一种超多孔水凝胶的制备方法与流程

本发明涉及一种新型超多孔水凝胶的制备方法，具体涉及基于水溶性大分子蛋白制备超多孔水凝胶。

背景技术：

水凝胶是一种富含水分的具有三维网状结构的高分子聚合物，可应用于组织工程填充及药物缓释等领域。常规制备的水凝胶的机械性能、溶胀速率等普遍较差而限制了其应用范围，因此具有好的机械强度和高的溶胀速率的（超）多孔水凝胶的设计和制备已成为近年来的研究热点。

多孔水凝胶具有明显的孔道结构，可以通过毛细作用吸水而快速实现溶胀平衡。由于多孔结构的引入往往直接导致凝胶力学性能的明显下降。此外，目前多数多孔水凝胶普遍存在多方面的缺陷，如孔隙率不高或孔的贯通性较差；或孔道结构不稳定，容易失水闭合；或生物相容性欠佳；或降解速率太快；或功能较为单一等等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以水溶性蛋白质大分子为核心原料制备具有高的溶胀速率，稳定的孔道结构，优异的生物相容性，以及良好的孔隙率和良好的机械性能的新型超多孔水凝胶，以克服目前多孔水凝胶的主要缺陷，有望用于组织填充及修复材料、药物载体及分离纯化介质等领域。

本发明实现过程如下：

一种超多孔水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）将水溶性大分子蛋白质溶于超纯水中，加入交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷，以及无机盐水溶液混合均匀；

（2）调节溶液ph至2～5.5，40-80℃进行交联反应得含盐多孔水凝胶；

（3）对交联后凝胶进行高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤，除去无机盐和残留的交联剂，最后经过干燥获得超多孔水凝胶；

上述水溶性大分子蛋白质为类人胶原蛋白（lhc）、人血清白蛋白（hsa）、牛血清白蛋白（bsa）、兔精子自身抗原（rsa）、前列腺特异性抗原(psa)、乳清蛋白（wp），蛋白质水溶液的浓度为50-400mg/ml；

上述步骤（1）中，所述的无机盐为钠盐、铵盐、钾盐，如氯化钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硫酸钾、氯化钾，无机盐的浓度为10-350mg/ml，加入无机盐的体积与蛋白溶液的体积比为20:1~10:5；

上述步骤（1）中，交联剂的浓度均为0.1-5.0%(wt)，体积为蛋白溶液体积的1-20%，优选交联剂的浓度均为0.5-2.0%(wt)，体积为蛋白溶液体积的5-10%。

上述步骤（2）中，交联时间为0.5-5h，优选1-3h。

上述高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤具体为：第一次将样品在110-121℃下保持时间5-30min，优选保持时间10-20min，然后超纯水浸泡洗涤2-5天；第二次将样品在110-121℃保持1-3h，优选保持时间1.5-2.5h，然后超纯水浸泡洗涤1-3天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g。

样品干燥采取烘干、真空冷冻干燥或超临界二氧化碳干燥。

本发明超多孔水凝胶的形成机理：蛋白质分子含有丰富的羧基和氨基，为分子间交联提供了两种好的功能基团。β-二亚胺锌配合物分子内螯合锌的空轨道可与蛋白分子中的氨基形成配位键，实现蛋白质分子的分子间交联。β-二亚胺锌配合物对环氧烷基具有不对称开环催化功能，可加速1,2,7,8-二环氧辛烷的分子两端环氧烷基开环并与蛋白分子中的羧基形成共价键，实现蛋白质分子的分子间交联。故通过β-二亚胺锌配合物对1,2,7,8-二环氧辛烷的开环催化，及两种交联剂对蛋白质的分子间不同基团间的双交联作用，有效实现和强化了水溶性蛋白分子间的交联。无机盐的加入，有效地破坏了水溶性蛋白质的分子外水化膜，促进了交联剂与蛋白质分子之间的交联反应，此外适量无机盐还兼扮演了成孔剂作用，进一步优化了水凝胶的成孔效果。

本发明具有以下优点：

（1）所用原料大分子蛋白均具有良好的生物学相容性，绿色无毒，在生物医药领域已经得到广泛应用；

（2）采用双功效交联剂不仅实现了多功能基团的共交联，交联剂间还有相互促进功效；无机盐的使用进一步强化了分子交联反应，并促进多孔的形成；

（3）采用高温加热处理后，能有效增强凝胶的机械强度，并可使凝胶从容器壁上完整脱落而无粘连；

（4）制备的多孔水凝胶力学性能优异，较一般水凝胶偏硬，但抗压缩弹性极好，最大压缩应变和压缩应力分别可达70%和5.5mpa；

（5）凝胶溶胀速率高，最快5-10s基本达到溶胀平衡；凝胶孔隙率高（75-90%），孔道结构稳定。

附图说明

图1为β-二亚胺锌配合物的分子结构图；

图2为实施例1所制备的多孔水凝胶湿样品（a）和烘干前后对比（b）的照片；

图3为实施例1所制备的多孔水凝胶的sem图；

图4为实施例1中制备的多孔凝胶的抗压缩能力测试结果；

图5为实施例1中制备的多孔水凝胶置于自制的注射器内，进行样品中水分挤出-吸收实验过程演示图；

图6为实施例1中制备的多孔水凝胶烘干后的吸水溶胀能力测试结果；

图7为实施例1中制备的凝胶经不同方法处理后交联剂的残留量对比图；

图8为实施例7中交联剂为β-二亚胺锌配合物时所制备的水凝胶的sem图；

图9为实施例7中交联剂为1,2,7,8-二环氧辛烷时所制备的水凝胶的sem图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

交联剂β-二亚胺锌配合物依据文献（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成获得，其分子式如图1所示。

实施例1多孔水凝胶的制备

（1）将水溶性蛋白hlc溶于10ml蒸馏水得到浓度为100mg/ml的hlc溶液，加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的kcl2ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为4.5；

（2）将（1）中的混合溶液分装于模具中，在50℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持20min获得凝胶初品；

（3）初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持2h，然后再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

（4）烘干步骤（3）中的湿凝胶，获得超多孔水凝胶样品，以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即可得到无菌超多孔水凝胶。

对本实例中制备的超多孔凝胶进行物化性质表征，图2为多孔湿凝胶样品照片（a为水凝胶干燥前的外观图，b为水凝胶烘干前后外观对比图）；图3为制备的多孔水凝胶的扫描电镜（sem）图。从照片中可以看到干燥前的凝胶外观上呈不透明乳白色，表面质地较为光滑；烘干后，凝胶颜色无明显变化，体积少许收缩。sem图显示其微观形貌为多孔结构，孔壁为球形颗粒相互粘连而成，孔径一般在几十纳米到几个微米不等，孔结构较为均匀且致密贯通。经检测该水凝胶孔隙率可达86.4%，且生物相容性良好。

实施例2多孔水凝胶的制备

（1）将水溶性蛋白hsa溶于10ml蒸馏水得到浓度为100mg/ml的hsa溶液，加入浓度均为2%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的na2so4溶液2ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为3.5；

（2）将步骤（1）中的混合溶液分装于模具中，在50℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于110℃保持20min获得凝胶初品；

（3）步骤（2）次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

（4）冷冻干燥步骤（3）中的湿凝胶，获得超多孔水凝胶样品，以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即可得到无菌超孔水凝胶。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得的多孔水溶胶理化性能相似。

实施例3多孔水凝胶的制备

（1）将水溶性蛋白bsa溶于10ml蒸馏水得到浓度为100mg/ml的bsa溶液，加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各2ml，再加入10mg/ml的nah2po4溶液2ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为4；

（2）将步骤（1）中的混合溶液分装于模具中，在50℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持20min获得凝胶初品；

（3）步骤（2）中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持2h，然后再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

（4）超临界二氧化碳法干燥步骤三中的湿凝胶，获得超多孔水凝胶样品，以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即可得到无菌超孔水凝胶。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得的多孔水溶胶理化性能相似。

实施例4多孔水凝胶的循环压缩测试实验

将实例1的步骤（3）中制备得到的湿凝胶进行循环压缩测试。如图4所示，在单循环测试中，发现其最大压缩应变可达70～75%，对应压缩应力可达约5.5mpa，表明材料力学性能十分优异，远胜一般水凝胶（约几十到几百kpa）。而且在70%的应变下，压缩10个循环后，样品仍能保持其完整性。从压缩曲线和回复曲线还可以看出，样品弹性良好，可以恢复原状。在多循环压缩试验中可以看到，压缩曲线和回复曲线重合较好，最大应力也无明显衰减，这表明样品不仅弹性好，耐压缩能力也较强，而且还具有压缩后回复原形的能力。

实施例5多孔水凝胶的吸水溶胀实验

（1）将实例1的步骤（3）中制备得到的湿凝胶放于自制的注射器中，进行水分挤出-吸收实验。图5展示的是凝胶置于自制的注射器内，进行样品中水分挤出-吸收实验过程演示。其中，a为将样品放入注射器中未施加任何外力，b-d展示的是施加外力后，样品中水分被挤出的过程，e-h表示的是样品中的水分已经无法挤出后，将样品从注射器中拿出，进行水分吸收的过程；

如图5所示，湿胶中的水分在施加外力的情况下可快速被挤出，而且将水分挤出后的失水凝胶再次置于挤出的水中后，凝胶可快速将挤出的水吸收并恢复其原状；

（2）将实例1的步骤三中制备得到的湿凝胶自然烘干，对其吸水溶胀性能进行考察。图5展示的是制备的凝胶烘干后其吸水溶胀能力。如图6所示，干凝胶可以将与之体积相近的水分，在5～10s左右全部吸收，体积也迅速随之变大。这表明凝胶的吸水溶胀能力很强。

本实例中吸水溶胀实验说明本发明制备的水凝胶不同于传统的水凝胶，是一种新型的多孔水凝胶。该水凝胶中的水分可被挤出，并且在吸水后可恢复其原状，而传统凝胶中的水分是结合水，不能自由流动，因此无法挤出。此外，自然烘干一般常使普通水凝胶因为失水严重收缩而失去原有良好的孔隙，本方法制备的水凝胶虽烘干也显示体积微微缩小，但是烘干后的水凝胶性能与湿水凝胶相似，具有良好的吸水溶胀性和可复原性能。

实施例6多孔水凝胶的交联剂去除实验

本实例是考察水凝胶中的残留交联剂的去除方法对比实验。

将实例1的步骤（2）中制备得到的初品湿凝胶为研究对象，采用单纯水洗法、水-乙醇交叉浸洗法、水洗-高压蒸汽法，水洗-高压蒸汽-水洗法等方法分别进行处理，研究经不同方法处理后，最终凝胶中交联剂的残留情况。其中，水洗或者乙醇洗的过程中，样品均浸泡于溶剂中，并且每隔6h换一次浸泡液；高压蒸汽法是将凝胶样品放置于121℃高压蒸汽灭菌锅中保持2h。

图7为实施案例1中制备的凝胶经不同浸洗方法处理后交联剂残留量。其中1为水洗5天残留量；2为水洗5天后再用无水乙醇洗2天残留量；3为水洗5天后再用高压蒸汽灭菌处理20min残留量；4为水洗5天后再用高压蒸汽灭菌处理60min残留量；5为水洗5天后再用高压蒸汽灭菌处理120min后，再水洗2天后的交联剂残留量；6为水洗7天的残留量。从柱状图中可以看出，总体上浸洗或高压蒸汽处理时间越长，交联剂的残留量越低；单纯水洗效果比不上水-乙醇交叉浸洗和水洗-高压蒸汽结合处理，其中以水洗-高压蒸汽处理效果最好。单纯水洗7天仍达不到国家安全标准要求，相比之下水洗5天后经高压蒸汽灭菌处理2h后再水洗2天即可以达到安全标准要求。交联剂的残留量去除至满足国家安全标准为2μg/g。

此外，不过水洗仍然具有不可替代的作用，因为凝胶中所含的盐分是水溶性的，必须通过水洗的方法才能除去。

实施例7多孔水凝胶的不同交联方式对比实验

（1）重复实施实例1实验过程，仅将反应中的两种交联剂改为一种交联剂β-二亚胺锌配合物，所制备的水凝胶的微观结构如图8所示。该水凝胶质地柔软，通过力学性质检测发现其压缩应力约550kpa，不再具备实施实例1中水凝胶所具备的良好的吸水溶胀性和可复原性能；

（2）重复实施实例1实验过程，仅将反应中的两种交联剂改为一种交联剂1,2,7,8-二环氧辛烷，获得的水凝胶如图9所示。同样，该水凝胶抗压强度较小，

其压缩应力约为750kpa，其吸水溶胀性能和可复原性能大大减弱。

上述实验表明，仅改变复合交联剂为其中的任意一种，所得到的水凝胶不再具有原来的优异机械力学特性。说明实施实例1中的交联实验方案具有好的创新性。