本发明涉及一株拮抗水稻白叶枯病菌的苍白空气芽孢杆菌。
背景技术：
微生物能够产生大量的活性物质，并且具备一些化学合成物无法达到的优点，如活性高、作用广、安全性好等特点。同时，微生物资源具有生长迅速、容易培养和易生产放大等特点。因此，微生物已经成为研究先导化合物的一个重要的研究对象。在微生物中，芽孢杆菌的研究和应用较广，能产生具有抗逆性的内生孢子的杆状细菌。据报道，大部分芽孢杆菌属能够产生活性物质，并且种类多、活性强。目前，芽孢杆菌中已经纯化、鉴定到接近八百种生物活性物质，主要分为核糖体合成和非核糖体合成两大类。已报道的抗菌物质主要包括抗菌蛋白、多肽、细菌素、细胞壁降解酶类，脂肽和挥发性物质。因此，芽孢杆菌属在农业、工业、医学等方面都具备非常重要的利用潜力和研发作用。水稻白叶枯病是一直以来影响水稻产量的主要病害之一，该病害分布范围广泛，危害严重。目前，水稻白叶枯病已危及世界各个水稻生产地,其中南亚和东南亚的水稻受到的危害最为严重。水稻一旦感染该病菌将导致20%-40%的产量损失。作为水稻病害主要防治措施的化学防治，虽简单高效，但也存在很多弊端，化学农药的大量使用不仅对人体健康造成很大危害，还严重的污染环境，长期使用还会导致病原菌产生耐药性。大多数的微生物代谢产物中因含有丰富的抗菌物质而被应用于植物病害防治，生物防治具有成本低，污染小，效果持久稳定。因此，从自然界中寻找到抗水稻白叶枯病的菌株已是植物保护方面的研究的热点之一。本发明利用高温筛选的方法，旨在得到高效稳定的抑菌剂，为水稻白叶枯病的防治提供有力的依据。
技术实现要素：
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一株拮抗水稻白叶枯病菌的苍白空气芽孢杆菌jh-7，该抗菌活性成分中含有抑制白叶枯病菌成分为生物防治此菌引起的水稻病害提供很好的途径。本发明的第二个目的是提供苍白空气芽孢杆菌jh-7的代谢粗提物。本发明的第三个目的是提供苍白空气芽孢杆菌jh-7的代谢粗提物的应用。本发明的第四个目的是提供含苍白空气芽孢杆菌jh-7的生物农药。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一株拮抗水稻白叶枯病菌的苍白空气芽孢杆菌（aeribacilluspallidus）jh-7，该菌株的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.14447，保藏日期为：2017年7月20日。
上述的苍白空气芽孢杆菌jh-7的培养方法，该方法的接种量为4~7%，起始ph为7.5~9.0。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
苍白空气芽孢杆菌jh-7的代谢粗提物，该代谢粗提物与环脯氨酸-酪氨酸的一阶红外光谱图如图5所示，利用omnic红外分析软件对两个一阶红外进行求导得到二阶谱图如图6所示；cd3od,600mhz氢谱图如图7、图8所示。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
苍白空气芽孢杆菌jh-7的代谢粗提物用于抑制白叶枯病菌的应用。
为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：一种生物农药，该生物农药包括上述所述的苍白空气芽孢杆菌（aeribacilluspallidus）jh-7和/或苍白空气芽孢杆菌jh-7的代谢粗提物。
本发明利用高温筛选的方法，旨在得到高效稳定的抑菌剂，为水稻白叶枯病的防治提供有力的依据。实验结果显示，高温筛选得到的一株苍白空气芽孢杆菌jh-7对水稻白叶枯病菌具有很好的抑制作用。为了提高菌株的生长量以便更好的研究其抗菌特性，本发明采用响应面优化法对jh-7的培养条件进行优化，从而获得适合该菌生长的最佳生长条件。
附图说明
图1jh-7菌体形态。
图2jh-7菌株的系统进化树。
图3jh-7代谢物对白叶枯菌的抑菌实验。
图4不同装液量对菌株jh-7生长的影响。
图5不同起始ph对jh-7生长的影响。
图6不同接种量对菌株jh-7生长的影响。
图7jh-7代谢物的红外光谱。
图8jh-7代谢物的二阶红外导数光谱。
图9jh-7代谢物的氢谱全图。
图10jh-7代谢物的氢谱低场区局部放大图。
具体实施方式
材料与方法
1.1供试细菌
供试生防菌：苍白空气芽孢杆菌（jh-7），自行分离于浙江师范大学校区土壤，于本实验室-80℃冰箱保存。
供试病原菌：水稻叶枯病菌(xanthomonascampestrispv.oryzae)为菲律宾6号小种（pr6)，本实验室提供，保存在-80℃冰箱。
培养基
lb培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，自然ph，121℃高压蒸汽灭菌20min)。
na培养基（胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖10g，牛肉膏3g，琼脂10g，蒸馏水1000ml，自然ph，121℃高压蒸汽灭菌20min)。
实验仪器与设备
红外光谱仪（nexus智能傅里叶，美国尼高力公司）；核磁共振波谱仪（nmrav600，瑞士布鲁克公司）。
实验方法
1.4.1滤纸片法
吸取0.2ml白叶枯菌液(a600=0.75)，均匀涂布到na培养基平板上；吸取5µl的jh-7乙酸乙酯粗提物浓度50mg/ml于滤纸片上，用无菌镊子夹取含药液的滤纸片贴在涂有菌液的平板培养基上；将平板置于28℃恒温培养箱培养24个小时后记录分析结果，用十字交叉法测量抑菌圈直径大小（含滤纸片直径5mm)，实验含三组并重复三次取平均值。
1.4.2试管二倍梯度稀释法
取已灭菌的试管若干，从1开始编号，向1号试管中加入10mlna培养基，向另外五支试管里加入5ml培养基，再向1号中加入0.02克jh-7乙酸乙酯萃取物，充分混匀；按照二倍稀释的方法，从1中吸取5ml液体于2号试管中，充分混匀，依次进行，第5号试管中取出的5ml液体弃去，6号试管为空白对照；向上述的6支试管中分别接入100µl的已稀释的白叶枯菌的菌液；28℃培养16小时，观察现象，记录澄清无菌生长的药液浓度即为最小抑菌浓度，测定所有试管中液体在600nm处的吸光度值。
1.4.3红外光谱法
将乙酸乙酯萃取得到的jh-7代谢粗提物放在真空干燥箱中50℃干燥至恒重，冷却到室温后备用；采用kbr压片制样，取样品10mg研磨成2µm以下的粉末后均匀分散到kbr中，用压片机制成薄片；开始测试，分别进行背景采集和样品信息采集，条件：4cm-1的分辨率，400-4000cm-1频率范围内，室温下扫描16次。
1.4.4单因素实验设计
影响jh-7菌株生长的因素有很多，在进行相应面实验设计之前我们选取三个对该菌生长影响相对较大的因素，分别为起始ph，接种量和装液量。
分别以不同的接种量按体积百分比1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%的接种比例，将jh-7菌液接种到500ml的lb液体培养基中，55℃摇床培养36小时后于波长600nm处测定不同条件下的吸光度值，选择合适的接种量。以1%的接种量接种jh-7到500mllb液体培养基中，实验前已经调节不同的ph(7.0，8.0，8.5，9.0），放于55度摇床培养36小时后测吸光度值a600，选择最适ph。以1%接种量接种jh-7菌液分别于100，200，300，400，500mllb培养基中，保证相同的ph，同样55℃摇床培养36小时后测不同变量下吸光度值a600，筛选出合适的装液量。以上所有实验均在1000ml的摇瓶中培养，实验均重复三次后取平均值。
1.4.5响应面实验设计
通过单因素实验，确定出合适的起始ph、接种量和装液量三个因素合适的取值范围，根据box-behnken中心组合实验设计原理，以起始ph，装液量和接种量为自变量，以菌株的吸光度值为响应值设计三因素三水平的中心组合实验拟合自变量与响应值之间的模型方程。
结果与分析
2.1菌株鉴定
2.1.1细菌的形态特征jh-7菌株在lb平板上培养12h，可形成单菌落，菌落为扁平圆形，菌落较大，颜色为乳白色，边缘规则，不透明，培养基上没有色素产生。菌体呈杆状（图1），大小为2~4nm，经革兰氏染色表明为革兰氏阴性菌，具有芽孢，一端膨大。th08菌株在lb中粘着力差，干燥，呈乳白的粉质样，用枪头挑起则粉碎，挑入液体培养基中沉于瓶底，摇床震荡时形成球状颗粒。
2.1.2jh-7菌株的生理生化特征从jh-7菌株的生理生化实验可以得出一下结论（表1）。jh-7能够在nacl浓度为1％~5％之间是生长，超过这个范围则不能生长；jh-7可以利用葡萄糖作为碳源，产生少量酸性物质，不生成气体；乙酰甲基甲醇实验为阴性反应，即jh-7菌株不能在生长过程中产生二乙酰；甲基红为阴性反应，即jh-7在生长过程中产生的酸比较少，培养结束后ph>5.4；吲哚实验为阴性反应，即jh-7菌株不能产生吲哚物质，没有色氨酸酶产生；柠檬酸盐实验为阴性反应，即jh-7不能使用柠檬酸盐作为碳源；硫化氢产生实验为阴性反应，即jh-7菌株不能分解含硫的氨基酸，不能产生硫化氢，属于硫化氢阴性菌株。
表1jh-7菌株的主要生理生化特征
注：＋表示阳性反应；－表示阴性反应
2.1.3jh-7与th08的分子生物学鉴定结果
利用菌中16srdna序列鉴定菌株的种属关系，首先利用通用引物扩增了jh-7的16srdna，扩增出片段约为1500bp，将其构入相应载体并转化至dh5α送至公司测序。测序完成后将测序结果提交至ncbi进行同源性分析，通过软件mega和clustalx分析，用邻接法（neibour-joining）创建jh-7的系统进化树（图2）。jh-7菌株鉴定为芽孢杆菌（bacillussp.）。
2.2抑菌实验结果的分析
图3为jh-7代谢粗提物对水稻白叶枯菌的抑菌实验结果，图左采用的滤纸片法，从图中可以看出，粗提物对白叶枯菌有明显的抑制作用，通过十字交叉法测量了平均抑菌圈直径达到17.80±0.35mm（含滤纸片直径，左图下方为甲醇对照）。右图显示的试管二倍稀释法的结果，菌体的浓度随着药液浓度的上涨呈现明显的下降的趋势，加入药液的浓度为1.00mg/ml时，试管里的液体是完全澄清的，三次结果均一致，通过分光光度计测的a600平均值为0.043，基本上没有菌生长，此时的浓度即为最小抑菌浓度。
2.3生长条件优化单因素实验结果与分析
分析图4，图5和图6，选择最高点做为响应面设计点，最终确定为ph，8.5，装液量300ml，接种量，6%。
2.4响应面实验设计结果与讨论
2.4.1响应面因素与水平的确定
通过以上单因素实验，确定了起始ph，接种量和装液量这三个因素的水平范围，应用box-behnken模型设计三因素三水平实验，实验因素与水平的设计如表2。
表2试验因素水平及编码
2.4.2box-behnken实验结果
实验共有17组，其中包括12个析因点，5个中心点的重复实验，以jh-7的a600为响应值。实验设计方案与结果见表3。
表3box-behnken实验设计与结果
2.4.3回归模型的建立与显著性的分析
利用designexpert8.0.6.1对表3的实验数据进行分析，模拟出jh-7的a600对起始ph，装液量和接种量的多元二次回归方程模型：
a600=0.64+0.0095a+0.008125b+0.078c+0.006ab+0.011ac+0.00325bc-0.022a2-0.008625b2+0.064c2
其中a为ph，b为装液量，c为接种量。
表4响应面实验结果的方差分析
响应面的二次模型方差分析如表4，p与f值表明该模型是高度显著的（p<0.0001)。r2为99.18%表明该响应模型可以解释总变异的99.18%，调整后的决定系数r2adj为98.12%，也足证明模型有很高的拟合度。表中模型失拟项p值为0.225大于0.05，模型的失拟项不显著，说明该模型较准确。
从方差分析可知，一次项a、b和c均显著，二次项a2和c2显著，b2不显著，交互项ab、ac和bc均不显著。方差分析表明影响菌株生长显著性因素是：接种量>初始ph>装液量。
优化结果与验证
为了得到最大的jh-7菌株生长量，采用了design-expert里的box-behnken模型进行响应面优化实验，得到了最佳组合条件：装液量381ml，接种量6.37%，ph为9，模型预测的响应值为0.789，结果比之前提高了22.52%。上述的显著性分析已证明该模型是显著的。为了确认模拟结果的准确性又做了验证实验，在优化的最佳条件下，55摄氏度培养36个小时测吸光度值，实验重复三次得到的平均值为0.803，相对误差1.77%，说明实验值与预测值拟合良好，结果是可信的，所以上述的优化模型适用于jh-7菌株的实验室摇瓶培养。
jh-7代谢产物组成成分的分析
图7显示的是化合物a（环（脯氨酸-酪氨酸））的和jh-7代谢粗提物b的一阶红外光谱图(图8)，两个图很相似。a中酚羟基的特征吸收峰是分别位于3434cm-1和3537cm-1处由于o-h伸缩振动产生的两个并列的强度较大的吸收峰和1251cm-1处c-o伸缩振动产生的一个峰形尖锐的吸收峰；a化合物中酰胺键的特征吸收峰是n-h伸缩振动产生的位于3208cm-1处的一个吸收带，1650cm-1处的一个很强的吸收峰是c=o伸缩振动产生的；1446cm-1,1477cm-1,1513cm-1和1594cm-1的四个吸收峰是芳环的骨架c=c伸缩振动峰，苯环上c-h伸缩振动峰在3151cm-1处。粗提物b的特征吸收峰也出现在基本相同的位置：3400cm-1（o-h伸缩振动），3218cm-1(酰胺键n-h)，3069cm-1(苯环c-h)，1641cm-1(酰胺键c=o)，1439cm-1和1514cm-1（苯环的骨架振动峰，一部分被覆盖），甲基，亚甲基和次亚甲基的对称和不对称的伸缩振动位于2851cm-1~2958cm-1频率范围内，通过以上的分析和对比可以大概的判断出jh-7代谢粗提物中很可能含有肽类物质。
利用omnic红外分析软件对两个一阶红外进行求导得到二阶谱图，如图8所示，其中a为环（脯氨酸-酪氨酸），b为jh-7的代谢粗提物。从图上可以得到以下信息，相同点是a和b在1650cm-1各有一个由于酰胺键上c=o变形振动产生的强吸收峰；a与b所不同的是：b中1550cm-1苯环上c=c变形震动峰和700cm-1苯环单取代峰的强度明显强于a，说明粗提物b中含有多个芳香族化合物。
图9是jh-7代谢物的氢谱图（cd3od,600mhz），图10是jh-7代谢物的氢谱全图低场区局部放大图。图中给出的信息：高场处主要是甲基，亚甲基和次亚甲基的氢的信号，化学位移在3.8-4.8ppm这个范围内出峰说明化合物中含有强吸电子的原子或基团；低场区给出的几组峰[δh：7.423（d，j=7.8hz)，7.309（m，j=7.2hz)，7.262（d，j=7.2hz)，7.211（q，j=3.6，7.8hz)，7.061（d，j=8.4hz),6.998（d，j=8.4hz)，6.726（d，j=8.4hz)]从耦合常数，氢的化学位移和各组峰的面积积分比进一步证实该粗提物中含有多个芳香族化合物。