2mm，用滚动式裁剪刀切割成4mm宽的细条，室温干燥保存备用。

实施例3(登革病毒的检测方法)

1、BHK细胞的培养与登革病毒的扩增

1.1登革病毒株及临床血清样本

4种血清型登革病毒株(DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)，由广东省疾病预防控制中心提供，寨卡病毒株，由武汉大学病毒研究所提供；临床样本有登革病毒血清Ⅰ型160例，登革病毒血清Ⅱ型8例，皆由广州中医药大学第一附属医院提供。

1.2细胞培养

(1)培养基的配制：DMEM培养基加入10％无支原体胎牛血清并加入100U/ml链霉素。

(2)细胞传代：细胞长满瓶壁90％-95％时，将上清倒掉，用PBS液洗2-3遍细胞，加1ml 0.25％胰酶37℃温箱消化3-5分钟后，加入3ml培养基将细胞吹下来，转移至15ml离心管，1000转离心5分钟，倒掉上清，加入3ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞吹打均匀后按1：2或1：3的比例接种于新的培养瓶中，加入5ml新鲜培养基，放入培养箱培养。

1.3细胞冻存及复苏

(1)细胞冻存液的配制：90％无支原体新生牛血清+10％DMSO。

(2)细胞冻存方法：细胞长满瓶壁90％后，细胞消化离心，弃上清，加入配制好的冻存培养液(含10％DMSO)，重悬细胞，或者用细胞计数板计数细胞浓度，将细胞浓度调至10⁶个/ml，将细胞转移至冻存管，每管1ml，用棉花包住冻存管放入-80℃冰箱，2天后将冻存管放入液氮冻存。

(3)细胞复苏：在15ml离心管中加入5-8ml新鲜培养基，再从液氮取出细胞后立刻放入37-40℃水浴，在1min内融化，将细胞转移至装有培养基的离心管，1000r离心5分钟，倒掉上清，加入2ml新鲜培养基重悬，转移到新的培养瓶中，加入4ml新鲜培养基放入培养箱培养，1天后细胞贴壁，换液。

1.4病毒扩增

(1)病毒维持液的配制：DMEM培养基加入2％无支原体新生牛血清。

(2)病毒接种：待细胞长满T25瓶后，吸去培养液加PBS漂洗，加入1mL病毒原液，37℃孵育1h将病毒液吸出弃去，加入4mL病毒维持液，放入37℃培养箱中培养。

(3)收获病毒：待细胞病变率达到90％时，收集培养液上清，1500r离心15min，将上清分装。

2、登革病毒RNA的提取

按照EasyPureViralDNA/RNAKit(Lot#K200633；北京全式金生物科技有限公司)提取登革病毒核酸。

2.1登革病毒RNA的逆转录

按照Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthensis Kit进行RT-PCR扩增，获得逆转录产物。

2.1不对称PCR扩增目的片段

不对称PCR扩增体系及条件如下，5μL 5×Reaction Buffer，1μL 10mM dNTP Mix，非限制性引物(SEQ NO.1)和限制性引物(SEQ NO.2)摩尔数比为50:1，5μL Mgcl2，0.25μL Taq酶，1μL逆转录产物，Total volume 50μL。以95℃3min，(95℃30s，50℃30s，72℃60s，循环30次，72℃5min，进行反应(反应原理如图1)。

3、试纸条敏感性、特异性检测

3.1登革病毒检测

参见图4和图5，将扩增后的单链产物(ssDNA)滴于试纸条样品垫2上，补加适量4×SSC杂交缓冲液，使刚好完全浸湿结合垫2；约5min后采用4×SSC杂交缓冲液清洗所述的胶体金检测试纸条以降低背景；10min内观察检测线5和控制线6是否显色，按以下方法进行定性判断：若检测线5与控制线6同时显色，结果为阳性；若检测线5不显色，而控制线6显色，则结果为阴性；若控制线6不显色说明试纸条无效。

3.2敏感性与特异性检测

将提取到的登革病毒核酸倍数稀释并用微量核酸浓度测定仪测定核酸浓度后进行检测考察试纸条的敏感性(图2)。对于与登革病毒临床症状相似的寨卡病毒等进行扩增检测考察试纸条的特异性(图3)。结果显示，核酸浓度稀释至10^-4(100ng/μL)时，条带亦能显色。而针对于对于与登革病毒临床症状相似的寨卡病毒病毒核酸，条带不显色。

4、登革病毒临床样本的检测

针对广州中医药大学第一附属医院提供临床样本168例，其参考Yong YK等人建立的RT-PCR方法和实时荧光PCR方法，得出登革病毒血清Ⅰ型160例，登革病毒血清Ⅱ型8例。本实施例，针对该临床样本16例(登革病毒血清Ⅰ型8例，登革病毒血清Ⅱ型8例)，提取RNA，制备目的基因单链，用已制备好的试纸条进行检测，考察试纸条在登革热早期检测中的适用性。结果显示，168例血清临床样本，皆呈阳性，与医院检测结果一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州中医药大学

<120> 一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物及其应用

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