一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物及检测方法与流程

技术领域：
:本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于对不同樟树进行基因分型的snp引物及检测方法。
背景技术：
：樟树，别名香樟、芳樟、小叶樟等，隶属于樟科(lauraceae)樟属(cinnamomum)，在我国具有重要的经济价值，且广泛分布于我国亚热带地区，如海南、江西、湖南、浙江、重庆、等省市区。樟树具有树姿雄伟、四季浓绿、灭菌驱虫和挥发香气等特点，发挥着重要的材用、药用、香料、油用和生态环境建设等价值。樟树因其可以提取天然樟脑和芳香油，而这两者分别是重要的工业和医药原料，因此针对樟树的研究也颇受关注。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的dna序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。snp是一种最常见的遗传变异，具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、富有代表性、检测快速、易于实现自动化分析等特点。另外，由于snp自身具有密度高、分布广等特点，又加上先进的高通量snp检测系统的研制，snp标记将对未来生命科学领域产生重大的影响。hrm(high-resolutionmelting)分析技术是应用于snp检测分析的一项新技术，是由犹他大学和idaho科技公司合作开发的，该技术主要利用不同双链dna分子的片段长短、gc含量和分布不同，在加热变性时形成随温度变化的特定熔解曲线，进而利用饱和荧光染料和高精密度采集荧光信号仪器进行检测。基于hrm技术的原理，hrm检测不需要使用针对目标位点的特异性等位引物或探针，只需一对引物就可以对等位基因的变化进行识别。其灵敏度高、特异性强、简单快速、高效、经济，还具有高通量、闭管操作等优点，非常经济有效。因此，hrm大大简化了snp检测的操作步骤，并减少了分析时间，目前该项技术主要应用于突变扫描、snp的发现、基因分型、小片段的插入和删除、甲基化研究及混合样品的突变发现等方面。樟树生化类型准确划分，是高效开发有着重要的经济价值的樟树精油的基础，快速、准确的基因分型对化学类型的区分至关重要，目前关于此类研究，鲜见报道。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于对不同樟树进行基因分型的snp引物，为29株樟树建立指纹图谱。本发明的另一目的是提供一种上述snp引物的应用。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种用于对不同樟树进行基因分型的snp引物，由8对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：引物名称上游引物(5’to3’)下游引物(5’to3’)snp1aagctgcaaacccattcgagtgacctgcttggcatacgcsnp2catggctctaatgggcaatctgcgggctctcgtagaaasnp3cgccaggcagggtaagccaacagacagggcactaaagsnp4gcctataagggataagagaatacattttacaaagagattccacatsnp5caaccctctaatcagtgatgagggtggatcttatcttgagatsnp6tgagttgaaactttatgaggccatctacttcagtcccaccttsnp7ctcaaaaggacaagagtgagatgtttgacttcagcagagactsnp8aagcttcttcttcgatatagactacgaaagaagaaagagaagaac应用所述的snp引物构建樟树的指纹图谱，获得29个樟树对应的指纹图谱，如下表所示：所述的应用snp引物构建樟树的指纹图谱，采用7对snp引物，名称分别为：snp1，snp2，snp3，snp4，snp5，snp6，snp7。所述snp引物在不同樟树基因组dna的snp位点基因分型的检测中的应用。所述的应用，包括以下步骤：1)待测樟树样品dna的提取；2)使用相同反应体系及程序对樟树样本基因组dna进行pcr扩增，得到待测樟树的pcr产物；3)对pcr扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析确定snp位点的基因型；4)sanger测序再次验证snp基因型。步骤2)中，pcr反应体系20μl：30ng模板dna；10μl1xforget-me-nottmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o补齐。步骤2)中，pcr反应程序：预变性95℃2min；95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。步骤3)中，hrm的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。本发明通过实验证明：本发明的引物共8对，其中7对snp引物组合可以用于构建樟树的指纹图谱。本发明利用樟树数据开发的snp引物能够对不同樟树进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的7对snp引物构建了不同樟树的指纹图谱，验证的8个snp位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于snp的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：1)结果高度准确、可靠：利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，检测结果提供了高度的可靠性。2)操作快速简便：进行不同个体间的样本检测，一般整个试验过程只需几小时即可完成，与传统的测序技术相比，省时省力，可以实现高通量。3)无需基于凝胶电泳进行，减少试剂和耗材的使用，更佳环保，同时节省人力和减少人工误差。4)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板dna30ng即可准确进行鉴定。5)效率高：相比于ssr指纹图谱，虽然snp单位点的理论信息量不如ssr丰富，但是snp在全基因组范围内密度远高于ssr，借助hrm分型可以迅速获取指纹信息，综合效率上高于ssr指纹。附图说明图1是以引物snp7为例，根据不同樟树个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为cc，橘色为tt，蓝色为tc；图2是以引物snp2为例，pcr扩增产物的sanger测序结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例11、初步筛选对樟树进行基因分型的snp引物1)转录组数据的获得从野外获得多份樟树样本，提取次生代谢产物，测定其生化类型，从其中选取芳樟型f-1、f-2以及龙脑型l-1、l-2樟树叶片样品，放于-80℃超低温冰箱保存备用。根据制造商的说明书使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)进行樟树总rna提取。提取后，在1.0％的琼脂糖凝胶上检测rna的降解和污染。使用分光光度计(implen，westlakevillage，ca，usa)检查rna纯度。使用2.0flurometer(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)中的rnaassaykit测定rna的浓度。使用anagilentbioanalyzer2100system(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)中的rnanano6000assaykit评估rna的完整性。每个样品的总量为3μgrna用作rna样品制备的输入材料。按照制造商的说明书，使用ultratmrnalibraryprepkit(neb，usa)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。简而言之，使用poly-toligo附着磁珠从总rna纯化mrna。在nebnextfirststrandsynthesisreactionbuffer(5x)中，在高温下使用二价阳离子打断成短片段。以mrna为模板，使用六碱基随机引物和m-mulv逆转录酶(rnaseh-)合成第一链cdna。随后使用dna聚合酶i和rna酶h进行第二链cdna合成。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余突出部分转化为平端。在dna片段的3'末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的nebnext适配子以进行杂交。为了选择长度优先为150-200bp的cdna片段，文库片段用ampurexp系统(beckmancoulter，beverly，usa)纯化。然后将3μluserenzyme(neb，usa)与大小选择的接头连接的cdna在37℃下使用15min，然后在95℃下pcr5min。进而使用phusion高保真dna聚合酶，通用pcr引物和index(x)引物进行pcr。最后，将pcr产物纯化(ampurexp系统)，并在agilentbioanalyzer2100系统上评估文库质量。根据制造商的说明书，使用truseqpeclusterkitv3-cbot-hs(illumia)在cbot群集生成系统上进行索引编码样本的聚类。集群生成后，在illuminahiseqtm2500高通量平台上对其准备进行测序，并生成配对末端读取。fastq格式的原始数据(rawreads)首先通过内部perl脚本进行处理。在此步骤中，通过删除包含适配器的读取，包含poly-n的读取以及从原始数据读取的低质量来获取干净的数据(cleanreads)。同时，计算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重复水平。所有的下游分析都是以高质量的cleandata为基础。然后，将所有库/样本中的左文件(read1files)合并到一个大的left.fq文件中，将正确的文件(read2files)合并到一个大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用trinity完成转录组组装，默认情况下min_kmer_cov设置为2，其他所有参数设置为默认值。选择具有最长长度的每个基因的转录本作为unigenes。1.snp的识别本实施例通过使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18来排序，删除重复读取，对齐合并获得每个样本的bam结果。采用gatk2v3.2软件用于执行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk标准方法过滤(参数为clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后仅保留距离大于5的snp。2)snp引物的设计根据转录组unigene序列，挑选60个snp位点，利用oligo6.0软件设计60对snp引物。设计的方法如下：首先确定snp位点所在序列的位置，然后在snp位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-23bp；tm59℃-61℃，尽可能保证上下游引物的tm值一致，一般不超过2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr产物大小为150-400bp；其它还应注意引物3'端不应出现超过3个的连续g或c；引物不能形成发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之间尽量不能有连续4个以上的碱基互补，尤其避免3'端的互补。3)ctab法提取樟树基因组dna：打开水浴锅，调节至65℃预热备用。将50-100mg的樟树叶片在液氮中充分研磨成粉末，并转移只1.5ml的离心管中。向离心管中加入4mlctab，80μl120％巯基乙醇。放入65℃水浴锅中预热30min后取出，置于冰水中冷却至室温。加入4ml氯仿(异戊二醇：氯仿＝1:24)，12000rpm，离心4min。取上清至一干净离心管中，加入3ml氯仿，抽提第二次，12000rpm，离心4min。将上清分装在四个离心管中(1个2ml离心管装备用液、3个1.5ml离心管)，每个1.5ml离心管分装500μl。向每个离心管中加入2倍体积(1000μl)冰无水乙醇，再加50μl醋酸钠，放置在-20℃冰箱，2h后取出，若无絮状物，12000rpm离心5min。准备一个新的1.5ml离心管，加入1000μl70％乙醇。将三个离心管中的絮状物全部用枪头挑出，加入新的离心管中。涡旋，12000rpm离心2min。再取一新的离心管，第二次用70％乙醇漂洗、涡旋、离心。小心的吸出离心管中的酒精，注意不要吸到絮状物。加热干燥，使酒精全部蒸发。向离心管中加入200μlddh2o，溶解1h，置于-20℃冰箱保存备用。4)snp引物的有效性验证以樟树基因组dna为模板，采用待检测snp引物进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；反应结束后，取3μl的pcr产物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对pcr扩增产物进行检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体的，该待检测引物即为有效引物。10μl的la-taq酶pcr反应体系如下：5μl的premixtaq(lataqversion2.0plusdye)；0.2μmol/lsnp引物；40ngdna模版；剩余ddh2o补齐。pcr的反应程序为：预变性94℃3min；35循环的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃1min，最终4℃保存。结果表明：挑选的60对snp引物中，有45对引物能够扩增出条带，但其中的35对引物扩增出的条带不单一，可能存在多个snp位点，暂不考虑进行hrm分析，另外10对引物(见下表)扩增条带单一且产物大小与预期一致，暂为有效snp引物，用于hrm分析。1对引物对应1个目标snp位点，1对引物的扩增产物为含有对应snp位点的dna片段。2、再次筛选对樟树进行基因分型的snp引物1)pcr扩增及高分辨率溶解曲线(hrm)分析进行基因分型以33个樟树个体(其中4个樟树个体为转录组测序的樟树，芳樟型f-1、f-2和龙脑型l-1、l-2；其余29棵樟树来源见表1)的基因组dna为模板，分别采用上述10对snp有效性引物进行pcr扩增，得到每个个体的10个引物对应的pcr扩增产物，每个引物对的pcr扩增产物为含有某个snp位点的dna片段。pcr反应体系20μl：30ng模板dna；1xforget-me-nottmqpcrmastermix10μl；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o补齐。采用viia7中的highresolutionmelt进行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反应程序：预变性95℃2min；45个循环的95℃变性5s，60℃复性30s；第二步，hrm的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。结果表明：有8对引物能够进行基因分型，其余2对引物因有杂峰(snp9，snp10)，所以被淘汰。采用appliedhrmsoftwarev2.0进行溶解曲线分析。8对引物对应的snp位点得到hrm验证，其中，高分辨率溶解曲线部分结果如下：图1为以snp引物7为例，根据不同樟树个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为cc，橘色为tt，蓝色为tc。8对snp引物对樟树个体的基因分型结果如表2所示：表1樟树材料来源樟树样品号采集地樟树样品号采集地y-1江西崇义y-16江西崇义y-2江西安福y-17湖南郴州y-3江西龙南y-18四川宜宾y-4江西分宜y-19四川达州y-5江西资溪y-20四川成都y-6江西广丰y-21四川广元y-7江西广昌y-22湖北黄冈y-8江西瑞昌y-23湖北襄阳y-9江西瑞金y-24江苏南通y-10江西信丰y-25江苏连云港y-11江西乐安y-26江苏徐州y-12江西赣县y-27江苏盐城y-13江西丰城y-29福建龙岩y-14湖南长沙y-29福建厦门y-15湖南长沙表2樟树样本分型结果其中，7对snp引物组合(snp1-7)构建樟树指纹代码，获得29个香樟对应的指纹图谱，如表3所示。表329个香樟对应的指纹图谱样品号snp指纹代码样品号snp指纹代码y-15221543y-163515254y-23515553y-171511245y-33551545y-185211243y-45511553y-193521435y-53255543y-201521253y-63521243y-215213253y-75555253y-221115253y-83551543y-235155253y-93525243y-245511253y-105525254y-255555543y-111221233y-265255253y-125211233y-271523243y-133215243y-281551545y-141215233y-291551535y-151515243注：纯合型aa，gg，tt，cc对应1，2，3，4，突变型对应5。实施例2高分辨率溶解曲线分析结果的验证通过pcr产物测序对高分辨率溶解曲线分析得到的基因分型的结果进行验证。具体步骤如下：挑选snp的不同分型的pcr产物20μl，进行sanger测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与hrm基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。经过sanger测序验证本发明的引物通过hmr分析对银杏进行基因分型的结果是可靠的。测序结果如下：通过测序获得基因峰图，以snp2引物为例(图2的a，b)，其扩增片段的snp位点为g/a突变，图2a基因型为a/t，图2b基因型为a/a，均符合hrm基因分型结果，认为snp为阳性snp位点且hrm基因分型结果准确。当前第1页12