一种活性氧响应性高分子载体及其制备方法与流程

本发明属于医用高分子材料领域，特别涉及一种活性氧响应性高分子载体及其制备方法。

背景技术：

炎症、纤维化、肿瘤及老化等疾病往往伴有氧化应激，表现为局部活性氧物质(ros)，主要包括oh·、h2o2等的浓度上调。具有活性氧响应性的智能高分子载体系统有望用于携带治疗或显像物质，实现针对疾病病灶的定位控制释放，因而受到广泛关注。发展中的氧化响应性载体主要有聚丙硫醚(pps)、酮缩硫醇聚合物、含硒高分子及含芳基硼酸或硼酸酯高分子等。但现有的氧化响应体系制备及综合性能还有待优化提升，尚不能满足实际的应用需要。

槲皮素等含邻二酚结构的多酚类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，但大多存在水溶性不佳，稳定性较差等不足，且缺乏体内靶向性。虽然可通过制备水溶性衍生物及物理包裹等制剂技术在一定程度上有所改进，但效果并不十分理想。

制备含芳基硼酸的水溶性高分子作为载体，一方面硼酸易于与含邻二酚结构的多酚偶联形成多酚硼酸酯高分子前药，另一方面形成的芳基硼酸酯具有氧化响应性，可在体内氧化应激环境中分解释放多酚，实现抗氧化、抗肿瘤活性物质的定位靶向释放，在抗炎、抗肿瘤治疗等领域具有重要的应用前景。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种活性氧响应性高分子载体的制备方法，是在含氨基的水溶性高分子上引入具有氧化响应性的芳基硼酸基团。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的活性氧响应性高分子载体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种活性氧响应性高分子载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯溶于有机溶剂，依次加入有机碱、对硝基氯甲酸苯酯，4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与对硝基氯甲酸苯酯的摩尔比为1.0:1.1，搅拌反应后制得4-硝基苯基4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)苄基酯(nbc)；

该步骤发生如下反应：

(2)将含氨基的水溶性高分子(polymer-nh2)溶于水中，加入有机溶剂，搅拌形成油水混合相(油相与水相的体积比为1:5)，为溶液a；将nbc溶于有机溶剂得到溶液b，依次在溶液b中加入有机碱或无机碱、溶液a，含氨基的水溶性高分子(polymer-nh2)与nbc的摩尔比为1.0:(0.2-10.0)，搅拌反应，再调节反应体系ph值至6.5-7.0，得到改性高分子粗品；

该步骤发生如下反应：

(3)将得到的改性高分子粗品经纯化，冻干，得到活性氧响应性高分子载体纯品。

步骤(1)和(2)所述的有机溶剂优选n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃或1,4二氧六环；

步骤(1)和(2)所述的有机碱优选四甲基胍、三乙胺、三乙稀二胺、n-甲基吗啉、n,n-二异丙基乙胺、四甲基乙二胺或乙二胺。

步骤(2)所述含氨基的水溶性高分子(polymer-nh2)，包括但不仅限于：壳聚糖及其衍生物、氨基聚乙二醇、聚赖氨酸、明胶、多肽；

步骤(2)所述的无机碱优选nahco3、khco3、k2co3、na2co3、naoh或koh；

步骤(2)所述搅拌反应的时间优选1～24h；

步骤(2)所述搅拌反应的温度优选20～60℃；

步骤(2)所述的ph值调节剂优选盐酸、乙酸。

步骤(3)所述的纯化优选透析或超滤。

由上述方法制得的活性氧响应性高分子载体具有如式i所示的结构：

上述的活性氧响应性高分子载体可以负载含邻二酚结构的多酚类化合物，用于抗炎、抗肿瘤治疗；

所述的含邻二酚结构的多酚类化合物优选槲皮素、芦丁。

本发明中，活性氧响应性高分子载体的氧化响应性原理是：含有氨基的聚合物，键合苯硼酸以后，在过氧化氢等活性氧作用下，碳(c)、硼(b)、氧(o)重排形成硼酸酯；在体系中h2o分子的存在下，氧孤对电子进攻硼酸酯，硼酸酯断裂，形成硼酸；同时电子通过苯环转移至碳酸酯，致使其断裂解离，形成co2离去，同时得到polymer-nh2；而苯环最终形成4-羟甲基苯酚。

而活性氧响应性高分子载体对多酚类活性物质(以槲皮素为例)的负载及释放的原理是：水溶性高分子(polymer-nh2)键合nbc之后，其含有的硼酸基可与槲皮素的邻二酚键合，从而形成负载槲皮素的大分子前药；而在活性氧环境下，侧链基团会发生氧化裂解，使体系裂解，释放槲皮素，同时生成polymer-nh2、硼酸、4-羟甲基苯酚和co2。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

与现有技术相比，本发明的活性氧响应性高分子载体制备方法简单，通过对常规含氨基的水溶性高分子改性即可获得，得到的芳基硼酸修饰高分子载体易于化学偶联含邻二酚结构的多酚类活性物质，改善其水溶性和稳定性，并可实现其氧化响应性释放，在抗炎、抗肿瘤治疗等医用领域具有重要的应用前景。

附图说明

图1是4-硝基苯基4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)苄基酯(nbc)的分子式及¹hnmr谱图，氘代试剂(dmso-d6)。

图2是芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc)的分子式及¹h-nmr谱图，氘代试剂(d2o)。

图3是h2o2处理gc-nbc前后的¹hnmr谱图对比，氘代试剂(d2o)。

图4是偶联负载槲皮素的芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc-que)的分子式及¹hnmr谱图，氘代试剂(dmso-d6)。

图5是不同环境下gc-nbc-que的que释放曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

4-硝基苯基4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)苄基酯(nbc)的制备，包括以下步骤：

量取20ml的无水1,4二氧六环，溶解0.234g(1.0mmol)的4-羟甲基苯硼酸酯在100ml圆底烧瓶中，油浴40℃，搅拌，加入0.30ml的四甲基胍，30分钟后，加入0.222g(1.1mmol)的对硝基苯基氯甲酸酯，反应4h，薄层色谱(tlc)检测至反应完毕。加入20ml乙酸乙酯，停止反应，搅拌10分钟，先用饱和nahco3水洗，接着0.5m盐酸洗除体系中多余的nahco3。有机相加入无水mgso4干燥，旋干，柱层析，得纯品，其¹h-nmr谱图如图1所示。

实施例2

芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc)的制备，包括以下步骤：

称取0.205g(约1mmol)的羟乙基壳聚糖(gly-cs)，称取0.21g(约2mmol)的na2co3于100ml的圆底烧瓶中，加入15ml的去离子水，搅拌均匀，再加入3ml的dmso，作为溶液a；称取0.200g(约0.50mmol)的化合物nbc原料，加入15ml的dmso溶液，作为溶液b。

溶液b滴加溶液a中，室温搅拌，tlc监测反应，过夜反应(时间10h)，反应结束之后，体系呈碱性，用0.5m的盐酸溶液调节ph＝6.5，室温搅拌30分钟，去离子水透析3天，冷冻干燥得到产物(gc-nbc)，其¹h-nmr谱图如图2所示。

实施例3

芳基硼酸修饰peg-nh2的制备，包括以下步骤：

称取0.176g(约1mmol)的o,o-二(3-氨基丙基)聚乙二醇(peg-nh2)，称取0.21g(约2mmol)的na2co3于100ml的圆底烧瓶中，加入15ml的去离子水，搅拌均匀，再加入3ml的thf，作为溶液a；称取0.6g(约1.0mmol)的化合物nbc原料，加入15ml的thf溶液，作为溶液b。

溶液b滴加溶液a中，室温搅拌，tlc监测反应，过夜反应(时间10h)，反应结束之后，体系呈碱性，用0.5m的盐酸溶液调节ph＝6.5，室温搅拌30分钟，去离子水透析3天，冷冻干燥，得到产物peg-nbc。

实施例4

芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc)的氧化响应性。

称取7.5mg的gc-nbc溶于600μl的d2o中，充分均匀，移入核磁管中，加入10μl3％的h2o2溶液，室温孵育12h，测试¹h-nmr，h2o2处理前后的¹hnmr谱图对比如图3所示。

如图3，未被氧化裂解的聚合物苯环特征峰，化学位移出现在7.4ppm和7.6ppm的位置，经过氧化裂解以后，体系中散落多种碎片，化合物并不单一，π-π堆积，会造成苯环特征峰向高场移动，图3氧化后化学位移出现在7.2ppm和7.0ppm附近，证实gc-nbc发生氧化响应性分解。

实施例5

芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc)偶联负载槲皮素(que)及释放行为

称取60mg的gc-nbc冻干产物，加入100ml的圆底烧瓶中，加入25ml的去离子水和5ml的四氢呋喃(thf)，搅拌使其完全溶解；称取20mg槲皮素溶于10ml的四氢呋喃(thf)中，缓慢滴加到gc-nbc溶液中，室温搅拌过夜，得到澄清透明的黄色溶液；用2％的甲醇溶液透析2天，冷冻干燥，得到偶联负载que的gc-nbc-que产物，其¹h-nmr谱图如图4所示。

分别在磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph值7.4)和含1mmh2o2的pbs(ph值7.4)中进行负载que的芳基硼酸修饰羟乙基壳聚糖(gc-nbc-que)的药物释放实验(37℃恒温，转速100rpm)，采用高效液相色谱(hplc)测定que浓度随时间的变化，得到释放曲线如图5所示。其中，在模拟正常机体环境条件下，que累计释放量约10％，较稳定；而在氧化条件下后，que释放量迅速增大至约87％，表明gc-nbc-que表现出显著的氧化响应性释放行为。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。