本发明涉及一种制备麦芽糖浆的方法，属于淀粉糖转化技术领域。
背景技术：
麦芽糖是由两个葡萄糖单元经α-1，4糖苷键连接而成的还原性二糖。其具有诸多优良特性：如甜度柔和(甜度只有蔗糖的30％-40％)、入口不留后味、熬糖温度高、热稳定性好、抗结晶性好，且具有多种生理功能，可广泛应用于食品和医药工业。在食品工业中，麦芽糖浆用于制作糕点，可使糕点更加柔润、膨松可口，且色泽鲜亮；用于制作牛轧糖、沙琪玛等熬制糖浆的时候，麦芽糖的加入可以防止糖浆反砂，使成品更清澈、质地更佳；麦芽糖还可用于制造麦芽糖醇，是糖尿病、高血压患者的理想甜味剂。在医药工业中，麦芽糖在血液中代谢不需要胰岛素控制，可避免血糖升高，可用于制造麦芽糖静脉注射液。
目前，麦芽糖的制备方法通常采用以下技术路线：
(1)调浆：将淀粉调成浓度为10-25％的淀粉乳，搅拌均匀后，调节ph至5.2-6.2，加入0.2-0.5％的氯化钙，充分搅拌；(2)液化：向调好的淀粉乳中加入高温α-淀粉酶，100℃分批液化或者连续喷射液化，控制液化液de值小于4，液化结束后加酸液调ph至4.0-4.5，并升温灭酶；(3)糖化：将液化液冷却至50-62℃，加碱液调节ph至5.0-5.5，加入β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶(又称麦芽三糖水解酶)，利用三种酶协同作用进行糖化，反应24-60小时；(4)过滤：糖化结束后，升高糖化液温度灭酶，加入活性炭进行脱色，然后再过滤、脱盐、浓缩得到麦芽糖浆。
然而，上述制备方法仍然存在以下问题：
首先，目前大多数方法采用的高温α-淀粉酶的最适温度一般为95-100℃，而β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶一般为中温酶，最适温度为50-60℃。由于高温α-淀粉酶和普鲁兰酶最适温度相差较大，因此淀粉液化和脱支需要分开进行；淀粉液化程度需控制在较低(de值一般在4左右)水平才能有利于提高麦芽糖收率；为了降低体系粘度，底物浓度一般低于20％，糖化结束时，糖液中麦芽糖浓度低，后续需要提高蒸发倍数，增加了生产成本。
其次，由于采用的β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶都是中温酶，糖化过程中为了有利于三种酶的协同作用，糖化反应的条件一般控制在50-62℃，反应24-60小时。该条件下容易污染杂菌(如乳酸菌等)，杂菌是生长会消耗糖分，产生杂酸，进而导致反应体系ph下降及酶快速失活，因此反应后期需补加酶液；此外，杂酸的生成还会导致麦芽糖收率下降，纯度降低，后续提取的难度加大，生产成本增加。
第三，反应过程中需要多次添加酸碱、调节反应体系的ph值。首先调节体系初始ph至5.2-6.2，液化结束加酸液调ph至4.0-4.5后，再升温灭活高温α-淀粉酶；进入糖化工序后，还需要加碱液调节ph至5.0-5.5。该工艺存在多次添加酸碱，一方面导致工艺操作复杂，另外一方面酸碱的加入，会给反应体系带入较多的盐离子，后续需要脱盐，增加了纯化工序的负担。
第四，反应过程需要先升温至100℃液化，然后降温至50-62℃，再升温灭酶，最后降温脱色、过滤。整个过程升温降温幅度较大，需要消耗较多的冷凝水和蒸汽，不仅造成能源的浪费，而且增加了生产成本。
申请号为201610458938.7，公开(公告)号为cn106119316a，名称《一种提高高浓度淀粉糖化生产麦芽糖浆中麦芽糖得率的方法》的中国发明专利申请，通过两阶段温度控制以及复合酶处理，可以在高浓度淀粉底物条件下，制备麦芽糖浆，有利于减少后期的蒸发能耗。然而，该技术方案的主要目的是提高淀粉底物浓度，仍然存在需要多次添加酸碱、降温升温幅度大、存在染菌几率大的问题，无法解决上述现有的技术问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：克服现有工艺中存在的问题，提供一种麦芽糖浆制备工艺，液化与脱支同步进行，反应温度高、淀粉底物浓度高、液化后无需灭酶，仅需调节一次初始ph，工艺简单，大幅提高麦芽糖浆制备的整体效率。
本发明以30－40％的淀粉乳为底物，采用高温淀粉普鲁兰酶(ec:3.2.1.41)进行同步液化与脱支反应，然后分步或同时加入耐热β-淀粉酶(ec:3.2.1.2.)和耐热麦芽糖淀粉酶(ec3.2.1.133)进行糖化，经过脱色、浓缩，即可获得麦芽糖浆。
具体的，本发明技术方案可包括以下步骤：
(1)将淀粉与水充分搅拌、混合，制备质量浓度(以干基计)为30－40％的淀粉乳；加入0.1－0.3％的氯化钙，再将淀粉乳的ph值调节至5.3－5.6；然后以3－6u/g淀粉的比例向淀粉乳中加入高温淀粉普鲁兰酶；混匀后，升温至95－100℃，进行同步液化和脱支，控制de值在8-10范围内；淀粉普鲁兰酶具有双重活性，即普鲁兰多糖水解酶活性和α-淀粉酶活性；为方便计算加酶量，此处所述高温淀粉普鲁兰酶酶活力为α-淀粉酶活力；
(2)将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70－75℃，并向其中加入30－60u/g耐热β－淀粉酶，充分反应18－24小时；
(3)将步骤(2)所得糖化液体系降温至65－70℃，并向其中加入20－40u/g耐热麦芽糖淀粉酶，继续搅拌反应18－22小时后，糖化后料液的麦芽糖含量达到86－92％；
(4)用无水酒精检验步骤(3)糖化后料液无糊精存在时，将反应液加热至95－100℃，保温20分钟－30分钟；
(5)将步骤(4)料液冷却至70－80℃，加入占料液固形物重量0.2－1.0％的活性炭，充分搅拌均匀后，过滤、浓缩后即得到麦芽糖浆。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(3)合并进行，即将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70－75℃，并向其中加入30－60u/g耐热β－淀粉酶、20－40u/g耐热麦芽糖淀粉酶充分反应18－24小时；糖化后料液的麦芽糖含量达到86－92％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述高温淀粉普鲁兰酶具有液化活性(类似于高温α－淀粉酶水解α－1,4－糖苷键的活性)和脱支活性(类似于普鲁兰酶水解α－1,6－糖苷键的活性)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)～(3)中所述高温淀粉普鲁兰酶、耐热β-淀粉酶、耐热麦芽糖淀粉酶均来源于微生物。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)采用双功能的高温淀粉普鲁兰酶对淀粉进行同步液化和脱支反应，淀粉液化de值可以控制的较高，淀粉底物浓度高，可以30－40％的淀粉乳为底物，而现有制备方法针对10－20％的淀粉乳，本发明有利于提高最终糖化液中麦芽糖浓度，减少后续浓缩蒸发功耗，降低生产成本。
(2)由于糖化过程中采用的耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶具有很好的热稳定性，反应可以在较高的温度下进行，高于常见的淀粉糖生产过程中杂菌的生长温度，反应体系不易污染杂菌，有利于提高产物收率，减少后续分离提取压力。
(3)由于所采用的三种酶最适ph比较接近，且在较宽的ph范围内可以保持较好的活性，因此反应只需调节一次初始ph，后续无需调节ph，不会引入过多的酸、碱，可以减轻后续脱盐纯化工序的负担，有利于简化工艺。
(4)反应过程中只需在糖化后进行一次升温灭酶，反应过程中无需多次大幅度升温、降温，有利于减少蒸汽和冷凝水的消耗，降低成本。
附图说明
图1本发明一种实施方式的工艺路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，所述实施例仅是范例性的，不对本发明构成任何限制。
实验材料：玉米淀粉为山东西王集团公司产品；木薯淀粉为广西南宁市武鸣隆禧淀粉厂产品。大肠杆菌表达宿主bl21(de3)和pet20b为novagen公司产品。常用化学试剂为国药集团化学试剂有限公司产品。本发明中高温淀粉普鲁兰酶、耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶均为采用基因工程方法构建重组菌株，并诱导表达获得。
实施例1
(1)高温淀粉普鲁兰酶的制备
从atcc购买获得thermococcuslitoralisdsm5473，以该菌的基因组为模版，pcr获得序列如ncbi数据库中geneid为16549640的序列，连接到表达载体pet20b中，再转化宿主菌株bl21(de3)；将重组菌株接种到tb培养基(甘油5g/l，蛋白胨12g/l，酵母膏24g/l，磷酸氢二钾12.54g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，卡那霉素30μg/ml)培养，并采用iptg诱导表达，离心后获得重组高温淀粉普鲁兰酶。酶活力测定显示发酵上清液中普鲁兰酶酶活力为36.8u/ml，α-淀粉酶酶活力为103.6u/ml。
所述淀粉普鲁兰酶具有普鲁兰酶和α-淀粉酶双重活性，可以同时水解淀粉底物中的α-1，6糖苷键和α-1，4糖苷键。酶活力测定需要分别测定普鲁兰酶和α-淀粉酶活性。使用过程中为方便计算加酶量，所述加酶量为α-淀粉酶活力。
普鲁兰酶酶活测定方法：
取1.9ml的底物(0.5％普鲁兰多糖溶解于50mmph5.5的磷酸缓冲液中)，95℃水浴预热10min。加入0.1ml稀释的酶液样品，反应10min，加入3mldns，沸水浴7min。向上述反应体系中加入10ml的蒸馏水，混匀，在540nm下测量其吸光值。酶活单位定义为，在上述条件下，每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量定义为一个活力单位。
α-淀粉酶酶活测定方法：
准确吸取2.5ml1％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph6.0磷酸缓冲溶液)，于95℃水浴预热5min，加入100μl酶液，反应5min，立即取出1ml反应液，置于含有0.5ml0.1mol/l盐酸溶液中终止酶解反应，加入5ml稀碘液，摇匀。以稀碘液为空白，在660nm波长下测吸光度(a)。根据吸光度计算测试酶液的活力。α-淀粉酶酶活单位定义：在上述条件下，1分钟液化1mg可溶性淀粉所需的酶量定义为一个酶活力单位。
(2)耐热β-淀粉酶的制备
耐热β-淀粉酶来源于thermoanaerobacteriumthermosulfurigenesatcc33743，耐热β-淀粉酶编码基因在ncbi数据库中的aaa23204.1。菌株基因组dna从atcc购买，同样采用pcr方法获得目的基因片段并连接到表达载体pet20b中，再转化宿主菌株bl21(de3)；将重组菌株接种到tb培养基培养，并采用iptg诱导表达，离心后获得重组耐热β-淀粉酶。酶活力测定显示发酵上清液中β-淀粉酶酶活力为208.1u/ml。
β-淀粉酶样品酶活力测定：
吸取0.9ml1％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph5.5磷酸盐缓冲溶液)，于70℃水浴预热5min；然后加入100μl酶液，反应10min后，立即加入0.8mldns溶液。沸水浴中煮沸5min。上述反应体系加适量蒸馏水并定容至13ml；混匀后用1cm比色皿在540nm波长下测吸光度(a)。根据吸光度求得测试酶液的浓度。酶活力单位定义：在上述条件下条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成1μmol麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(u)。
(3)耐热麦芽糖淀粉酶的制备
耐热麦芽糖淀粉酶thermotoganeapolitanala10，耐热麦芽糖淀粉酶蛋白在ncbi数据库中的登录号为la10_rs03670。根据大肠杆菌密码子偏好性优化编码基因序列，并通过人工合成获得目的基因片段并连接到表达载体pet29b中，再转化宿主菌株bl21(de3)；将重组菌株接种到tb培养基培养，并采用iptg诱导表达，离心后获得重组耐热麦芽糖淀粉酶。酶活力测定显示发酵上清液中麦芽糖淀粉酶酶活力为118.0u/ml。
酶活力测定方法：
取2ml的0.5％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph5.5磷酸盐缓冲液)于试管中，置于65℃水浴锅中预热10min。加入0.1ml酶液，准确计时10min，加入3mldns振荡均匀，放入冰水中终止反应，沸水浴煮沸7min，加入蒸馏水并定容至15ml，混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。酶活力单位定义：上述条件下，每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量作为一个活力单位。
实施例2
称取500克玉米淀粉，加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30％的淀粉乳，加入0.2％的氯化钙，调节淀粉乳的ph值至5.5，然后加入高温淀粉普鲁兰酶，该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加5u(以α-淀粉酶活性计)，充分搅拌混合均匀，逐步升温至95℃，控制搅拌转速为100转/分钟，液化80分钟，测定液化体系的de值为8.1。
将淀粉液化液体系降温至70℃，并向其中加入耐热β－淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶，加入量为每克纯淀粉分别加30u和40u，控制搅拌转速为150转/分钟，继续反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时，将反应液加热迅速升温至100℃，保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，搅拌均匀，过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分，结果显示体系中麦芽糖含量达到86.5％，浓度为256.8克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80％、麦芽糖含量为86％以上的麦芽糖糖浆。
实施例3
称取500克木薯淀粉，加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30％的淀粉乳，加入0.1％的氯化钙，调节淀粉乳的ph值至5.6，然后加入高温淀粉普鲁兰酶，该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加5u(以α-淀粉酶活性计)，充分搅拌混合均匀，逐步升温至100℃，控制搅拌转速为100转/分钟，液化80分钟，测定液化体系的de值为9.0。
将淀粉液化液体系降温至70℃，并向其中加入耐热β－淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶，加入量为每克纯淀粉分别加60u和30u，控制搅拌转速为150转/分钟，继续反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时，将反应液加热迅速升温至100℃，保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，搅拌均匀，过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分，结果显示体系中麦芽糖含量达到89.3％，浓度为265.1克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80％、麦芽糖含量为89％以上的麦芽糖糖浆。
实施例4
称取500克玉米淀粉，加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30％的淀粉乳，加入0.2％的氯化钙，调节淀粉乳的ph值至5.3，然后加入高温淀粉普鲁兰酶，该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加3u(以α-淀粉酶活性计)，充分搅拌混合均匀，逐步升温至100℃，控制搅拌转速为100转/分钟，液化80分钟，测定液化体系的de值为9.6。
将淀粉液化液体系降温至75℃，并向其中加入耐热β－淀粉酶，加入量为每克纯淀粉加50u，控制搅拌转速为150转/分钟，继续反应18小时。再将糖化液体系降温至65℃，按照每克纯淀粉加入20u的耐热麦芽糖淀粉酶进行添加，继续控制搅拌转速为150转/分钟，反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时，将反应液加热迅速升温至100℃，保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，搅拌均匀，过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分，结果显示体系中麦芽糖含量达到91％，浓度为270.1克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80％、麦芽糖含量为91％的麦芽糖糖浆。
实施例5
称取500克木薯淀粉，加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为40％的淀粉乳，加入0.2％的氯化钙，调节淀粉乳的ph值至5.5，然后加入高温淀粉普鲁兰酶，该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加6u(以α-淀粉酶活性计)，充分搅拌混合均匀，逐步升温至100℃，控制搅拌转速为100转/分钟，液化90分钟，测定液化体系的de值为10。
将淀粉液化液体系降温至75℃，并向其中加入耐热β－淀粉酶，加入量为每克纯淀粉加60u，控制搅拌转速为150转/分钟，继续反应20小时。再将糖化液体系降温至65℃，按照每克纯淀粉加入40u的耐热麦芽糖淀粉酶进行添加，继续控制搅拌转速为150转/分钟，反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时，将反应液加热迅速升温至100℃，保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，搅拌均匀，过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分，结果显示体系中麦芽糖含量达到92.3％，浓度为274.0克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80％、麦芽糖含量为92％以上的麦芽糖糖浆。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。